幹細胞抗原-1在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用的製作方法

2023-05-13 23:34:16 2

幹細胞抗原-1在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種幹細胞抗原-1（Sca1）在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用，屬於基因的功能與應用領域。本發明以ApoE-/-小鼠及Sca1-/-ApoE-/-小鼠為實驗對象，通過高脂飲食誘導獲得動脈粥樣硬化模型，結果表明與ApoE-/-小鼠對比，Sca1基因缺陷顯著減少了主動脈的斑塊面積，增強了主動脈竇斑塊的穩定性，顯著減輕了炎症反應。這表明Sca1在動脈粥樣硬化中的功能主要體現為促進主動脈斑塊形成，特別是促進動脈粥樣硬化。針對Sca1的上述功能，Sca1可作為藥物靶標用於篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物，Sca1的抑制劑可用於製備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物。
【專利說明】幹細胞抗原-1在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用
[0001]

【技術領域】
[0002]本發明屬於基因的功能與應用領域，具體涉及一種幹細胞抗原-1 (Seal)在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用，具體是Scal在製備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。

【背景技術】
[0003]心腦血管疾病在許多發達國家中是主要致死性病因，在我國的發病率和致死率也逐年升高。心腦血管疾病的基礎是動脈粥樣硬化(Atheosclersisis, AS),動脈粥樣硬化可使動脈管壁增厚、變硬、管腔狹窄，導致很多心腦血管事件發生。而動脈粥樣硬化不穩定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠狀動脈急性狹窄和閉塞是導致急性冠狀動脈症候群(acute coronary syndrome, ACS)的重要原因。
[0004]動脈粥樣硬化是多種遺傳基因、危險因素及免疫機制共同參與的一種慢性炎症性疾病，局部和全身的炎症免疫反應在動脈粥樣硬化發生發展過程中起著重要作用，固有免疫和適應性免疫共同參與調節動脈粥樣硬化病變，病理上表現為大、中動脈多處斑塊形成，好發於血液分流、動脈彎曲及動脈分支等區域，其病變特徵是血中脂質在動脈內膜沉積，弓丨起內膜灶性纖維性增厚，病灶深部為由壞死組織和細胞外脂質池形成的粥樣物質。動脈粥樣硬化斑塊中存在著多種免疫細胞，其中以巨噬細胞和T細胞最為常見，此外還有少量的樹突狀細胞(Dentritic cell,DC)、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK cell)和肥大細胞(mast cell)等,偶有B淋巴細胞。
[0005]動脈粥樣硬化最早期肉眼可見的損傷是脂質條紋，主要由攝取了大量膽固醇的巨噬細胞源性泡沫細胞構成。血液循環中的單核細胞在動脈易損部位黏附到活性內皮細胞，啟動了脂質條紋的形成，黏附的單核細胞隨後受局部產生的化學趨附分子的吸引遷移到內膜下，並進一步分化為巨噬細胞。大量膽固醇脂在巨噬細胞內積聚，形成泡沫細胞，這是動脈粥樣硬化形成早期的特徵性病理生理過程。動脈粥樣硬化的發生是多因素共同作用的結果，目前已發現的動脈粥樣硬化危險性因素很多，但相關針對治療及控制效果均不理想，降脂和抗炎治療是目前最主要的治療措施。
[0006]幹細胞抗原-1 (stem cell antigen-1, Seal)是一種分子量為18kD大小的糖憐脂酸肌醇錨定蛋白(glycosyl phosphatidyl inositol-anchored protein, GP1-AP),最初是在激活的淋巴細胞發現其表達上調。Scal又名淋巴細胞激活蛋白6A (lymphocyteactivat1nprotein-6A,Ly-15A)或 T 細胞激活蛋白(T cell-activa-ting protein,TAP),由兩個種系特異性的等位基因Ly-6E.1與Ly-6A.2編碼，屬於Ly6基因家族成員【I】。已有研究表明，Scal可廣泛表達於多種組織器官的幹/祖細胞以及已分化細胞，可調控幹/祖細胞的分化與自我更新，並與淋巴細胞激活、腫瘤的發生發展、肌肉組織重塑以及心臟修復等病理生理過程密切相關【2】。Scal能調節脂肪因子的分泌，Scal敲除小鼠出現空腹血糖升高、糖耐量下降以及胰島素抵抗，表明Scal對脂肪功能有著更為細微的作用，說明Scal在代謝性疾病也發揮重要作用【3】。Tso等發現，在正常狀態下，能在大動脈內皮層中檢測到少量Scal或檢測不到其表達，但在LPS誘導的血管內皮損傷中，胸主動脈內皮層的Scal+細胞數量明顯增加，在ApoE敲除建立的動脈粥樣硬化模型中，小鼠的胸主動脈內皮層的Scal+細胞數量也明顯上升【4】。因此我們認為Scal在動脈粥樣硬化形成的特徵性病理生理過程中可能扮演著重要角色，但其在動脈粥樣硬化形成的特徵性病理生理過程中的生物學功能和可能的作用機制尚未闡明。
