改良哺乳動物表達載體及其用途的製作方法

2023-05-14 05:50:16 2

專利名稱：改良哺乳動物表達載體及其用途的製作方法
專利說明相關申請本申請要求於2008年1月15日提交的美國臨時申請序列號61/021282和於2008 年10月10日提交的美國臨時申請序列號61/104546的優先權，所述專利各自的內容在此 整體引入。
背景技術：
蛋白質包括生物製品的穩定生產可以通過用載體轉染宿主細胞來完成，所述載體 包括編碼蛋白質的DNA。載體在細胞系中的維持可以通過各種方法來達到，包括通過附加型 複製起點的染色體外複製。附加型載體包含當序列由複製起始因子結合時促進載體複製的 複製起點。附加型載體具有超過需要插入宿主基因組內的載體的幾個優點。例如，附加型 載體減少細胞中可能起因於載體整合到宿主基因組內的表型改變。附加型載體還可以使用 標準DNA提取方案從轉染細胞中分離出。由於治療蛋白質即生物製品的發展重要性，必須採取努力以最佳化蛋白質生產， 同時改善總體生產過程的效率。因此，效率中的改善必須針對載體的蛋白質生產能力加重。 需要更佳的表達系統，其提供有效的克隆選擇，以及高水平的所需蛋白質產物。減少生物制 品特別是抗體產生中涉及的克隆步驟數目是有利的，以改善時間需要且使成本降到最低。 提供供應足夠蛋白質生產用於小和大規模細胞培養也是有利的。本發明通過提供根據下文 詳述將是顯而易見的另外優點克服了常規載體的局限性。發明概述重組蛋白質可以通過哺乳動物細胞瞬時轉染而產生，特別是在藥學藥物開發過程 期間。各種宿主細胞可以用於表達蛋白質，包括哺乳動物細胞例如COS和人胚腎(HEK)細 胞。附加型載體依賴於複製起點和結合起點的反式作用的複製起始因子。複製起始因子例 如結合EB病毒的OriP的EB病毒核抗原(EBNA)，可以克隆到附加型載體內，或可替代地，可 以通過載體轉染到其內的宿主細胞表達。因此，附加型載體可以對特定細胞系特異，所述特 定細胞系表達激活通過複製起點的複製所需的反式作用因子。本發明消除了關於用於重組蛋白質表達的不同附加型載體主鏈的需要。本發明提 供了包括至少2個不同的附加型複製起點的附加型載體，這允許相同載體在不同細胞類型 中用於蛋白質表達。不同複製起點允許載體在不同類型的哺乳動物細胞中用於蛋白質表 達，所述哺乳動物細胞提供必需的反式作用複製因子且允許載體複製。通過消除再克隆目 的基因用於蛋白質生產的需要，本發明改善了效率且減少了與多重載體相關的成本，同時 維持蛋白質生產水平。本發明的一個令人驚訝的方面是給載體添加核苷酸即第二個複製起 點，不會負面影響載體在所需水平上生產蛋白質的能力。在一個優選實施方案中，本發明的載體包括抗體重或輕鏈恆定區。因此，抗體輕或 重鏈可變區可以分別克隆到載體內輕或重鏈恆定區的上遊，進一步改善表達系統的效率。 附加型載體促進表達SV40T Ag或EB病毒核抗原的哺乳動物細胞(例如C0S7或HEK293-6E 細胞)中的高蛋白質生產。本發明提供了關於蛋白質得率、生產效率和減少成本的最佳元件組合，和生物製品蛋白質例如抗體的生產，所述元件是用於特別是在醫藥工業中的蛋白質生產的所有重要 元件。本發明的其他特徵和優點在下文詳述和權利要求中描述。在一個方面，本發明提供了包括下述的表達載體a)衍生自EB病毒(EBV)的OriP 複製起點；(b)SV40複製起點；(c)用於插入目的基因的插入位點；和(d)編碼抗體重或輕 鏈恆定區的核酸序列，與插入位點可操作地連接。在一個實施方案中，目的基因是抗體重或 輕鏈可變區，例如鼠類、人源化、嵌合或人抗體重或輕鏈可變區。在一個具體實施方案中，抗 體重鏈可變區是選自阿達木單抗(adalimumab)、ABT_325和ABT-874的抗體的重鏈可變區。 在另一個具體實施方案中，抗體輕鏈可變區是選自阿達木單抗、ABT-325和ABT-874的抗體 的輕鏈可變區。抗體重鏈恆定區是例如鼠類、人源化、嵌合或人的，並且可以是選自Yl，z， a;yl,z, non-a ； γ 2, η+ ； γ 2, η-；和γ 4的抗體重鏈恆定區。Y 1，z，non-a抗體重鏈恆定 區可以進一步包括在重鏈恆定區的位置234處的丙氨酸突變。在另一個實施方案中，Yl， z，non-a抗體重鏈恆定區可以進一步包括在重鏈恆定區的位置235或237處的丙氨酸突變。在一個實施方案中，抗體輕鏈恆定區是人κ同種型或人λ同種型。