一種利用納米材料電極增強電化學發光信號的方法

2023-05-14 01:36:56

專利名稱：一種利用納米材料電極增強電化學發光信號的方法
技術領域：
本發明涉及電化學發光信號檢測技術領域，是一種利用納米材料製備的電極來增強電化學發光檢測信號的方法。技術背景
目前對於痕量分析物包括環境汙染物、藥物、激素、蛋白質、核酸等的高靈敏度定量篩選和檢測已經成為廣大研究工作者和臨床工作者關注的焦點之一。為了實現痕量分析物的高特異性檢測，各種基於生物特異性親合反應如抗原-抗體、核酸雜交、受體-配體反應的生物檢測方法和體系日益發展起來。由於生物親合反應自身產生的物理變化非常微弱，難於直接檢測，通常將親合反應的反應物之一標記上能產生特異信號的物質或分子，稱為標記物。根據產生信號的不同，標記物可分為放射性同位素、螢光染料、電化學分子、酶、 化學發光物、電化學發光物等。比如，免疫檢測最初使用125I作為標記物，通過放射性信號測量進行檢測定量。這個方法精密度高，測定可靠，但由於放射性元素的使用，需要建立特殊的實驗室，否則對人體會造成很大的傷害。另外，125I有一定的半衰期。為了克服這些缺點，後來發展了使用酶作為標記物，利用酶催化底物的顯色反應進行檢測的酶聯免疫反應 (ELISA)，但其靈敏度受到了限制。
電化學發光免疫檢測技術是在免疫檢測技術基礎上，繼放射免疫、酶聯免疫和普通化學發光免疫技術以後的新一代檢測技術。與其它技術比較，該技術除了具備普通化學發光所有的靈敏度高、線性範圍寬、檢測項目廣泛、試劑安全等特點外，還具有標記物體積小、試劑穩定、發光劑為單組分、發光信號可控性強等特殊優勢，是目前最先進的標記免疫檢測技術。電化學發光(ECL)是指由電化學反應引起的化學發光過程。在電極上施加一定的電壓或電流時，電極上發生電化學反應，在電極反應產物之間、或電極反應產物與溶液中某種組分之間發生化學反應而產生激發態，當激發態返回到基態時產生發光現象。電化學發光的現象很早就被發現，運用電化學發光進行檢測分析的文獻報導直至80年代初才出現，90年代開始用於試劑的臨床檢測中。從整體上講，電化學發光包括了電化學和化學發光兩個過程，故是化學發光的一種發展，但同時與化學發光又有一定的區別和其獨特的優勢一般的化學發光生物分析的標記物是化學發光反應催化酶(如過氧化物酶、鹼性磷酸酶等)或化學發光分子(如魯米諾、吖啶酯等)，其發光強度受周圍環境的影響較大，而且穩定性不高，特別是生物酶。而電化學發光免疫分析一般採用三聯吡啶釕Ru(bpy)32+為標記物，Ru(bpy)32+在三丙胺陽離子自由基(TPA+)的催化及三角形脈衝電壓激發下，只需毫秒內就可發出穩定的光。Ru(bpy)32+在發光過程中的再循環利用大大提高了分析的靈敏度；小分子的金屬配合物作為標記物，穩定性高。因此，電化學發光生物分析有其突出的優點標記物穩定，靈敏度高，過程可控性強。ECL具有更好的發展趨勢。
根據科學界公認的ECL反應機理(如圖1所示)，產生電化學發光信號的物種是激發態的標記物Ru (bpy) 32+。激發態的Ru (bpy) 32+可以通過兩種反應途徑生成⑴Ru (bpy) 32+ 在電極上被氧化生成Ru (bpy)33+，同時共反應物三丙胺(TPA)也在電極上被氧化成為TPA+。由於這個有機陽離子在水溶液中不穩定，迅速分解成為自由基TPA+。後者是個極強的還原劑，能與Ru (bpy)33+進行快速氧化還原反應，生成激發態的Ru(bpy)32+。(2) Ru (bpy) 32+在電極上被氧化生成Ru (bpy) 33+，然後通過溶液均相氧化還原反應將TPA氧化，二者再通過上述的反應生成激發態的Ru (bpy) 32+。在生物檢測中，一般採用Ru (bpy) 32+作為信號標記物，它的濃度非常低，所以ECL信號產生的主要途徑是第一個。由此可以看出，TPA的電極氧化反應是ECL檢測中一個非常關鍵的步驟。在現在通用的體系中，絕大多數都使用金、鉬金、碳等作為電極材料，對TPA的電極氧化反應具有較高的活性，所以ECL信號較高。而在常規的金屬氧化物電極如氧化銦錫(ITO)電極上，TPA的電極氧化反應非常緩慢，導致ECL信號低。發明內容
本發明的目的是公開一種提高電化學發光信號強度的方法。為達到上述目的，本發明的技術解決方案是
a)以一種金屬氧化物導電納米材料製備成電極；