[0007]小鼠和基因工程小鼠資源是目前疾病機制研究、基因功能研究、藥物創製等領域最重要的動物模型之一，也是這些領域創新研究的必須條件。利用基因工程小鼠針對動脈粥樣硬化病理過程中的各個分子環節進行研究，對闡明動脈粥樣硬化發生發展過程中的分子機制，尋找動脈粥樣硬化治療的分子靶點具有重要的意義。
[0008]【參考文獻】
1.周恆，唐其柱，鄧偉。幹細胞抗原-1的生物學功能及其在疾病中的作用。生理科學進展2014年第45卷第2期。
[0009]2.Holmes C，Stanford WL.Concise review:stem cell antigen-1 !express1n，funct1n，and enigma.Stem Cells，2007，25:1339-1347.3.Staszkiewicz J， Gimble JM, Dietrich MA, et al.Diet—in—duced obesity instem cell antigen-1 KO mice.Stem Cells Dev,2012,21:249-259.4.Tso Cj Martinic G，Fan WHj et al.High-density lipoproteins enhanceprogenitor-mediated endothelium repair in mice.Arter1scler Thromb Vasc B1l.2006 May; 26(5): 1144-9。


【發明內容】

[0010]本發明的目的在於確定Seal的表達和動脈粥樣硬化的相互關係，提供一個用於預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的靶基因Scal的新用途。
[0011]本發明的目的通過下述技術方案實現:
本發明確定的Scal的表達和動脈粥樣硬化的關係如下:
1.Scal基因敲除顯著減少了動脈粥樣硬化的斑塊面積
本發明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與Scal/ApoE雙基因敲除(Scal+ApoE+)小鼠為實驗對象，分別通過低脂飼料和高脂飼料飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)。結果表明ApoE+和Scal+ApoE+小鼠通過低脂飼料飲食，主動脈樹有少量斑塊形成；通過高脂飼料飲食後，斑塊面積顯著增加，Scal+ApoE+小鼠的主動脈樹、主動脈竇以及頭臂幹的斑塊面積均顯著小於ApoE+小鼠(圖1-2)。
[0012]2.Scal基因敲除顯著增強主動脈竇斑塊的穩定性
本發明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與Scal/ApoE雙基因敲除(Scal+ApoE+)小鼠為實驗對象，通過高脂飼料飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)，對主動脈竇斑塊的穩定性進行研究。結果表明Scal基因敲除顯著減少主動脈竇斑塊內巨噬細胞的含量和壞死中心的面積，增加斑塊內平滑肌細胞的含量和膠原成分含量，增強了主動脈竇斑塊的穩定性(圖3)。
[0013]3.Seal基因敲除顯著減輕了炎症反應
本發明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與Scal/ApoE雙基因敲除(Scal+ApoE+)小鼠為實驗對象，通過高脂飼料飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)，對主動脈竇斑塊的炎症因子的表達進行研究。結果表明Scal基因敲除顯著降低了主動脈竇斑塊的ICAM-1和IL-6等促炎因子，升高了 IL-1O等抑炎因子的表達水平(圖4)。
[0014]由以上結果可知發生動脈粥樣硬化時，Scal基因缺陷減少了斑塊面積，增強主動脈竇斑塊的穩定性，顯著減輕了炎症反應。因此Scal具有促進動脈粥樣硬化發生發展的作用，為研究防治動脈粥樣硬化的新靶點和新策略提供了理論依據和臨床基礎。