在一個實施 方案中，抗體重鏈恆定區是鼠類Yl同種型或鼠類Y2a同種型。在另一個實施方案中，抗 體輕鏈恆定區是鼠類κ同種型。在一個實施方案中，抗體重鏈恆定區是Fc結構域。在一 個實施方案中，重或輕鏈抗體可變區對於插入位點是5'。在一個實施方案中，表達載體進一步包括與插入位點可操作地連接的啟動子，其 中啟動子是EF-I α啟動子或巨細胞病毒(CMV)啟動子。在一個實施方案中，表達載體進一步包括可選標記，例如氨苄青黴素抗性基因。在一個實施方案中，CMV啟動子包括與SEQ ID NO :1的核苷酸1-608至少80%、至 少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%等同的核酸序 列。在一個具體實施方案中，CMV啟動子包括SEQ ID NO 1的核苷酸1_608。在一個實施方案中，EF-I α啟動子是人的。在一個實施方案中，EF_1 α啟動子包 括與SEQ ID NO :2的核苷酸76-1267至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、 至少97%、至少98%或至少99%等同的核酸序列。在一個具體實施方案中，EF-I α啟動子 包括SEQ IDNO 2的核苷酸76-1267。在一個實施方案中，OriP複製起點包括與SEQ ID NO 1的核苷酸1795-3545至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%等同的
核酸序列。在一個實施方案中，SV40複製起點包括與SEQ ID NO 1的核苷酸5834-6140至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%等同的 核酸序列。在一個具體實施方案中，SV40複製起點包括SEQ ID NO :1的核苷酸5834-6140。本發明的示例性表達載體包括與選自下述的序列至少80 %、至少85 %、至少 90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%等同的核酸序列SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31和32。在一個具體實施方案中，表達載體包括選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31 和 32 的 核酸序列。本發明的表達載體還在

圖1、2和14-15中提供。本發明的另外載體在圖8_13中描述。在另一個方面，本發明提供了包括本發明的載體的哺乳動物宿主細胞。哺乳動物 宿主可以是COS細胞，例如COS 7細胞，或人胚腎(HEK)細胞，例如HEK-293細胞。在另一個方面，本發明提供了包括本發明的載體的試劑盒。在另一個方面，本發明提供了產生重組蛋白質的方法，其包括將本發明的表達載 體引入哺乳動物宿主細胞內，在合適條件下培養哺乳動物宿主細胞，以便表達蛋白質，並且 回收蛋白質。在另一個方面，本發明提供了包括編碼信號肽的核酸序列的表達載體。在一個實 施方案中，目的基因與編碼信號肽的核酸可操作地連接。附圖簡述當連同附圖一起閱讀時，本發明的下述和其他目的、特徵和優點以及本發明自身， 根據優選實施方案的下述描述將得到更全面理解，其中圖1顯示空pHyb-C載體的圖。特徵包括SV40真核生物複製起點、巨細胞病毒真 核生物表達啟動子(PCMV)、三聯前導序列(TPL)、剪接供體位點(SD)、腺病毒主要晚期增強 子元件(enh MLP)、剪接受體位點(SA)、關於目的基因的開放讀碼框(ORF)區隨後為多腺苷 酸信號(PA)、二重對稱元件(DS)、EB病毒衍生的真核生物複製起點(OriP)、複製區(FR)、 氨苄青黴素抗性標記(AmpR)和細菌複製起點(pMBlori)。圖2顯示空pHyb-E載體的圖。特徵包括SV-40真核生物複製起點、EF-Ia真核生 物啟動子、關於目的基因的開放讀碼框(ORF)區隨後為多腺苷酸信號(pA)、二重對稱元件 (DS)、EB病毒衍生的真核生物複製起點(OriP)、複製區(FR)、氨苄青黴素抗性標記(AmpR) 和細菌複製起點(pMBlori)。