酶促過酸製備的控制的製作方法
2023-05-13 19:29:26 1
專利名稱：酶促過酸製備的控制的製作方法
技術領域：
本發明涉及過酸生物合成和原位酶催化領域。具體而言，本發明提供了使用酶的過氧化物解(perhydrolysis)活性產生過酸的製備控制方法，所述酶在結構上被鑑定為屬於糖酯酶的CE-7家族，包括先鋒黴素乙醯水解酶(CAH ；E. C. 3. 1. 1. 41)和乙醯木聚糖酯酶 (ΑΧΕ ;E. C. 3. 1. 1. 72)。該酶促方法由羧酸酯底物產生過羧酸。闡明反應pH特徵對比活性的影響使得人們能夠通過改變包括緩衝液濃度和PH在內的不同參數控制反應。本發明提供了包含通過本文所述方法產生的過酸的消毒製劑。
背景技術：
過酸組合物已報導是有效的抗微生物劑。已經描述了清潔、滅菌和/或消毒硬質表面、肉產品、活植物組織和醫療設備以杜絕有害微生物生長的方法(美國專利 6，545，047 ；美國專利6，183，807 ；美國專利6，518，307 ；美國專利申請公開20030026846 ； 和美國專利5，683，724)。也已報導過酸在製備用於衣物洗滌劑應用的漂白組合物中是有用的(美國專利3，974，082、美國專利5，296，161和美國專利5，364，554)。過酸可以通過羧酸和過氧化氫的化學反應進行製備(參見Organic Peroxides, Daniel Swern，編輯，第 1 卷，第 313-516 頁；Wiley Interscience, New York, 1971) 該反應通常由強無機酸例如濃硫酸催化。過氧化氫與羧酸的反應是平衡反應，並且過酸的產生通過使用過量濃度的過氧化物和/或羧酸，或通過去除水而得到促進。酶催化劑在使用和/或應用時也能夠催化過酸的快速製備，不需要貯藏其濃度可能隨時間降低的過酸溶液。一般用於經由與過氧化氫的直接化學反應來產生過酸的高濃度的羧酸不是過酸的酶促製備所需的，其中酶催化的反應可以使用濃度比化學反應中一般使用的濃度低得多的羧酸酯作為底物。酶催化反應可以跨越廣泛範圍的PH來進行，取決於在給定PH下的酶活性和穩定性，並且取決於在給定pH下對於過氧化物解的底物特異性。酯酶、脂肪酶和一些蛋白酶具有催化烷基酯水解以生成相應的羧酸的能力(式 1)式1脂肪酶、酯酶或蛋白酶R1COOR^H2O—RfOOH+HOI^。某些酯酶、脂肪酶和蛋白酶還顯示出過氧化物解活性，催化來自烷基酯的過酸合成(式2)式2脂肪酶、酯酶或蛋白酶
R1COOR^H2O2 — I^C000H+H( 2。已經發現CE-7類糖酯酶對酯的過氧化物解具有高比活性，尤其是醇、二醇和甘油的乙醯基酯。授予DiCosimo等人的美國專利公開申請11/638,635 ；11/743, 354 ； 11/943，872;和12/143，375公開了結構上歸類為糖酯酶CE-7家族成員的酶(例如先鋒黴素C脫乙醯酶[CAH]和乙醯木聚糖酯酶[ΑΧΕ])，它們特徵在於顯著的過氧化物解活性， 將羧酸酯(在存在合適的過氧源如過氧化氫的情況下)轉化成過氧羧酸，其濃度足以用作消毒劑和/或漂白劑。在某些反應條件下，CE-7酯酶能夠在1分鐘內催化製備濃度高達 4000-5000ppm、在5分鐘至30分鐘內催化製備濃度高達至少9000ppm的過酸(美國專利申請12/143，375，授予DiCosimo等人)。過氧羧酸可能腐蝕某些金屬表面，然而，可期望限制在反應期間產生的過酸總量以防止或最小化所得溶液的腐蝕效應。例如，需要在1分鐘內製備不超過200ppm至IOOOppm過酸的專利申請常常使用產生的過酸終濃度正好高於這些限制的反應條件。在一個原位製備過酸用於硬質表面消毒的專利申請中，希望具有快速生成期望濃度過酸的能力，其濃度不顯著超過有效消毒濃度的上限，從而限制或防止腐蝕該表面的某些組件。在一個原位製備過酸用於漂白衣物或紡織物的專利申請中，也期望對上文生成漂白所需過酸的濃度進行類似的限制。除了催化過酸製備外，CE-7酯酶還能夠催化過酸水解以製備羧酸和過氧化氫。因此，在反應條件下所述酶保持其活性較長時間，它可以破壞在酯和過氧化物的第一酶催化反應中生成的過酸，生成羧酸(例如乙酸)作為副產物，該羧酸能賦予消毒溶液難聞的氣味。所述酶的這種過酸水解活性也能夠損害由CE-7酯酶製備的含過酸製劑經若干個小時或甚至若干天或若干周的長期穩定性，這取決於消毒劑配方中的過酸穩定性。過酸溶液具有廣泛應用。儘管在設計高效的和有效的方法製備過酸溶液方面已經取得了進展，仍需要改善的方法。用於製備過酸的原位方法以過酸濃度依賴型方式限制過酸的酶催化製備，該方法將允許以與任務相適應的方式製備目標濃度的過酸。發明概述本文所公開的是製備目標濃度過酸的酶催化方法。酶催化的過酸製備以過酸濃度依賴型方式受到限制。本文還公開了使用包含過酸的溶液消毒表面或無生命物體以及漂白紡織物或衣物的方法，所述溶液遞送目標濃度的過酸。