[0015]因此，Scal基因可作為藥物靶點，構建Scal基因過表達的體外細胞模型或動物模型，用於篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物；Scal基因也可作為基因治療中的靶基因，設計並製備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物和/或生物學試劑，通過基因工程技術達到預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的目的。例如以Scal為靶基因，設計可幹擾Scal表達的雙鏈siRNA，通過化學方法合成以後，注射入人體通過RNA幹擾的方法使Scal基因沉默來治療動脈粥樣硬化；還可以設計並構建Scal的突變體，注射後進入細胞，競爭Scal原形的作用底物，從而抑制Scal的功能，起到治療目的；此外，還可以以Scal為靶點設計小分子化合物抑制劑，利用Scal基因過表達的體外細胞模型或動物模型，通過篩選，發現其中能夠特異性抑制Scal的分子，從而為動脈粥樣硬化的治療提供新的治療性分子。
[0016]針對Scal的上述功能,提供Scal作為藥物祀標在篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
[0017]針對Scal的上述功能，提供Scal的抑制劑在製備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
[0018]一種預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物，包含Scal的抑制劑。
[0019]所述的Scal的抑制劑優選為Scal基因的siRNA、Scal基因的RNA幹擾載體，Scal的抗體及其他能夠抑制Scal表達的抑制劑中的一種。
[0020]本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果:
1.本發明發現Scal基因的新功能，即Scal能夠促進動脈粥樣硬化的作用。
[0021]2.基於Scal促進動脈粥樣硬化的功能，為研製動脈粥樣硬化的藥物提供靶標。
[0022]3.Scal的抑制劑可用於製備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是ApoE+和Scal+ApoE+小鼠的主動脈樹油紅O染色及斑塊面積統計圖，結果表明Scal基因敲除顯著減少了主動脈樹的斑塊面積(NS:無顯著性差異)。
[0024]圖2是ApoE+和Scal+ApoE+小鼠主動脈竇及頭臂幹HE染色及斑塊面積統計柱狀圖，結果表明Scal基因敲除顯著減少了主動脈竇以及頭臂幹的斑塊面積(*:p<0.05 vsHFD ApoE+組)。
[0025]圖3是ApoE+和Scal+ApoE+小鼠的主動脈竇斑塊內壞死中心、膠原成分、巨噬細胞及平滑肌細胞含量染色及結果統計柱狀圖，結果表明Scal基因敲除顯著減少主動脈竇斑塊內巨噬細胞的含量和壞死中心的面積，增加斑塊內平滑肌細胞的含量和膠原成分含量(*:p < 0.05 vs HFD ApoE+ 組)。
[0026]圖4是ApoE+和Scal+ApoE+小鼠的主動脈竇斑塊內ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎症因子的表達水平免疫螢光染色及結果統計柱狀圖，結果表明Scal基因敲除顯著降低了主動脈竇斑塊的促炎因子ICAM-1和IL-6的表達水平，升高了抑炎因子IL-1O的表達水平(*:p < 0.05 vs HFD ApoE+ 組)。

【具體實施方式】
[0027]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0028]實驗用動物及飼養
實驗動物種屬，性別，周齡及來源=ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與Scal/ApoE雙基因敲除(Scal+ApoE+)小鼠，雄性，8周齡，體重19_25g。ApoE基因敲除小鼠(ApoE+，購自Jackson Laboratory,貨號 002052) ;Scal 1 ApoE 1 小鼠由 Scal 基因敲除小鼠和 ApoE 基因敲除小鼠雜交得到(Seal基因敲除小鼠由多倫多大學(University of Toront0.)Peter P.Liu友情贈送。Seal基因敲除小鼠製造參照以下文獻:Stanford WL.Haque S.AlexanderR.Liu X.Latour AM.Snodgrass HR.Roller BH.Flood PM.Altered proliferativeresponse by T lymphocytes of Ly-6A (Sca-1) null mice.J Exp Med.1997; 186:705 - 717.)。
[0029]實驗動物飼料配方:高脂飼料(HFD，購自北京華阜康生物科技有限公司，按AIN-76 A Western Diets配方，熱量百分比:蛋白質15.8%，脂肪40%，碳水化合物44.2%);低脂飼料(NC，購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B):熱量百分比:蛋白質20%，碳水化合物70%，脂肪10%。