圖3顯示通過COS細胞產生的重組Fc融合蛋白滴度，所述COS細胞經由電穿孔用 pBOS、pTT3、pHybC 和 pHybE 載體轉染。圖4顯示通過HEK-293-6E細胞產生的重組Fc融合蛋白滴度，所述HEK-293-6E細 胞使用PEI用pBOS、pTT3、pHybC和pHybE載體轉染。圖5顯示通過HEK-293-6E產生的抗體滴度，所述HEK-293-6E使用PEI用構建為 表達IgG抗體的pBOS、pTT3、pHybC和pHybE載體轉染。圖6顯示通過COS產生的抗體滴度，所述COS經由電穿孔用構建為表達IgG抗體 的 pBOS、pTT3、pHybC 和 pHybE 載體轉染。圖7顯示通過COS產生的抗體滴度，所述COS經由電穿孔用表達IgG抗體的 pHyb-E-Swa I (vl)或 pHyb_E(v2)載體構建體轉染。圖 8 顯示 pHybC-mBR3-mCg2a 載體(也稱為 「pHybC-mBR3_Fc」)的圖。圖 9 顯示 pHybE-mBR3-mCg2a 載體(也稱為 「pHybE-mBR3_Fc」)的圖。圖 10 顯示 pHybC-E7-hCk 載體(也稱為 「pHybC_E7」)的圖。圖 11 顯示 pHybC-D2-hCgl，z，a 載體(也稱為 「pHybC_D2」)的圖。圖 12 顯示 pHybE-D2-hCgl，ζ, a 載體(也稱為 「pHybE_D2」)的圖。圖 13 顯示 pHybE-E7-hCk 載體(也稱為 「pHybE_E7」)的圖。圖14 顯示 pHybE-hCgl，ζ, aV2(也稱為 「pJP 182」)的圖。圖 15 顯示 pHybE-hCgl，ζ, non_aV2 (也稱為 「pJP183」)的圖。
圖 16 顯示 pHybE-hCgl，z，non_a，mut (234，235) V2 (也稱為 「pJP184」 )的圖。圖 17顯示pHybE-hCgl，z，non-a，mut(234，237)V2(也稱為「pJP185」)的圖。圖 18 顯示 pHybE_hCg2，n+V2(也稱為 「pJP186」)的圖。圖 19 顯示 pHybE-hCg2，n_V2(也稱為 「pJP187」)的圖。圖 20 顯示 pHybE_hCg4 V2 (也稱為 「pJP188」)的圖。圖 21 顯示 pHybE-mCgl V2 (也稱為 「pJP189，，)的圖。圖 22 顯示 pHybE_mCg2a V2 (也稱為 「pJP190，，)的圖。圖 23 顯示 pHybE-hCk V2 (也稱為 「pJP191 」)的圖。圖 24 顯示 pHybE-hCl V2 (也稱為 「pJP192」)的圖。圖 25 顯示 pHybE-mCk V2 (也稱為 「pJP193」)的圖。發明詳述I.定義為了本發明可以更容易理解，首先在本文中定義了特定術語。如本文所使用的，術語「核酸」或「核酸分子」意欲包括DNA、RNA、mRNA、cDNA、基因 組DNA及其類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優選是雙鏈DNA。核酸可以進行分離， 或整合到另一個核酸分子例如表達載體或真核生物宿主細胞的染色體內。「分離的」核酸分子是與核酸的天然來源中存在的其他核酸分子分離的核酸分子。 例如，就基因組DNA而言，術語「分離的」包括與基因組DNA與之天然結合的染色體分離的 核酸分子。優選地，「分離的」核酸分子不含在核酸由之衍生的生物體的基因組DNA中天然 側接核酸的序列(即，位於核酸的5'和3'末端處的序列)。此外，「分離的」核酸分子例 如cDNA分子可以基本上不含其他細胞材料，或當通過重組技術產生時不含培養基，或當化 學合成時基本上不含化學前體或其他化學製品。在本文中可互換使用的術語「重組載體」或「載體」指能夠轉運它已與之連接的另 一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是「質粒」，這指另外的DNA區段可以連接到其內的 環狀雙鏈DNA環。可替代地，載體可以是線性的。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外 的DNA區段可以連接到病毒基因組內。