一種人γδT細胞對K562細胞株的殺傷活性檢測方法
2023-05-14 01:37:56
一種人γδT細胞對K562細胞株的殺傷活性檢測方法
【專利摘要】本發明屬於細胞免疫學【技術領域】，具體地說是一種人γδT細胞對K562細胞株的殺傷活性檢測方法。用於檢測製成的人γδT細胞。本發明包括以下步驟：製備人γδT細胞後取對數生長期的K562細胞株作為靶細胞，並調整細胞密度為1×105/ml、5×104/ml、2.5×104/ml，每孔取100μl鋪於96孔培養板中，培養24小時，取製備的人γδT細胞調密度為1×106/ml，加入96孔培養板中，使效靶比分別為10:1、20:1和40:1，各密度設3個復孔並分別設置空白對照計算殺傷活性。通過這樣的方法確保人γδT細胞的毒性。
【專利說明】一種人Y s T細胞對K562細胞株的殺傷活性檢測方法
[0001]本申請是2012年2月10日、申請號為201210030197.4的發明專利《一種簡單高效製備人Y δ T細胞的方法》的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明屬於細胞免疫學【技術領域】，具體地說是一種體外大量優勢擴增人外周血
Yδ T細胞的對Κ562細胞株的殺傷活性檢測方法。
【背景技術】
[0003]T淋巴細胞根據表達T細胞抗原受體(Τ cell rec印tor，TCR)的不同分為兩類:TCRa β T細胞和TCR Y δ T細胞，分別簡稱為α β T細胞和Y δΤ細胞。其中Y δ T細胞是介於特異性免疫與非特異性免疫之間的一種特殊類型的細胞，大多數為CD4和CD8分子雙陰性，少數可表達⑶8分子。Y δ T細胞主要分布於皮膚和黏膜組織，一般不超過T細胞總數的5%。Y δ T細胞具有特異性識別抗原而無MHC限制性，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調節等功能，是機體免疫監視的第一道防線。但由於Y ST細胞在外周血和腫瘤組織中含量不高，要獲得大量高細胞毒活性的Y ST細胞是十分困難的。雖然已有技術通過抗TCRy δ抗體或非肽磷酸類抗原獲得大量Y S T細胞，這無疑會增加其製備的成本。經廣泛查閱國內外專利文 獻和各種出版物，迄今為止，均未見有實用、高效、快速體外大量優勢擴增人外周血Y δT細胞的發明或報導。因此發明一種實用、高效、快速體外大量優勢擴增人外周血
YS T細胞的方法，對於Y δ T細胞免疫功能的研究，並用其提高病人免疫力、抵抗腫瘤和抗感染能力是非常重要的，對於攻克人類渴望解決的惡性腫瘤性疾病這一難題也是十分有價值的。在人外周血Y S T細胞製備後需要對其進行對Κ562細胞株的殺傷活性檢測，確保其效果。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是為了提供一種人Y δ T細胞對Κ562細胞株的殺傷活性檢測方法。用於檢測人Y S T細胞。
[0005]本發明所採用的技術方案是:一種製備人Y δΤ細胞的方法，包括如下步驟:培養結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)並製備結核桿菌耐熱性抗原(Mycobacterium tuberculosis heated antigen, Mtb-HAg),米集並分離外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),用 Mtb-HAg 激活，同時加入細胞因子rhIL-2和rhIL-21，置於37°C，5%C02和飽和溼度的培養箱內培養，72小時後進行半量更換培養液並補加等量的rhIL-2，以後根據細胞生長狀態每2~3天進行補加含有等量rhIL_2的培養液，以維持細胞密度為(0.5~2.0) X 106/ml。10~15天即可以獲得大量、高細胞毒活性的Y S T細胞。所述的Mtb培養基為蘇通式液體培養基或者Middlebrook7H9，Mtb經過高壓蒸汽處理，並經離心超濾製備成Mtb-HAg。所述的PBMCs是採用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心法分離收集，並用生理鹽水洗滌2次，低速離心後獲得。所述Mtb-HAg的終濃度為5~10μ g/ml，rhIL-2的終濃度為50~500IU/ml，rhIL_21的終濃度為5~20ng/ml ο根據PBMCs的生長狀態，細胞培養時間約為10~15天。
[0006]本發明所用的原料和試劑除有特殊說明外，均市售可得。