[0030]動物飼養及環境條件:所有的實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級動物房(許可證號=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小時交替照明，溫度24±2°C，溼度40%-70%，小鼠自由飲水進食。
[0031]實施例1小鼠動脈粥樣硬化模型(AS)獲得
1.實驗動物分組:選用8周齡，體重19-25g，雄性，ApoE+小鼠和Scal+ApoE+小鼠，分別給予高脂飼料(Western Diets, HFD)和低脂飼料(Normal chow, NC)飼養,ApoE+ HFD組，ApoE+ NC 組，Scal+ApoE+ HFD 組，Scal+ApoE+ NC 組共 4 個組別，每組各 20 只。
[0032]2.動脈粥樣硬化模型通過高脂飼料誘導操作流程:
採用ApoE+小鼠和Scal+ApoE+小鼠，建立AS模型，進行表型相關分析，明確Scal基因對動脈粥樣硬化疾病發揮的作用。小鼠從8周齡開始，HFD組全程高脂飼料餵養28周處死並收集樣本，NC組全程低脂飼料餵養28周處死並收集樣本。
[0033]實施例2 AS模型小鼠斑塊面積測定 1.小鼠終末組織取材
小鼠餵養高脂或低脂飼料直至28周時，稱重，用3%戊巴比妥鈉，90mg/kg麻醉小鼠，用針頭固定於取材板，用紗布溼潤小鼠胸腹部皮膚，用眼科剪剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，把輸液器的針頭刺進左心室，用50mL注射器緩慢推注10-15mL PBS緩衝液，待右心耳流出液清亮，換上4%多聚甲醛繼續推注10-15mL。灌流結束後，清除胸腹腔臟器，僅保留心臟。將小鼠置於顯微鏡下，分離主動脈弓周圍筋膜、脂肪組織，剪下頭臂幹，放入裝有4%多聚甲醛的5mL EP管中，在升主動脈起始部剪下心臟，在胸主動脈中部剪斷，並在頸總和鎖骨下約3mm處剪斷，把主動脈弓放入上述EP管中。
[0034]2.主動脈樹斑塊面積測定
主動脈樹置於4%多聚甲醛中隔夜固定一純水漂洗30min — 60%異丙醇處理1min —油紅O染液(公司sigma,貨號00625)染色60min — 60%異丙醇漂洗Imin X 3次至背景乾淨一解剖鏡下去除殘餘外壁脂肪一將染色好的動脈平鋪於黑色解剖蠟板上，染色後用數位相機拍照，並使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟體進行斑塊面積定量測定(油紅O原液=0.5克油紅0+100毫升100%異丙醇，油紅O染液(工作液)=V (油紅O原液)/ V (H2O) =3/2)。
[0035]主動脈樹斑塊面積(％)=斑塊總面積/主動脈樹總面積*100%。
[0036]3.病理組織處理 3.1石蠟標本製備
4%多聚甲醛中隔夜固定後，將頭臂幹、主動脈弓用濾紙小心包好，以防從包埋框間隙中漏出。流水衝洗30min後放入脫水機,30%乙醇15min — 50%乙醇15min — 75%乙醇15min — 85% 乙醇 15min — 95% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min —二甲苯15min — 二甲苯15min —石臘30min —石臘30min。頭臂幹及主動脈弓脫水完成後,從脫水機拿出。頭臂幹呈Y直立於石蠟中，主動脈弓平躺於石蠟中。
[0037]3.2主動脈組織切片
使用切片機分別對主動脈竇和頭臂幹石蠟標本切片(切片厚度5 μ m)。
[0038]4.主動脈竇斑塊面積測定
蘇木素伊紅染色(HE染色):取主動脈竇石蠟白片65°C烘烤30分鐘一二甲苯5分鐘X 3次一100%乙醇I分鐘一95%乙醇I分鐘一70%乙醇I分鐘一純水漂洗(以玻片上不掛有水珠為標準)一甩盡載玻片上的水分，蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)浸染5分鐘一自來水漂洗(去除玻片上蘇木素的浮色)一1%鹽酸乙醇1-3秒一自來水漂洗(去除玻片上鹽酸乙醇)一Scott液(碳酸氫鈉0.35g,硫酸鎂2g,蒸懼水10mL) I分鐘一自來水浸洗(去除玻片上的Scott液)一甩盡在玻片上的水分，伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)染色10秒鐘一純水漂洗(去除玻片上伊紅的浮色)一70%乙醇一下一95%乙醇一下一100%乙醇30秒，3次一二甲苯2分鐘，3次一趁二甲苯未乾時封片(以切片無氣泡為原則)一通風櫥內吹乾，顯微鏡拍照。
[0039]5.頭臂幹斑塊面積測定
蘇木素伊紅染色(HE染色)，取頭臂幹石蠟白片，具體操作方法同實施例2.4。