特定載體能夠在它們引入其內的宿主細胞內自主復 制(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附 加型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞內後整合到宿主細胞的基因組內，並且從而連同 宿主基因組一起複製。在一個優選實施方案中，本發明的載體是附加型哺乳動物載體。如 本文所使用的，術語「構建體」也指載體。特定載體能夠指導它們與之可操作地連接的基因的表達。「表達載體」或「重組表 達載體」是編碼在宿主細胞中表達的基因的核酸分子，並且此外，包含必需元件以控制基因 的表達。一般地，表達載體包括轉錄啟動子、目的基因和轉錄終止子。基因表達通常置於啟 動子的控制下，並且此種基因被說成與啟動子「可操作地連接」。類似地，如果調節元件調節 核心啟動子的活性，那麼調節元件和核心啟動子是可操作地連接的。在一個實施方案中，本 發明的表達載體包括超過一個複製起點，從而使載體不限制於一種細胞類型。如本文所使用的，術語「附加型複製載體」或「附加型載體」指一般且非常優選不 整合到宿主細胞的基因組內而是平行存在的載體。如本文所使用的，附加型複製載體在細 胞周期過程中複製，並且在這個複製過程中，依賴於在細胞分裂前和後存在的拷貝數，載體拷貝在統計上分布於所得到的細胞中。優選地，附加型複製載體可以在宿主細胞的核中發 生，並且優選在細胞周期的S期過程中複製。此外，附加型複製載體在細胞周期的S期過程 中在宿主細胞的核中複製至少一次，即一次或多次。在一個非常優選的實施方案中，附加型 複製載體在細胞周期的S期過程中在宿主細胞的核中複製一次。如本文所使用的，術語「複製序列的起點」或「複製起點」在本文中可互換使用，指 當存在於載體中時起始複製的序列。複製起點可以由複製起始因子或可替代地DNA解旋酶 識別。如本文所使用的，「重組」指通過其核酸材料例如DNA例如在微生物中在2個核酸 分子之間交換的過程。如本文所使用的，「同源重組」指通過其核酸材料經由序列同源性或 優選地序列同一性(例如高度序列同一性)的區域或區段在2個核酸分子之間交換的過 程。在示例性實施方案中，核酸材料位於生物體的染色體或附加體上。在另一個示例性實 施方案中，核酸材料染色體外定位於例如質粒上。重組可以在線性和/或環狀DNA分子之 間發生。如本文所使用的，術語「目的基因」指加入本發明的載體中的外源DNA序列。目的 基因例如可以包括編碼序列，其可以由內含子分隔或是編碼開放讀碼框的cDNA。如本文所 使用的，「目的基因」指加入本發明的載體中用於最終蛋白質表達的DNA序列。目的基因克 隆至其的載體區域在本文中稱為「插入位點」。優選地，目的基因包括使用本發明的載體表 達的抗體或融合蛋白的部分。例如，將抗體阿達木單抗的重鏈可變區即目的基因克隆到包 括重鏈恆定區的本發明的載體中。在本發明的一個實施方案中，載體包括抗體輕或重鏈恆定區，其對於用於目的基 因的插入位點是3'，並且與之可操作地連接。因此，在一個實施方案中，目的基因是抗體輕 或重鏈的可變區，其與本發明的載體中編碼的抗體輕或重鏈恆定區可操作地連接。當核苷酸序列置於與另一個核苷酸序列的功能關係內時是「可操作地連接的」。例 如，如果當表達時，序列在具有蛋白質或多肽的框內編碼信號肽，那麼編碼信號肽的DNA與 編碼蛋白質或多肽的DNA可操作地連接。同樣地，如果蛋白質或多肽的表達得到促進或增 強，那麼啟動子或增強子與編碼蛋白質或多肽的核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方 案中，可操作地連接的核苷酸序列是鄰接的(例如，在信號序列的情況下)。可替代地，可操 作地連接的核苷酸序列可以是非鄰接的(例如，在增強子的情況下)。在一個實施方案中， 編碼抗體輕或重鏈恆定區的核酸序列與目的基因例如重或輕鏈可變區可操作地連接。術語「啟動子」包括足以指導在真核生物細胞中的轉錄的任何核酸序列，包括 誘導型啟動子、阻遏型啟動子和組成型啟動子。一般地，啟動子包括這樣的元件，其足以 致使以細胞類型特異性、組織特異性或時間特異性方式，或通過外部信號或試劑誘導的 可控制的啟動子依賴性基因表達。此種元件可以位於特定基因的5'或3'或內含子序 列區中。通常，基因表達將是組成性的，儘管需要時可以在本發明中採用可調節啟動子。 基因表達還可以通過轉錄調節加以控制，使用熱、光或金屬，例如通過使用金屬硫蛋白 (metallothionine)基因或熱休克基因。