一種組合物及其作為酶標複合物保存液的應用的製作方法

2023-05-13 17:08:16

本發明涉及化學發光免疫分析
技術領域：
，尤其涉及一種組合物及其作為酶標複合物保存液的應用。
背景技術：
：化學發光免疫分析是將高靈敏的化學發光檢測與高特異性的免疫反應相結合，用於檢測各種半抗原，抗原，抗體，酶，激素，脂肪酸，藥物和維生素等的分析技術。而酶促化學發光(也稱間接化學發光)是指相關酶標記在抗體或抗原上，酶標記的抗體抗原複合物在發光底物作用下，持續發出可見光，典型的標記物有鹼性磷酸酶(AP)和辣根過氧化物酶(HRP)，對應標記物的底物分別為魯米諾及其衍生物和1,2-二氧環己烷衍生物(AMPPD)。化學發光產品憑藉靈敏度高，特異性好，自動化程度高，精密度好，準確度高等優勢在臨床應用中迅速推廣，已經成為免疫定量分析領域的主流產品。在歐美發達國家化學發光免疫分析技術已經基本取代酶聯免疫分析成為免疫診斷的主流，佔免疫診斷90％以上市場份額。生物素-親合素系統(Biotin-Avidin-System，BAS)是70年代末發展起來的一種新型生物反應放大系統。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用於醫學各領域。近年大量研究證實，生物素-親合素系統幾乎可與目前研究成功的各種標記物結合。生物素與親和素之間高親合力的牢固結合以及多級放大效應，使BAS免疫標記和有關示蹤分析更加靈敏。它已成為目前廣泛用於微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術。在化學發光免疫分析技術中，研究人員為了增加化學發光強度，提高待測物的檢出限，目前市場上試劑盒大多採用BAS生物素放大系統來連接酶與抗體。酶標複合物就是指酶通過生物素-鏈黴親和素耦聯體系與抗體結合形成的化合物。在結構上，與酶直接與抗體相連存在差異。這種複合物放置在2℃～8℃保存時，活性降低很快。因此市面上的試劑盒酶標複合物的保存是試劑研發成敗的關鍵點。目前，為了維持酶標複合物的穩定，通常需要採用具有穩定功能的緩衝液，然而，現有的緩衝液對酶標複合物的穩定效果並不理想，通常僅能在短時間內維持酶標複合物的活性，遠遠不能滿足穩定性要求。為了進一步提高酶標複合物的穩定效果，應繼續研發適用於酶標複合物的保存液。技術實現要素：有鑑於此，本發明要解決的技術問題在於提供一種組合物及其作為酶標複合物保存液的應用。本發明提供的組合物用於保存酶標複合物，能夠在37℃加速老化的條件下，維持酶標複合物的活性。本發明提供的組合物，包括：緩衝鹽、穩定劑、鹽類、糖類、表面活性劑、防腐抑菌劑和水；所述緩衝鹽選自Tris、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、MOPS、MES或HEPES；所述穩定劑選自氨基比林、酪蛋白、牛血清白蛋白、明膠、小牛血清、羊血清、甘油、山梨醇或木糖醇；所述鹽類選自NaCl、KCl、MgCl2、MgSO4、CaCl2、ZnCl2或ZnSO4；所述糖類選自蔗糖、海藻糖、果糖、殼聚糖、麥芽糖或瓊脂糖；所述表面活性劑選自吐溫、曲拉通、Brij35、聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉或十二烷基苯磺酸鈉；所述防腐抑菌劑選自疊氮化鈉、Proclin300、氯黴素或慶大黴素。所述吐溫為吐溫-20或吐溫-80；所述聚乙二醇的聚合度為6000～20000。所述NaH2PO4、Na2HPO4或KH2PO4攜帶一個或多個配位的水形成水合物。本發明提供的組合物中：所述緩衝鹽的濃度為0.01mol/L～0.5mol/L；所述鹽類的濃度為0.001mol/L～0.2mol/L；所述穩定劑的質量分數為0.1％～20％；所述糖類的質量分數為1％～10％；所述表面活性劑的質量分數為0.01％～0.1％；所述防腐抑菌劑的質量分數為0.01％～0.1％。