以下發現使得所述方法變得可行第一個發現是屬於CE-7酯酶結構家族的酶(例如先鋒黴素C脫乙醯酶[CAH]和乙醯木聚糖酯酶[ΑΧΕ])表現出顯著的過氧化物解活性，該活性用於將羧酸酯轉化成過酸，第二個發現是所述酶具有過氧化物解酯以製備過酸和水解過酸以製備羧酸和過氧化氫的活性，當產生過酸和/或羧酸的反應經過一段時間後PH降低，所述活性顯著降低或被鈍化。製備過酸並任選地水解過酸的CE-7酯酶的活性可通過多種方法進行控制，包括但不限於選擇反應的初始ΡΗ、或者選擇過氧化物解反應中的緩衝液和緩衝液濃度、或者組合選擇初始ρΗ和緩衝液以及緩衝液濃度，使得實現過酸的目標濃度或目標濃度範圍。在一個實施方案中，該方法提供製備酶催化的過酸溶液的方法，所述過酸溶液具有的過酸濃度足以消毒表面或無生命物體，並且還減少或防止與溶液中較高濃度過酸相關聯的腐蝕效應。在第二實施方案中，該方法提供製備酶催化的過酸溶液的方法，所述過酸溶液具有的過酸濃度足以消毒紡織物或衣物或者從其上移除汙漬，並且還減少或防止與溶液中較高過酸濃度過酸相關聯的對染色紡織物或衣服的損害效應，或者與織物完整相關聯的損害效應。在一些實施方案中該方法提供製備酶催化的過酸溶液的方法，所述過酸溶液適於消毒表面或無生命物體，其中酶活性的持續時間不足以介導基本的第二酶催化水解過酸反應，所述過酸是在初始酶催化反應中產生的過酸，其中第二酶催化水解過酸反應生成羧酸(例如乙酸)。控制酶催化反應生成過酸的量的方法是使用選擇性降低或鈍化酶催化功能的反應條件。過氧化物解酶的催化活性能通過多種方法進行控制，例如改變反應混合物的PH。 因此，可調節反應混合物的初始PH使得反應pH隨著過酸生成而降低，最終導致反應混合物的PH使得酶活性顯著降低或失活。作為另外一種選擇，當僅期望低濃度過酸時，反應的初始PH可低至大幅降低酶活性，導致酶催化的過酸製備僅僅持續非常短的時間。另一個控制酶催化反應產生的過酸的量的方法是使用在反應混合物中的濃度使得其緩衝能力受限的緩衝液，導致當過酸和其他反應產物(例如羧酸)被製備出來時緩衝液被迅速耗盡，從而降低反應混合物的pH並降低或鈍化酶活性。控制酶催化反應產生的過酸的量的一個方法是選擇反應混合物初始PH和具有pKa的緩衝液，它們將導致反應混合物的pH降低，使得當製備出所需量的過酸時，反應的酶活性被降低或鈍化。另一個方法是使用PH敏感型酶，該酶具有高催化速率以產生具有高初始過酸輸出的反應，導致反應混合物PH降低至使得催化活性顯著降低或鈍化的點。然而，這些方法中的每一個需要選擇一種酶用於具有PH敏感型催化活性的反應，當反應混合物實現期望PH時使得酶催化過酸製備的能力被消除或大幅降低。此外，必須理解酶的比活性對反應PH設計用於製備指定量過酸的過氧化物解反應。 本文所述的是PH敏感型過氧化物解酶和在固定時間內製備目標濃度過酸的方法。所述的是在pH介導的降低或鈍化酶催化活性後，保持相對穩定濃度過酸的過酸水溶液，即，在約20%指定過酸濃度範圍內的過酸水溶液。在一些優選實施方案中，提供了過酸水溶液，在PH介導的降低或鈍化酶催化活性後，其過酸濃度保持在約15%指定過酸濃度範圍內，更優選地保持在約10%指定過酸濃度範圍內。在降低或鈍化酶催化的過酸製備後，過酸濃度穩定性能夠持續數小時。在一個實施方案中，在已經終止酶催化的過酸製備後，過酸濃度穩定約3小時，約6小時，約9小時，約12小時，約15小時，約18小時，約21 小時，約24小時，約30小時，約36小時，約42小時，或約48小時。過氧化物解酶的具體實例例示於枯草芽孢桿菌(ATCC 31%4 )、枯草芽孢桿菌 BE1010(Payne 和 Jackson, J. Bacteriol. 173 :2278-2282(1991)),枯草芽孢桿菌ATCC 6633 (美國專利6，465，23 、枯草芽孢桿菌ATCC 29233 ；地衣芽孢桿菌 ATCO 14580 (Rey 等人，Genome Biol. ,5(10) article 77(2004)),熱纖梭菌 (Clostrdium Thermocellum) ATCC 27405 (Copeland 等人，GENBANK ZP_00504991、 短小芽孢桿菌 PS213 (Degrassi 等人，Microbiology, 146 1585-1591 (2000))、那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana) (GENBANK AAB70869. 1)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus c 1 ausii) KSM-K16 (GENBANK YP_175265)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.) NRRL B-14911 (GENBANK ZP_01168674)、喜鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans) C-125(GENBANK NP_244192)、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium sp.)Jff/ SL YS485 (GENBANK AAB68821)、枯草芽孢桿菌亞種枯草芽孢桿菌str. 168 (GENBANK
NP_388200)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)MSB8 (GENBANK NP_227893. 1)、高溫
產 S 菌(Thermoanaerobacterium saccharoIyticum)(GENBANK S41858)、Thermotogalettingae (GENBANK CP000812)、Thermotoga petrophila (GENBANK CP000702)和棲熱袍菌屬(Thermotoga sp. )RQ2 (GENBANK CP000969)。本文所述的每種過氧化物解酶具有保守結構特徵(即，保守特徵基序)以及相對於其他α / β -水解酶優異的過氧化物解活性，這使得該酶家族尤其適用於原位製備過酸， 其濃度足以用作消毒劑和/或漂白劑。適用於本發明方法的過氧化物解酶可通過在糖酯酶 CE-7家族內發現的保守特徵基序來鑑定。本文提供了製備目標濃度的過氧羧酸的方法，所述方法包括a.選擇一組反應組分以製備目標濃度的過氧羧酸，所述反應組分包含1)至少一個i)具有以下結構的酯[XlmR5其中X為式Ii6C(O)O的酯基&為Cl至C7直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地用羥基或Cl至C4烷氧基取代， 其中當&為C2至C7時，R6任選地包含一個或多個醚鍵；&為Cl至C6直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地用羥基取代；其中&中的每個碳原子各自包含不超過一個羥基或不超過一個酯基；其中&任選地包含一個或多個醚鍵；m為1至&中的碳原子數目的整數；所述酯在25 °C具有至少5ppm的水中溶解度；或者ii)具有以下結構的甘油酯
權利要求
1.製備目標濃度的過氧羧酸的方法，所述方法包括a.選擇一組反應組分以製備目標濃度的過氧羧酸，所述反應組分包含 1)至少一種1)具有以下結構的酯 [X] mR5其中X為式I^6C(O)O的酯基&為Cl至C7直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地用羥基或Cl至C4烷氧基取代，其中當R6為C2至C7時，&任選地包含一個或多個醚鍵；&為Cl至C6直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地用羥基取代；其中&中的每個碳原子各自包含不超過一個羥基或不超過一個酯基；其中&任選地包含一個或多個醚鍵；m為1至&中的碳原子數目的整數；所述酯在25 °C具有至少5ppm的水中溶解度；或 )具有以下結構的甘油酯
2.權利要求1的方法，其中所述至少一種緩衝液以介於約0.OlmM至約200mM範圍內的濃度存在。
3.權利要求1的方法，其中所述反應產物在混合所述反應組分的約1分鐘至約10分鐘內將所述反應混合物的PH降低至約5. 0。
4.權利要求1的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度為約200ppm至約2500ppm。
5.權利要求4的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度為約400ppm至約1200ppm。
6.權利要求5的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度為約400ppm至約600ppm。
7.權利要求1的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度在混合所述反應組分的約1分鐘至約10分鐘內實現。
8.權利要求1的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度在混合所述反應組分的至少約5 分鐘內實現。
9.權利要求8的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度在混合所述反應組分的約1分鐘內實現。
10.權利要求1的方法，其中一旦實現了過氧羧酸的目標濃度，所述過氧羧酸的濃度改變小於約20%的所述目標濃度。
11.權利要求1的方法，其中所述緩衝液具有約8.0至約6. 0的pKa。
12.權利要求1的方法，其中所述初始反應混合物的初始pH選自6.5,7. 2,7. 5,8. 1和8. 5。
13.權利要求1的方法，其中具有過氧化物解活性的酶催化劑來源於那不勒斯棲熱袍胃(Thermotoga neapolitana)0
14.權利要求1的方法，其中具有過氧化物解活性的酶催化劑來源於海棲熱袍菌 (Thermotoga maritima)MSB8。