「上遊」和「下遊」是用於描述核苷酸序列或載體中存在的2個元件之間的相對定 向的術語。與其他元件比較，其為另一個元件的「上遊」的元件位於與序列的5'末端更接 近的位置中(即如果分子是線性的，那麼更接近於具有與核糖或脫氧核糖主鏈的5'碳附著的磷酸基的分子末端)。當與其他元件比較時，元件位於與序列的3'末端更接近的位置 中時(即在線性分子中具有與核糖或脫氧核糖主鏈的3'碳附著的羥基的分子末端)，它被 說成是「下遊的」。如本文所使用的，術語「填充序列，，指優選在載體中的核酸序列，其側面為在5 『 和3'末端處的限制酶位點。填充序列位於載體中在用於編碼目的基因的核酸的插入位點 處。在克隆過程期間，使用合適的限制酶從載體中消化掉填充序列，並且將編碼目的基因的 核酸連接或同源重組到載體內在填充序列的先前位置處。優選地，填充序列足夠大以提供 在5'和3'限制酶位點之間的足夠距離，從而使得限制酶可以有效地切割載體。此外，優 選填充序列的長度不同於編碼目的基因的核酸大小，例如約300個鹼基對或更小或約400 個鹼基對或更大的填充序列長度可以用於編碼其為約350個鹼基對的目的基因的核酸。在 另一個實施方案中，填充序列大小為約lkb。如本文所使用的，術語「重組宿主細胞」(或簡單地「宿主細胞」)意指重組表達載 體已引入其內的細胞。應當理解此種術語不僅意指特定的實驗對象細胞還指此種細胞的後 代。因為由於突變或環境影響，特定修飾可以在後代中發生，所以此種後裔事實上可能不等 同於親本細胞，但仍包括在如本文所使用的術語「宿主細胞」的範圍內。如本文所提及的，術語「抗體」包括完整抗體及其任何抗原結合片段(即，「抗原結 合部分」)或單鏈。「抗體」指包括通過二硫鍵互聯的至少2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈的 糖蛋白，或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為Vh)和重鏈恆定區組成。 重鏈恆定區由3個結構域——CHUCH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為 Vl)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由1個結構域CL組成。V1^nt區可以進一步再分成 稱為互補決定區(CDR)的高變性區域，由稱為構架區(FR)的更保守區域點綴。每個Vh* Vl由3個⑶Rs和4個FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下述順序排列FR1、⑶Rl、FR2、 ⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。重和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合結構域。Vh和Vl組合 的6個CDRs構成抗原結合位點。在由2條H鏈和2條L鏈組成的抗體的情況下，抗體可以 包含2個等同的抗原結合位點，結合相同抗原的2個不同抗原結合位點，或結合不同抗原的 2個抗原結合位點。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫 系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一種組分(Clq)。如本文所使用的，術語抗體的「抗原結合部分」(或簡單地「抗體部分」)指抗體的 一個或多個片段，其保留與抗原(例如，IL-Ia、IL-I β)特異性結合的能力。抗體的抗原 結合功能可以通過全長抗體的片段來執行。在術語抗體的「抗原結合部分」內包括的結合 片段的例子包括(i)Fab片段，由\、VH、CL和CHl結構域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片 段，包括在鉸鏈區處由二硫橋連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)由Vh和Cm結構域組 成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的\和Vh結構域組成的Fv片段，(ν)由Vh或\結構域組 成的dAb片段(Ward等人(1989) Nature 341 544-546)；禾口 (vi)分離的互補決定區(CDR)。 