一個具體實施例中，本發明提供的組合物中所述緩衝鹽的濃度為2.2g/L～4.18g/L；所述鹽類的濃度為9g/L～9.35g/L；所述穩定劑的質量分數為90.6g/L～132g/L；所述糖類的質量分數為20g/L～30g/L；所述表面活性劑的質量分數為0.5mL/L；所述防腐抑菌劑的質量分數為0.5mL/L。此實施例中，甘油作為穩定劑的質量根據其20℃時的密度計算獲得。本發明提供的組合物中：所述緩衝鹽選自Na2HPO4、KH2PO4、MOPS或MES；所述穩定劑選自氨基比林、酪蛋白、BSA、明膠或甘油；所述鹽類選自NaCl、KCl或CaCl2；所述糖類選自蔗糖或海藻糖；所述表面活性劑選自吐溫、聚乙二醇；所述防腐抑菌劑為Proclin300。本發明提供的組合物的pH值為6.0～8.0。一些實施例中，所述緩衝鹽為MES；所述穩定劑為氨基比林、酪蛋白、BSA和甘油；所述鹽類為NaCl和KCl；所述糖類為蔗糖；所述表面活性劑為吐溫；所述防腐抑菌劑為Proclin300。一些實施例中，所述緩衝鹽為MOPS；所述穩定劑為氨基比林、酪蛋白、明膠和甘油；所述鹽類為NaCl和CaCl2；所述糖類為海藻糖；所述表面活性劑選自聚乙二醇；所述防腐抑菌劑為Proclin300。一些實施例中，所述緩衝鹽為Na2HPO4和KH2PO4；所述穩定劑為氨基比林、酪蛋白和甘油；所述鹽類為NaCl和KCl2；所述糖類為海藻糖；所述表面活性劑為吐溫；所述防腐抑菌劑為Proclin300。一個具體實施例中，本發明提供的組合物包括水和此實施例中，組合物的pH值為6.2。另一個具體實施例中，本發明提供的組合物包括水和此實施例中，組合物的pH值為7.8。另一個具體實施例中，本發明提供的組合物包括水和此實施例中，組合物的pH值為6.9。本發明提供的組合物的製備方法為：以滅菌純化水溶解配方量的緩衝鹽、穩定劑、糖類、表面活性劑和防腐抑菌劑，經超聲或者攪拌溶清後，以滅菌純化水定容至1000mL，0.22μm濾膜過濾得酶標複合物保存液組合物。本發明提供的組合物作為酶標複合物保存液的應用。一些實施例中，所述酶標複合物中的蛋白為β2-微球蛋白、C反應蛋白或NT-proBNP。一些實施例中，所述酶標複合物中標記的酶為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶。其中，如下配方的組合物用於β2-微球蛋白酶標複合物的保存。其中，如下配方的組合物用於C反應蛋白酶標複合物的保存。其中，如下配方的組合物用於NT-proBNP酶標複合物的保存。本發明提供了一種組合物，及其作為酶標複合物保存液的應用，本發明提供的組合物能夠提高酶標複合物的穩定性，延長酶標複合物的保存期，同時可以長期穩定保存多種酶標複合物。實驗表明，β2-微球蛋白、C反應蛋白或NT-proBNP的酶標複合物通過加速老化，未老化和老化6天的穩定性偏差在±10％以內。附圖說明圖1示β2-微球蛋白AP酶標複合物化學發光標準曲線；圖2示β2-微球蛋白HRP酶標複合物化學發光標準曲線；圖3示C反應蛋白AP酶標複合物化學發光標準曲線；圖4示C反應蛋白HRP酶標複合物化學發光標準曲線；圖5示NT-proBNP的AP酶標複合物化學發光標準曲線；圖6示NT-proBNP的HRP酶標複合物化學發光標準曲線；圖1～4中，橫坐標為樣本濃度(μg/mL)，縱坐標為發光值；圖5～6中，橫坐標為樣本濃度(pg/mL)。具體實施方式本發明提供了一種組合物及其作為酶標複合物保存液的應用，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明採用的材料皆為普通市售品，皆可於市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例11、配置保存液1L具體配方：MES3.91g，NaCl8.8g、KCl0.2g，氨基比林1g，BSA2.5g，酪蛋白2.5g，蔗糖20g，甘油100mL，吐溫20、0.5mL，Proclin300、0.5mL。