[0007]取對數生長期的K562細胞株作為靶細胞，並調整細胞密度為lX105/ml、5X104/ml、2.5 X 104/ml，每孔取100 μ I鋪於96孔培養板中，培養24小時，取製備的人、δ T細胞調密度為IX 106/ml，加入96孔培養板中，使效靶比分別為10:1、20:1和40:1，各密度設3個復孔並分別設置空白對照，培養48小時後每孔加入濃度為5mg/ml的MTT20 μ 1，繼續培養4小時後棄上清，每孔加入DMS0100 μ 1，於A570nm和A630nm處測吸光度(A)值，計算出絕對A值(A=A570-A630)，按下式計算殺傷活性:殺傷活性(％)= (A靶細胞+A效應細胞一A效靶混合細胞)/A靶細胞X 100%。
[0008]本發明的有益效果是:檢驗獲得的Y δ T細胞具有數量大、純度高、細胞毒性強等特點，從而確保製成的人Y S T細胞能夠滿足臨床的需要，而且實現了 IPP等非肽磷酸類抗原、抗TCR Y δ抗體等刺激劑相比培養成本大大降低；解決了現有技術體外培養Y δΤ細胞數量低、毒性弱、成本高等問題的效果。
【具體實施方式】
[0009]下面用實例來具體說明本發明，但本發明並不受其限制。下面實例中凡未註明具體條件的實驗方法，均為遵照常規方法和廠家提供的操作說明執行。
[0010]首先本發明是用培養的結核桿菌製備結核桿菌耐熱性抗原。包括以下步驟:
[0011]1.將結核桿菌菌體種子溼重50~100克接種於200ml的蘇通式液體培養基內，於37°C培養箱內靜止培養2周，然後將其分裝到含有10%~30%新生牛血清的250ml的蘇通式液體培養基內，每瓶50ml，分裝成4瓶，再繼續於37°C培養箱內靜止培養4周，收集培養的細菌懸液，經4000轉/分，離心30分鐘以收穫結核桿菌菌體。
[0012]2.將收集的菌體經生理鹽水洗滌2次，再用2倍體積的蒸餾水重懸浮菌體，115°C高壓蒸汽處理20分鐘，4000轉/分，離心30分鐘收集上清液，即為Mtb-HAg。
[0013]用製備的Mtb-HAg刺激PBMCs，以獲取大量、高純度、高細胞毒活性的Y δ T細胞。具體操作包括以下步驟:
[0014]1.無菌條件下用血細胞分離機或50ml注射器採集患者外周靜脈血，經聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細胞。具體步驟為:1500轉/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56°C滅活30分鐘後離心備用，用生理鹽水對倍稀釋沉澱的血細胞，人淋巴細胞分離液與稀釋血液按1:2的比例加入離心管中，2000轉/分，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉速分別為1600轉/分，1300轉/分，均離心7分鐘，即得到外周血單個核細胞。
[0015]2.將上述分離的PBMCs置於含有I~10 μ g/ml的Mtb_HAg、50~500IU/mlrhIL-2、5 ~20ng/ml rhIL-21 和 1% ~10% 自體血漿的 RPMI1640、AIM-V 或 GT-T551 培養基內，調細胞密度為(I~2) X106/ml，優選的刺激劑和細胞因子的濃度分別為Ayg/ml Mtb-HAg、200IU/ml rhIL-2、10ng/ml rhIL-21，自體血漿的濃度為 5%，細胞的初始密度2 X 106/ml，轉入細胞培養板、培養瓶或培養袋內，優選細胞培養袋，於37°C、5%C02和飽和溼度的培養箱內培養，72小時後進行半量更換培養液並補加等量的rhIL-2，以後根據細胞生長狀態每2~3天進行補加含有等量rhIL-2的培養液，以維持細胞密度為(0.5~
2.0)X 106/ml。根據PBMCs的生長狀態，細胞培養時間約為10~15天。在細胞培養的第14天，培養增殖的人Y δ T細胞絕對擴增細胞倍數平均高達500倍(η=8)。
[0016]對上述培養的Y δ T細胞進行形態學、純度及免疫表型和細胞毒活性檢測。具體操作包括以下步驟:
[0017]1.細胞培養24小時即可見Y δ T細胞沉於培養器皿的底部，並趨於集落化，48小時集落開始變大，培養6~10天即可以看到大的集落和不規則的單個核細胞。對培養10天的細胞進行瑞姬氏染色，發現大多數細胞體積增大，呈橢圓形或不規則形，細胞核大多為橢圓形或圓形，核染色疏鬆，核膜不規則，有突起，每個細胞可見I個小核仁，呈深藍色；胞質豐富，染成灰藍色，形態不規則，有偽足，近核處有淡染現象，也有呈不規則形。取培養10天的細胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%臺盼藍染色液，活細胞不染色，死細胞染成藍色，顯微鏡下計數。通過本發明可以觀察到製備的細胞活力大於95%。
[0018]2.分別取第0、7、14、21和28天的細胞，用含5%新生牛血清和0.1%疊氮納的PBS洗滌2次，調整細胞密度為1父1071111，每個檢測管內加入5(^1細胞懸液，加入螢光標記抗體(抗⑶3-FITC、抗TCR Y δ -PE)染色，4°C避光孵育30分鐘，用上述PBS洗滌2次，加入含有1%多聚甲醛的PBS溶液固定後，用流式細胞儀進行檢測，數據文件採用WinMDI軟體分析。通過本發明可以檢測到製備的細胞製劑，⑶3+T細胞高度富集純度達到98%，Y δΤ細胞從第10~14天達到峰值平均為80% (η=8)。
[0019]3.取對數生長期的Κ562細胞株作為靶細胞，並調整細胞密度為lX105/ml、5XioVml,2.5X104/ml,每孔取100 μ I鋪於96孔培養板中，培養24小時，取製備的人
Yδ T細胞調密度為I X 106/ml，加入96孔培養板中，使效靶比分另Ij為10:1、20:1和40:1，各密度設3個復孔並分別設置空白對照，培養48小時後每孔加入濃度為5mg/ml的MTT20 μ 1，繼續培養4小時後棄上清，每孔加入D MS0100 μ 1，於A570nm和A630nm處測吸光度(A)值，計算出絕對A值(A=A570-A630)，按下式計算殺傷活性:殺傷活性(％) = (A靶細胞+A效應細胞一 A效靶混合細胞)/A靶細胞X 100%。結果顯示本發明製備的Y δΤ細胞對K562細胞株具有較高的殺傷活性，殺傷率平均為82% (η=8)。
【權利要求】
1.一種人Y S T細胞對K562細胞株的殺傷活性檢測方法，其特徵在於: 首先製備一種人Y ST細胞，包括:(1)用培養的結核桿菌製備結核桿菌耐熱性抗原，其具體步驟為: 步驟1:將結核桿菌菌體種子溼重50~100克接種於200ml的蘇通式液體培養基內，於37°C培養箱內靜止培養2周，然後將其分裝到含有10%~30%新生牛血清的250ml的蘇通式液體培養基內，每瓶50ml，分裝成4瓶，再繼續於37°C培養箱內靜止培養4周，收集培養的細菌懸液，經4000轉/分，離心30分鐘以收穫結核桿菌菌體； 步驟2:將收集的菌體經生理鹽水洗滌2次，再用2倍體積的蒸餾水重懸浮菌體，115°C高壓蒸汽處理20分鐘，4000轉/分，離心30分鐘收集上清液，即為Mtb-Hag ； (2)用製備的Mtb-HAg刺激PBMCs，同時加入細胞因子rhIL_2和rhIL_21，其具體步驟為: 無菌條件下用血細胞分離機或50ml注射器採集患者外周靜脈血，經聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細胞，具體步驟為:1500轉/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56°C滅活30分鐘後離心備用，用生理鹽水對倍稀釋沉澱的血細胞，人淋巴細胞分離液與稀釋血液按1:2的比例加入離心管中，2000轉/分，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉速分別為1600轉/分，1300轉/分，均離心7分鐘，即得到外周血單個核細胞；將上述分離的PBMCs置於含有刺激劑和細胞因子為I~10 μ g/ml的Mtb-HAg、.50 ~500IU/ml rhIL_2、5 ~20ng/ml rhIL-21 和 1% ~10% 自體血漿的 RPMI1640,AIM-V 或GT-T551培養基內，調細胞密度為(I~2) X 106/ml，轉入細胞培養板、培養瓶或培養袋內，於37°C、5%C02和飽和溼度的培養箱內培養； (3)細胞培養72小時後進行半量更換培養液並補加等量的rhIL-2，以後根據細胞生長狀態每2~3天進行補加含有等量rhIL-2的培養液，以維持細胞密度為(0.5~2.0)X IO6/ml ； (4)根據細胞生長狀態，第10~15天收穫細胞； 取對數生長期的K562細胞株作為靶細胞，並調整細胞密度為I X 105/ml、5X 104/ml、.2.5X104/ml，每孔取100 μ I鋪於96孔培養板中，培養24小時，取製備的人Y δ T細胞調密度為I XlOfVml，加入96孔培養板中，使效靶比分別為10:1、20:1和40:1，各密度設3個復孔並分別設置空白對照，培養48小時後每孔加入濃度為5mg/ml的MTT20 μ 1，繼續培養4小時後棄上清，每孔加入DMS0100 μ 1，於A570nm和A630nm處測吸光度(A)值，計算出絕對A值(A=A570-A630)，按下式計算殺傷活性:殺傷活性(％)= (A靶細胞+A效應細胞一A效靶混合細胞)/A靶細胞X 100%。
【文檔編號】C12Q1/20GK103571913SQ201310474494
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年2月10日 優先權日:2012年2月10日
【發明者】馬飛, 王宇環, 羅曉玲 申請人:深圳市合一康生物科技有限公司