[0040]HE染色圖片統計:直接用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟體圈主動脈竇和頭臂幹斑塊面積。
[0041]通過主動脈樹油紅O染色可大體評估整條血管上動脈粥樣硬化斑塊形成的多少、分布情況及斑塊面積的大小。圖1是小鼠AS模型後主動脈樹油紅O染色結果圖，頭臂幹和主動脈竇是動脈粥樣硬化斑塊最明顯的部位，ApoE+和Scal+ApoE+小鼠通過低脂飼料飲食，主動脈樹就有少量斑塊形成；通過高脂飲食後，斑塊含量顯著增加，Scal+ApoE+小鼠的主動脈樹斑塊面積顯著小於ApoE+小鼠。圖2是小鼠AS模型後主動脈竇和頭臂幹HE染色結果圖，結果表明經高脂飲食後Scal+ApoE+小鼠的主動脈竇和頭臂幹的斑塊面積顯著小於ApoE+小鼠。以上結果表明Scal基因敲除顯著降低了動脈粥樣硬化的斑塊面積。
[0042]實施例3 AS模型小鼠斑塊穩定性的測定
1.主動脈竇壞死中心的面積大小測定
主動脈竇石蠟白片蘇木素伊紅染色(HE染色)，方法同實施例2.4，選取含膽固醇結晶、無細胞核纖維結構的組織顯微鏡拍照。
[0043]壞死中心的面積測定:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟體圈壞死中心面積。
[0044]2.主動脈竇膠原成分含量測定:
天狼星紅(PSR)染色，主要步驟為:取主動脈竇石蠟白片55°C烘烤30min—二甲苯2min, 3次一100%酒精Imin — 95%酒精Imin — 70%酒精Imin —流水衝洗1min —雙蒸水Imin —質量分數0.2%磷鑰酸2min — 0.1%天狼猩紅苦味酸溶液滴於組織上,溼盒中染色90min —去除殘液一0.0lN鹽酸4s — 70%酒精I次一90%酒精I次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未乾立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。
[0045]膠原比例測定:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟體圈紅色膠原面積,膠原比例(％)=膠原面積/斑塊面積*100%。
[0046]3.主動脈竇巨噬細胞及平滑肌細胞標誌物的表達測定
免疫螢光染色檢測主動脈竇巨噬細胞標誌物⑶68、平滑肌細胞標誌物SMA (SmoothMuscle Actin)的表達。所需一抗信息:CD68 (MCA1957; 1:100; rat; AbD Serotec),SMA(ab5694; 1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 goat ant1-rat IgG(A11077 ；Invitrogen), Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG (A11008 ；Invitrogen)。
[0047]主要步驟為:
I)烤片:將主動脈竇石蠟白片置於烤箱中30min以上。
[0048]2)脫蠟:二甲苯 5minX3 次。
[0049]3)水合:100% 乙醇 5minX2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20浸洗 5minX2次。
[0050]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(高壓修復):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復工作液於修復盒中，放入高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合後的組織切片置於修復盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，開始計時5min後，取出修復盒；室溫放置20min，自然冷卻後取出切片。
[0051]5) ddH20 漂洗 5minX2 次，PBS 漂洗 5minX2 次。
[0052]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，於溼盒中37°C封閉60mino
[0053]7)棄封閉液,滴加適當比例稀釋的一抗，4°C孵育過夜,37°C復溫30min,棄去一抗，PBS 洗 1minX 3 次。
[0054]8)滴加二抗，於溼盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0055]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0056]10)螢光鏡下觀察，拍照。