使用滅菌水配製，調節pH至6.2，0.22μm濾膜過濾後2℃～8℃保存。將製備好的β2-微球蛋白酶標複合物(標記HRP或AP)加入到以上描述的穩定性溶液中，配製成工作溶液。2.酶標複合物性能測試：2.1、AP酶標複合物測試方法：(1)用移液槍精確移取150μL磁珠工作液至1.5mL離心管，依次向其中加入10μLβ2-MG0.12μg/mL樣本或19.5μg/mL樣本，30μL酶標複合物，然後用移液槍將混合液打散均勻，開始計時。5min後將離心管置於磁力架，30s後吸去清液，用400μL0.02MPB7.4含0.05％吐溫20洗滌三次。(2)用100μL0.2MTris-HClpH＝8.8緩衝液將洗好的磁珠分散均勻，加20μLCDPStar，混合均勻後開始計時，加入至96孔白色酶標板，用Promega半自動發光檢測儀測試3min的發光值。整個實驗平行三組，取其發光值平均值。表1AP酶標複合物性能測試Promega測試值123平均值空白對照1078112310641088β2-MG樣本0.12μg/mL154355155664152204154074β2-MG樣本19.5μg/mL25789718268614922603669426229301擬合的線性方程如圖1。2.2、HRP酶標複合物測試方法(1)步驟同2.1(1)，其中酶標複合物為HRP酶標複合物。(2)使用100μL魯米諾溶液將洗好的磁珠分散均勻，加50μL雙氧水，混合均勻後開始計時，加入至96孔白色酶標板，用Promega半自動發光檢測儀測試3min的發光值。整個實驗平行三組，取其發光值平均值。表2HRP酶標複合物性能測試Promega測試值123平均值空白對照856912897888β2-MG樣本0.38μg/mL59229571875750057972β2-MG樣本19.35μg/mL3979309403940539410223986579擬合的線性方程如圖2。3.酶標複合物保存狀態：2℃～8℃環境，溶液透明，無沉澱物；37℃環境，溶液透明，無沉澱物。4.加速穩定性試驗：取100μL酶標複合物工作液加至1.5mL離心管，製作40個，20個置於2-8℃冰箱保存，另外20個置於37℃烘箱加速老化。測試方法同性能測試。偏差＝(加速老化6天平均值-未老化平均值)/未老化平均值實驗結果見下表。表3AP酶標複合物穩定性測試表4HRP酶標複合物穩定性測試結果顯示：由表3和表4可知，在本例穩定劑中，酶標複合物通過加速老化，未老化和老化6天的穩定性偏差在±10％以內。實施例21、C-反應蛋白酶標複合物保存液1L具體配方：MOPS4.18g，NaCl8.8g、CaCl20.55g，氨基比林5g，酪蛋白10g,明膠5g，海藻糖30g,甘油50mL，PEG20000、0.5mL，Proclin300、0.5mL。使用滅菌水配製，調節pH至7.8，0.22μm濾膜過濾後2-8℃保存將製備好的酶標複合物(HRP或AP)加入到以下描述的穩定性溶液中，配製成工作溶液溶液。2.酶標複合物性能測試：2.1、AP酶標複合物測試方法：(1)用移液槍精確移取150μL磁珠工作液至1.5mL離心管，依次向其中加入10μL1.15μg/mLCRP樣本或20.34μg/mL樣本，30μL酶標複合物，然後用移液槍將混合液打散均勻，開始計時。5min後將離心管置於磁力架，30s後吸去清液，用400μL0.02MPB7.4含0.05％吐溫20洗滌三次。(2)用100μL0.2MTris-HClpH＝8.8緩衝液將洗好的磁珠分散均勻，加20μLCDPStar，混合均勻後開始計時，加入至96孔白色酶標板，用Promega半自動發光檢測儀測試3min的發光值。整個實驗平行三組，取其發光值平均值。