15.權利要求1的方法，其中在混合所述反應組分10分鐘或更短時間內，所述pH的降低減少過氧化物解酶活性約80%或更多。
16.權利要求1的方法，其中所述酶催化劑為以下形式微生物細胞、透化的微生物細胞、微生物細胞提取物、部分地純化的酶、純化的酶、或部分地純化的酶或純化的酶的固定形式。
17.權利要求1的方法，其中所述過氧羧酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過-β -羥基丁酸、以及它們的混合物。
18.權利要求1的方法，其中所述酶催化劑缺乏過氧化氫酶活性。
19.通過製備目標濃度的過氧羧酸對硬質表面或無生命物體進行消毒的方法，所述方法包括a.選擇一組反應組分以製備目標濃度的過氧羧酸，所述反應組分包含 1)至少一種 i)具有以下結構的酯 [X] mR5其中X為式I^6C(O)O的酯基&為Cl至C7直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地用羥基或Cl至C4烷氧基取代，其中當R6為C2至C7時，&任選地包含一個或多個醚鍵；&為Cl至C6直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地用羥基取代；其中&中的每個碳原子各自包含不超過一個羥基或不超過一個酯基；其中&任選地包含一個或多個醚鍵； m為1至&中的碳原子數目的整數； 所述酯在25 °C具有至少5ppm的水中溶解度；或 )具有以下結構的甘油酯
20.權利要求19的方法，其中所述至少一種緩衝液以介於約0.OlmM至約200mM範圍內的濃度存在。
21.權利要求19的方法，其中所述反應產物在混合所述反應組分的約1分鐘至約10分鐘內將所述反應混合物的PH降低至約5. 0。
22.權利要求19的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度為約200ppm至約2500ppm。
23.權利要求22的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度為約400ppm至約1200ppm。
24.權利要求23的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度為約400ppm至約600ppm。
25.權利要求19的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度在混合所述反應組分的約1至約10分鐘內實現。
26.權利要求19的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度在混合所述反應組分的至少約 5分鐘內實現。
27.權利要求沈的方法，其中所述過氧羧酸的目標濃度在混合所述反應組分的約1分鐘內實現。
28.權利要求19的方法，其中一旦實現了過氧羧酸的目標濃度，所述過氧羧酸的濃度改變小於約20%的所述目標濃度。
29.權利要求19的方法，其中所述緩衝液具有約8.0至約6. 0的pKa。
30.權利要求1的方法，其中所述初始反應混合物的初始pH選自6.5,7. 2,7. 5,8. 1和8.5。
31.權利要求19的方法，其中具有過氧化物解活性的酶催化劑來源於那不勒斯棲熱袍胃(Thermotoga neapolitana)。
32.權利要求19的方法，其中具有過氧化物解活性的酶催化劑來源於海棲熱袍菌 (THermotoga maritima)MSB8。
33.權利要求19的方法，其中在混合所述反應組分10分鐘或更短時間內，所述pH的降低減少過氧化物解酶活性約80%或更多。
34.權利要求1的方法，其中所述酶催化劑為以下形式微生物細胞、透化的微生物細胞、微生物細胞提取物、部分地純化的酶、純化的酶、或部分地純化的酶或純化的酶的固定形式。
35.權利要求19的方法，其中所述過氧羧酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過-β -羥基丁酸、以及它們的混合物。
36.權利要求19的方法，其中所述酶催化劑缺乏過氧化氫酶活性。
全文摘要
提供了從羧酸酯中製備目標濃度的過氧羧酸的方法。更具體地講，羧酸酯在存在具有過氧化物解活性的酶催化劑的條件下與無機過氧化物如過氧化氫反應，其中通過選擇緩衝液濃度和過氧化物解酶濃度以及反應物控制反應pH來製備目標濃度的過氧羧酸。基於保守結構特徵將本發明的過氧化物解酶催化劑歸類為糖酯酶家族7(CE-7)的成員。此外，提供了包含通過本文所述方法製備的過酸的消毒劑製劑以及相應的使用方法。
文檔編號C12P7/40GK102177234SQ200980140542
公開日2011年9月7日 申請日期2009年8月11日 優先權日2008年8月13日
發明者E·C·漢, M·S·佩恩, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司