b)用該電極加快電化學發光體系(發光劑+共反應物)中共反應物的電極反應速率，由此增強電化學發光的信號強度；
所述的電化學發光信號增強方法中，其所述的金屬氧化物，為氧化銦、氧化錫、氧化鋅、氧化銦錫或其複合物。
所述的電化學發光信號增強方法中，其所述的納米材料，其形狀為球形、線形、管狀、片狀、立方體形，其尺寸在1-100納米之間。
所述的電化學發光信號增強方法中，所述的電化學發光體系，發光劑是三聯吡啶釕Ru (bpy) 32+或其化學類似物，共反應物是三丙胺或其化學類似物。
本發明與現有的其他方法相比具有以下優點
1)目前流行的電化學發光檢測方法中，均使用常規導電材料作為電極，如金、 鉬金、玻碳、氧化銦錫厚膜電極等。在這些電極上，特別是在氧化銦錫厚膜電極上，共反應物三丙胺的電極氧化反應速率較慢，導致三丙胺電化學氧化電流偏低，最終影響發光劑Ru (bpy) 32+的電化學發光信號強度。本發明使用了納米級的金屬氧化物材料如氧化銦錫納米顆粒作為電極，提高了共反應物三丙胺的電極氧化反應速率，最終增強了發光劑 Ru (bpy) 32+的電化學發光信號強度。
2)常規導電材料做成的電化學發光電極，如金、鉬金、玻碳等，這些電極的透光性較差，不適合光信號的檢測。本發明使用了納米級的金屬氧化物材料如氧化銦錫納米顆粒作為電極，在提高電化學發光信號強度的同時，也保證了電極的透光性，有利於光信號的檢測。


圖1含有發光劑三聯吡啶釕(Ru (bpy) 32+)和共反應物三丙胺(TPA)的電化學發光體系的信號產生原理圖。
圖2合成的粒徑為25nm的氧化銦錫納米顆粒的透射電子顯微鏡照片。
圖3由25nm氧化銦錫納米顆粒製備的納米電極的掃描電子顯微鏡照片。
圖4不同電極在0. IM三丙胺中的電化學電流響應曲線圖，其中(a)常規氧化銦錫電極；(b)氧化銦錫納米電極；(c)常規金膜電極。測量條件Ag/AgCl (3M KCl)參比電極， 100mV/s電壓掃速。
圖5不同電極的電化學發光響應曲線圖，其中(a)常規氧化銦錫電極；(b)氧化銦錫納米電極；(c)常規金膜電極。測量條件:1 μ M Ru(bpy)32+，0. IM三丙胺，150mM磷酸緩衝液，pH 7. 4，Ag/AgCl (3M KCl)參比電極，100mV/s 電壓掃速。
圖6不同電極對可見光的透光率，其中(a)常規氧化銦錫電極；(b)由1. 25%納米氧化銦錫膠體製備的納米電極；(c)由10%納米氧化銦錫膠體製備的納米電極。(d)常規金膜電極。
具體實施方式
本發明方法在實施過程中使用的試劑包括以下幾種成分金屬氧化物納米材料， 由金屬氧化物納米材料製備的納米電極，以及可以產生電化學發光信號的發光劑和共反應物。使用的裝置包括恆電位儀和弱光檢測器(光電倍增管PMT或C⑶成像儀等)。採用上述納米電極作為工作電極，在電化學發光劑和共反應物存在時，通過恆電位儀向工作電極施加電壓，可產生電化學發光信號，光信號由弱光檢測器進行定量檢測。
以氧化銦錫納米顆粒、Ru(bpy)32+電化學發光劑、三丙胺共反應物為例，來說明本發明方法的具體實施流程
(1)粒徑為25nm的氧化銦錫納米顆粒的合成
取結晶四氯化錫、三氯化銦以超純水配成100mL、0. 5M的10% SnCl4+90% MCl3溶液。取IOmL此溶液轉入放有磁力攪拌子的錐形瓶中，置於恆溫加熱磁力攪拌器上(實驗過程中恆溫在80°C，攪拌轉速為600r/min，並加入一片聚乙二醇約0. 03g)。取約0. 8g氫氧化鈉以超純水配成40mL溶液轉入固定在錐形瓶上方的滴液漏鬥中。控制滴速在約lmL/min 向錐形瓶中滴加NaOH溶液至整個錐形瓶中溶膠pH值為7為止。將已呈灰白色的上述溶膠轉移至燒杯中，80°C下加入40mL超純水，攪拌，靜置，分層。去除上層清液後，向溶膠中加入 0. 04% Triton-IOO溶液定容至50mL備用。圖2為合成的粒徑為25nm的氧化銦錫納米顆粒的透射電子顯微鏡照片。
(2)氧化銦錫納米電極的製備
導電玻璃購買於深圳南玻集團，導電膜厚度為900 ± 100 A，方阻為19 士 2. 1 Ω / 口。 將導電玻璃自行加工至5cmX5cm規格，分別用洗滌劑(15分鐘)、純水Qmin，兩次)、丙酮 (5min)、異丙醇(5min)和純水(lOmin，兩次)超聲洗滌，置於50°C烘乾。用CTD-1000型等離子體表面處理儀(南京崑崙電子有限公司產品)對導電玻璃表面進行60s處理，以獲得更為潔淨的表面。取適量(1)中製備的納米氧化銦錫膠體溶液均勻鋪展在導電玻璃表面， 乾燥後，置於450°C燒結30min，即獲得氧化銦錫納米電極。經燒結後，氧化銦錫納米顆粒膜層牢固地吸附於導電玻璃表面(見圖3氧化銦錫納米顆粒製備的納米電極的掃描電子顯微鏡照片)。
(3)電化學電流信號的檢測
電化學電流信號檢測在0. IM三丙胺溶液中(pH 7. 4，150mM磷酸緩衝液)進行。 電化學電流檢測裝置為CHI 660B電化學分析儀(上海辰華儀器公司)，採用的三電極體系為納米氧化銦錫、常規氧化銦錫或常規金膜電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極(3M KCl)，鉬片為輔助電極，工作電極接觸面積為0. 25cm2。不同電極在0. IM三丙胺中的電化學電流響應見圖4，可見三丙胺在納米氧化銦錫電極上的氧化電流顯著高於常規氧化銦錫電極上的電流。
(4)電化學發光信號的檢測
電化學發光信號檢測在0. IM三丙胺和1 μ M的Ru (bpy) 32+溶液中(pH 7. 4，150mM 磷酸緩衝液)進行。電極電壓控制裝置為CHI 660B電化學分析儀(上海辰華儀器公司)， 採用的三電極體系為納米氧化銦錫、常規氧化銦錫或常規金膜電極為工作電極，Ag/AgCl 電極為參比電極(3M KCl)，鉬片為輔助電極，工作電極接觸面積為0.25cm2。電化學發光信號使用光電倍增管(日本濱松，型號H9306-0;3)採集，利用CHI 660B電化學分析儀對產生的光電流信號進行記錄。電化學發光檢測在密閉的暗箱中進行。不同電極在0. IM三丙胺和1 μ M的Ru (bpy) 32+溶液中的電化學發光響應見圖5。可見在納米氧化銦錫電極上的電化學發光信號是常規氧化銦錫電極上的10倍，是常規金電極上的2倍。
(5)電極透光率的測量
以空氣作為空白，分別將納米氧化銦錫、常規氧化銦錫和常規金膜電極放入美國安捷倫89090A型紫外-可見分光光度計的樣品池中，測量各個電極在可見光光譜(350-800 納米)範圍內的透光率。不同電極對可見光的透光率見圖6，可見由1.25%納米氧化銦錫膠體製備的納米電極的透光率與常規氧化銦錫電極比較只有輕微的下降，但遠遠高於常規金膜電極的透光率。
本發明方法通過採用金屬氧化物納米材料製備納米電極，加快電化學發光體系中共反應物在電極上的氧化反應速率，由此增強電化學發光劑的發光信號強度，同時保持電極的透光性。與現有的其他電化學發光電極相比，該方法中的電極具有信號高、透光性好等優點，可以用於各種電化學發光檢測分析中。
權利要求
1.一種利用納米材料電極增強電化學發光信號的方法，其特徵在於a)以一種金屬氧化物導電納米材料製備成電極；b)用該電極加快電化學發光體系(發光劑+共反應物)中共反應物的電極反應速率， 由此增強電化學發光的信號強度；
2.如權利要求1所述的電化學發光新方法，其特徵在於所述的金屬氧化物，為氧化銦、氧化錫、氧化鋅、氧化銦錫或其複合物。
3.如權利要求1所述的電化學發光新方法，其特徵在於所述的納米材料，其形狀為球形、線形、管狀、片狀、立方體形。
4.如權利要求1所述的電化學發光新方法，其特徵在於所述的納米材料，其尺寸在 1-100納米之間。
5.如權利要求1所述的電化學發光新方法，其特徵在於所述的電化學發光體系中，發光劑是三聯吡啶釕Ru(bpy)32+或其化學類似物。
6.如權利要求1所述的電化學發光新方法，其特徵在於所述的電化學發光體系中，共反應物是三丙胺或其化學類似物。
全文摘要
一種利用納米材料電極增強電化學發光信號的方法，涉及電化學發光信號檢測技術。該方法以一種金屬氧化物導電納米材料製備成電極，用該電極加快電化學發光體系中共反應物的電極反應速率，由此增強電化學發光的信號強度，提高電化學發光檢測技術的靈敏度。本發明與現有的電化學發光電極材料相比，具有信號強度高、透光性好等優點，特別適合電化學發光信號的檢測。
文檔編號G01N21/76GK102539411SQ201010578278
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月8日 優先權日2010年12月8日
發明者郭良宏 申請人:郭良宏