[0057]突光定量統計:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟體對陽性細胞計數測定，CD68/SMA (%)=陽性細胞數/斑塊面積*100%。
[0058]巨噬細胞是斑塊內最重要的細胞成分，它主要有血液循環單核細胞進入內皮下後分化而來，單核/巨噬細胞可分泌多種粘附、趨化因子如細胞黏附分子(ICAM-1)、單核細胞趨化和激活因子(MCP-1)等，增進斑塊內細胞的進入，此外巨噬細胞還可分泌多種基質金屬蛋白酶(MMPs)，降低斑塊內膠原面積，從而破壞斑塊的穩定性；平滑肌細胞可分泌多種細胞基質，是動脈粥樣硬化斑塊內分泌膠原的細胞源，主要作用是修復被破壞的細胞基質成分從而起到保護作用；膠原成分是斑塊內最重要的細胞外基質，也是纖維帽的主要成分，具有抗血流衝擊防止斑塊破裂的作用，也是維護斑塊穩定性的重要評估指標。
[0059]圖3是ApoE+小鼠和Scal+ApoE+小鼠的主動脈竇斑塊內含物的分析結果圖。主動脈竇HE染色可見Scal+ApoE+小鼠的壞死中心面積明顯小於ApoE+小鼠；PSR染色結果表明高脂飲食後的模型，Scal+ApoE+組小鼠的膠原比例明顯高於ApoE+小鼠；免疫螢光發觀察巨噬細胞標誌物⑶68在Scal+ApoE+小鼠斑塊內的表達量則顯著低於ApoE+小鼠；平滑肌細胞標誌物SMA在Scal+ApoE+小鼠斑塊內的表達量明顯高於ApoE+小鼠。以上結果表明Scal基因敲除顯著減少主動脈竇斑塊內巨噬細胞的含量和壞死中心的面積，增加斑塊內平滑肌細胞的含量和膠原成分含量；Scal基因敲除可以增強主動脈竇斑塊的穩定性(圖3)。
[0060]實施例4 AS模型小鼠斑塊內炎症因子表達的測定
免疫螢光染色檢測主動脈竇ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎症因子的表達。所需一抗信息:ICAM-1CAF796 ； 1:100 ；goat ；R&D systems)、IL-6(AF-406_NA ； 1:100 ；goat ；R&D systems)、IL-1O (AF-217-NA ；1:100 ；goat ；R&D systems);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 donkeyant1-goat IgG (A11057 ;Invitrogen)。
[0061]主要步驟為:參見實施例3.3。
[0062]螢光定量統計:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟體對陽性細胞進行吸光度(1D)測定。
[0063]炎症反應是導致動脈粥樣硬化斑塊破裂的主要因素之一。炎性細胞分泌大量細胞因子如白細胞介素6 (IL-6)，白細胞介素10 (IL-1O)等可導致內皮細胞的活化、平滑肌細胞的增生、凋亡及粥樣病變的進展。受損的內皮細胞和單核/巨噬細胞分泌的粘附、趨化因子是介導炎症細胞向動脈粥樣硬化斑塊聚集的關鍵因子。通過免疫螢光染色觀察ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎症因子的表達變化，結果表明Scal基因敲除顯著降低了主動脈竇斑塊內促炎因子ICAM-1、IL-6的表達水平，升高了 IL-1O抑炎症因子的表達水平(圖4)。
[0064]上述實施例結果顯示，ApoE+小鼠及Scal+ApoE+小鼠在高脂飲食的誘導下發生動脈粥樣硬化，和ApoE+小鼠相比，Scal/ApoE雙基因敲除後小鼠的主動脈斑塊面積顯著減少，斑塊穩定性也增加，炎症反應明顯減輕。這些結果表明，Scal可顯著促進主動脈斑塊的形成和動脈粥樣硬化的發生發展。本發明證明了 Scal在動脈粥樣硬化模型中有著重要的惡化作用，其抑制劑可用於製備治療動脈粥樣硬化疾病的藥物。
[0065]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.Seal作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
2.Scal的抑制劑在製備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
3.一種預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物，其特徵在於:包含Scal的抑制劑。
4.根據權利要求2所述的應用或權利要求3所述的藥物，其特徵在於:所述的Scal的抑制劑為Scal基因的siRNA、Scal基因的RNA幹擾載體或Scal的抗體及其他能夠抑制Scal表達的抑制劑中的一種。
【文檔編號】A61P9/10GK104383560SQ201410520834
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年9月29日 優先權日:2014年9月29日
【發明者】李紅良, 王朗, 程文林, 趙光年 申請人:武漢大學