此外，儘管Fv片段的2個結構域，VL和VH，由分離的基因編碼，但它們可以使用重組方法 通過合成接頭進行連接，所述合成接頭使得它們能夠製備為其中VL和VH區配對以形成單 價分子的單條蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(ScFv)；參見例如，Bird等人(1988) Science 242 423-426 ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883)。此類單鏈抗體 也意欲包括在術語抗體的「抗原結合部分」內。這些抗體片段使用本領域技術人員已知的常規技術來獲得，並且片段以與完整抗體相同的方式就效用進行篩選。在本發明的一個實 施方案中，抗體片段選自Fab、FcUFd'、單鏈Fv(ScFv)、ScFva和結構域抗體(dAb)。再進一步地，抗體或其抗原結合部分可以是更大免疫粘附分子的部分，由抗體或 抗體部分與一種或多種其他蛋白質或肽的共價或非共價結合形成。此種免疫粘附分子的 例子包括鏈黴親和素核心區的使用，以製備四聚scFv分子(Kipriyanov等人(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6 :93_101)，以及半胱氨酸殘基、標記肽和C末端多組氨酸標 記的使用，以製備二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov等人(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)。使用常規技術例如分別地完整抗體的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，可以由完 整抗體製備抗體部分例如Fc、Fab和F(ab' )2片段。此外，抗體、抗體部分和免疫粘附分子 可以使用標準重組DNA技術獲得。術語「結構域」指不依賴於蛋白質的其餘保留其三級結構的摺疊蛋白質結構。一 般地，結構域負責蛋白質的不連續功能性質，並且在許多情況下可以加入、去除或轉移給其 他蛋白質，而無蛋白質和/或結構域的其餘部分的功能喪失。單個抗體可變結構域意指包 括抗體可變結構域特徵性序列的摺疊多肽結構域。它因此包括完整抗體可變結構域和修飾 的可變結構域，例如其中一個或多個環已由並非抗體可變結構域特異性的序列替換，或抗 體可變結構域已截短或包括N或C末端延伸，以及保留全長結構域的至少部分結合活性和 特異性的可變結構域的摺疊片段。本發明的可變結構域可以進行組合以形成結構域組；例如，互補結構域可以進行 組合，例如VL結構域與VH結構域組合。非互補結構域也可以進行組合，例如VH結構域和 第二個VH結構域。結構域可以以許多方式進行組合，涉及通過共價或非共價方式的結構域 連接。「dAb」或「結構域抗體」指特異性結合抗原的單個抗體可變結構域(Vh或多肽。 在一個實施方案中，本發明的載體用於表達dAb。短語「重組抗體」指通過重組方法製備、表達、產生或分離的抗體，例如使用轉染 到宿主細胞內的重組表達載體表達的抗體，從重組、組合人抗體文庫中分離的抗體，從對於 人免疫球蛋白基因是轉基因的動物(例如小鼠)中分離的抗體(參見例如，Taylor等人 (1992) Nucl. Acids Res. 20 :6287_6295)，或通過任何其他方法製備、表達、產生或分離的抗 體，所述任何其他方法涉及特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)與其 他DNA序列的剪接。此種重組抗體的例子包括嵌合、CDR移植和人源化抗體。如本文所使用的，術語「人抗體」指具有相應於或衍生自人種系免疫球蛋白序列的 可變和恆定區的抗體，如例如由Kabat等人描述的(參見Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，U. S. Department of Health and Human SerVices，NIH
發明者C-M·謝 申請人:雅培製藥有限公司