表5AP酶標複合物性能測試Promega測試值123平均值空白對照892857809853CRP樣本1.15μg/mL790332791313782108787918CRP樣本20.34μg/mL15768233159358511498024015561441擬合的線性方程如圖3。2.2、HRP酶標複合物測試方法(1)步驟同2.1(1)，其中酶標複合物為HRP酶標複合物。(2)使用100μL魯米諾溶液將洗好的磁珠分散均勻，加50μL雙氧水，混合均勻後開始計時，加入至96孔白色酶標板，用Promega半自動發光檢測儀測試3min的發光值。整個實驗平行三組，取其發光值平均值。表6HRP酶標複合物性能測試Promega測試值123平均值空白對照738833820797CRP樣本1.15μg/mL551560561965541223551583CRP樣本20.34μg/mL9513948982460394974379611996擬合的線性方程如圖4。3.酶標複合物保存狀態：2℃～8℃環境，溶液透明，無沉澱物；37℃環境，溶液透明，無沉澱物。4.加速穩定性試驗：取100μL酶標複合物工作液加至1.5mL離心管，製作40個，20個置於2-8℃冰箱保存，另外20個置於37℃烘箱加速老化。測試方法同性能測試。偏差＝(加速老化6天平均值-未老化平均值)/未老化平均值實驗結果見下表。表7AP酶標複合物穩定性測試表8HRP酶標複合物穩定性測試結果顯示：由表7和表8可知，在本例穩定劑中，酶標複合物通過加速老化，未老化和老化6天的穩定性偏差在±10％以內。實施例31、NT-proBNP酶標複合物保存液1L具體配方：Na2HPO4.12H2O2g，KH2PO40.2g，NaCl8.8g、KCl0.2g，氨基比林10g，酪蛋白5g，海藻糖20g，甘油60mL，吐溫20、0.5mL，Proclin300、0.5mL。使用滅菌水配製，調節pH至6.9，0.22μm濾膜過濾後2-8℃保存將製備好的酶標複合物(HRP或AP)加入到以下描述的穩定性溶液中，配製成工作溶液溶液。2.酶標複合物性能測試：2.1、AP酶標複合物測試方法：(1)用移液槍精確移取150μL磁珠工作液至1.5mL離心管，依次向其中加入10μL300.21pg/ml或3000.08pg/mLNT-proBNP樣本，30μL酶標複合物，然後用移液槍將混合液打散均勻，開始計時。5min後將離心管置於磁力架，30s後吸去清液，用400μL0.02MPB7.4含0.05％吐溫20洗滌三次。(2)用100μL0.2MTris-HClpH＝8.8緩衝液將洗好的磁珠分散均勻，加20μLCDPStar，混合均勻後開始計時，加入至96孔白色酶標板，用Promega半自動發光檢測儀測試3min的發光值。整個實驗平行三組，取其發光值平均值。表9AP酶標複合物性能測試2.2、HRP酶標複合物測試方法(1)步驟同2.1(1)，其中酶標複合物為HRP酶標複合物。(2)使用100μL魯米諾溶液將洗好的磁珠分散均勻，加50μL雙氧水，混合均勻後開始計時，加入至96孔白色酶標板，用Promega半自動發光檢測儀測試3min的發光值。整個實驗平行三組，取其發光值平均值。表10HRP酶標複合物性能測試3.酶標複合物保存狀態：2-8℃環境，溶液透明，無沉澱物；37℃環境，溶液透明，無沉澱物。4.加速穩定性試驗：取100μL酶標複合物工作液加至1.5mL離心管，製作40個，20個置於2-8℃冰箱保存，另外20個置於37℃烘箱加速老化。測試方法同性能測試。偏差＝(加速老化6天平均值-未老化平均值)/未老化平均值實驗結果見下表。表11AP酶標複合物穩定性測試表12HRP酶標複合物穩定性測試結果顯示：由表11和表12可知，在本例穩定劑中，酶標複合物通過加速老化，未老化和老化6天的穩定性偏差在±10％以內。以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp