提高植物直鏈澱粉含量的方法
2023-05-13 19:54:06
提高植物直鏈澱粉含量的方法
【專利摘要】本發明涉及提高植物直鏈澱粉含量的方法。本發明提供了澱粉合成途徑中適合進行基因工程操作並顯著改變植物中澱粉組成的酶，它們是顆粒結合型澱粉合成酶I(GBSS?I)、澱粉分支酶I(SBE?Ⅰ)和/或澱粉分支酶II(SBE?Ⅱ)。本發明還提供了一種可良好地調節植物中澱粉組成的新方法，包括降低上述酶的表達，獲得了直鏈澱粉和支鏈澱粉含量比例各不相同的一系列轉基因植物。本發明還提供了用於調節植物中澱粉組成的構建物或載體。
【專利說明】提高植物直鏈澱粉含量的方法
[0001]本發明是申請號為CN201110401231.X的發明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明屬於植物學以及分子生物學領域；更具體地，本發明涉及調節植物直鏈和支鏈澱粉含量的方法。
【背景技術】
[0003]澱粉(starch)是高等植物、藻類和一些微生物細胞的忙藏物質，是無色無臭的白色粉末，廣泛存在於各種植物中。澱粉的性質與其結構有著密切的關係，不同直鏈澱粉含量的澱粉在性質上有著巨大的差異，直接影響著其在工業上的應用。在澱粉的分布上，尤以植物種子(如米、麥、玉米)和塊根塊莖(如木薯、甘薯、馬鈴薯)含量豐富，可作為工業上製取澱粉的原料，例如可由玉米、甘薯、馬鈴薯、野生橡子、葛根等含澱粉的物質中提取而得。澱粉除食用外，工業上用於制糊精、麥芽糖、葡萄糖，也用於調製印花漿、紡織品的上漿、紙張的上膠、藥物片劑的壓制等。
[0004]澱粉是由許多葡萄糖分子縮合而成的多糖，有直鏈和支鏈兩種。直鏈澱粉由α -1,4糖苷鍵連接的葡萄糖分子組成，呈線狀鏈；支鏈澱粉在分支處有α-1，6糖苷鍵連接，其直鏈部分也是α -1，4連接。一般的澱粉為直鏈及支鏈澱粉的混合物，直鏈澱粉和支鏈澱粉在澱粉中所佔的比例隨植物的種類而異，在多數含有澱粉的植物中，通常含有20~30%直鏈澱粉、70~80%支鏈澱粉。在哺乳動物的消化道中，澱粉經澱粉酶、麥芽糖酶等作用，水解為葡萄糖，被吸收利用。糧食作物食用品質的優劣在很大程度上與作物中澱粉的組成，即直鏈澱粉與支鏈澱粉的比例有關。
[0005]目前，以植物塊根(如薯類植物塊根)為原料的澱粉加工業處於發展階段，但各種產品的加工對原材料的澱粉品質(如直鏈澱粉和支鏈澱粉的含量比例)提出了多樣化的需求。依靠傳統育種來改變澱粉品質，耗時長，需要大量人力物力，難以滿足澱粉加工業的急切需求。
[0006]本領域人員已經嘗試通過調節澱粉合成的主要基因來調節植物中澱粉的組成和含量，然而與澱粉合成相關的蛋白有許許多多，包括:右旋糖酐鹿糖酶(Dextransucrase,EC:2.4.L 5)、β -1, 3-葡聚糖合成酶(I, 3-beta-glucan synthase, EC:2.4.1.34)、內切 _β_1，3_ 葡聚糖酶(glucan endo-1, 3-beta-D-glucosidase, EC:3.2.1.39)和外切-β -1，3-葡聚糖酶(glucanl, 3-beta-D-glucosidase, EC:3.2.1.58)、鹿糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase, SPS, EC:2.4.1.14)、鹿糖合成酶(SucroseSynthase, SuSy, EC:2.4.1.13)和外切型纖維素水解酶(Cellulosel, 4-beta-cellobiosidase, EC:3.2.1.91)、外切型纖維素水解酶(Cellulosel, 4_beta_cellobiosidase, EC:3.2.1.91)、葡萄糖-1-憐酸胞嘧唳轉移酶(glucose-1-phosphatecy tidy Iy I transferase, EC: 2.7.7.33)、外切多聚半乳糖醒酸酶(galacturanl, 4-alpha-galacturonidase, exo-PG, EC: 3.2.1.67)、澱粉分支酶(I, 4-alpha-glucan branchingenzyme, SBE, EC:2.4.1.18)和 β -澱粉酶(beta-amylase, EC:3.2.1.2)等等。因此，找到適於基因工程操作的蛋白成為本領域發展的瓶頸。
[0007]綜上，通過基因工程手段培育直鏈澱粉和支鏈澱粉的比例各不相同的植物對於澱粉工業化生產是迫切需要的。因此，如何找到合適的靶基因是值得深入研究的課題；如何找到合適的方法來調節相關基因也是值得深入研究的。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在於提供調節植物直鏈和支鏈澱粉含量的方法。
[0009]本發明的另一目的在於提供調節植物直鏈和支鏈澱粉含量的構建物。
[0010]在本發明的第一方面，提供一種調節植物中直鏈澱粉含量的方法，所述方法包括:抑制顆粒結合型澱粉合成酶I (Granule-Bound Starch Synthase I, GBSSI)、澱粉分支酶I (SBEI)和/或澱粉分支酶II (SBE II )的表達。
[0011]在一個優選例中，所述的方法為提高植物中直鏈澱粉含量(即降低植物中支鏈澱粉含量)，包括:抑制澱粉分支酶I和/或澱粉分支酶II的表達。
[0012]在另一優選例中，所述的方法為降低植物中直鏈澱粉含量(即提高植物中支鏈澱粉含量)，包括:抑制顆粒結合型澱粉合成酶I的表達。 [0013]在另一優選例中，以顆粒結合型澱粉合成酶1、澱粉分支酶I和/或澱粉分支酶II多核苷酸序列中的保守性區域為靶點抑制顆粒結合型澱粉合成酶1、澱粉分支酶I和/或澱粉分支酶II的表達。
[0014]在另一優選例中，所述的保守性區域包含:
[0015]顆粒結合型澱粉合成酶I中SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列；
[0016]澱粉分支酶I中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
[0017]澱粉分支酶II中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或
[0018]澱粉分支酶I中SEQ ID NO:6中第1_165位所示的核苷酸序列。
[0019]在另一優選例中，將構建物或含有該構建物的載體轉染到植物中；所述的構建物含有式(I)所示的結構:
[0020]Seq 正向-X-Seq 反向式(I),
[0021]式(I)中，
[0022]具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串聯而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串聯而成的核苷酸序列
[0023]Seq反向具有與Seq正向互補的核苷酸序列；
[0024]X為位於Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，並且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向不互補。
[0025]在另一優選例中，在Seqil^之前,還包含一啟動子,所述啟動子是組成型啟動子或組織特異性啟動子。
[0026]在另一優選例中，該啟動子為CaMV35S啟動子或p54/l.0啟動子。
[0027]在另一優選例中，所述的Seqtt具有SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:7串聯而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串聯而成的核苷酸序列；或[0028]所述的啟動子是p54/l.0啟動子。
[0029]在另一優選例中，所述的具有SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列，或具有SEQID NO: 10所示的核苷酸序列。
[0030]更佳地，所述的Seqtt具有SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。
[0031 ] 在另一優選例中，所述方法包括:
[0032](I)提供攜帶所述的構建物或含有該構建物的載體的農桿菌；
[0033](2)將植物細胞、組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使所述構建物轉入植物細胞；並整合到植物細胞的染色體上；和
[0034](3)選擇轉入了構建物的植物細胞、組織或器官，再生成植株。
[0035]在本發明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，選自:
[0036]具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0037]具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0038]具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0039]具有SEQ ID NO:6中第1_165位所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0040]具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸；或
[0041]具有SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的多核苷酸。
[0042]在另一優選例中，所述的多核苷酸選自:具有SEQ ID N0:9所示核苷酸序列的多核苷酸或具有SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的多核苷酸。基於所述的多核苷酸製備的構建物或載體被導入植物後，可使得植物中直鏈澱粉含量超過50 %; 55 %，60 %，更佳地超過65 %，70%，更佳地超過75% ;85%，90%，95%，更佳地接近100%。
[0043]在另一優選例中，所述的多核苷酸不包括編碼全長的GBSS1、SBEI或SBEII基因的多核苷酸或基因組基因。
[0044]在本發明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用於製備調節植物中直鏈澱粉含量的構建物或幹擾分子。
[0045]在本發明的另一方面，提供一種的構建物，含有式(I)所示的結構:
[0046]Seq正向-X-Seq反向式⑴，
[0047]式⑴中，
[0048]具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串聯而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串聯而成的核苷酸序列；
[0049]Seqg具有與Seqtt互補的核苷酸序列；
[0050]X為位於Seq1向和Seq反向之間的間隔序列，並且所述間隔序列與Seqtt和Seq反向不互補。
[0051]在另一優選例中，式(I)所示的結構在轉入植物細胞轉錄後，形成式(II)所示的
二級結構:
[0052]
【權利要求】
1.一種提高植物中直鏈澱粉含量的方法，所述方法包括:抑制澱粉分支酶I和/或澱粉分支酶II的表達。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，以澱粉分支酶I和/或澱粉分支酶II核苷酸序列中的保守性區域為靶點抑制澱粉分支酶I和/或澱粉分支酶II的表達。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的保守性區域包含: 澱粉分支酶I中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； 澱粉分支酶II中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或 澱粉分支酶I中SEQ ID NO:6中第1-165位所示的核苷酸序列。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，將構建物或含有該構建物的載體轉染到植物中；所述的構建物含有式(I)所示的結構: Seq正向_x_Seq反向式(I), 式⑴中，
具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQIDN0:6和SEQ ID NO: 7串聯而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ IDNO:7串聯而成的核苷酸序列
具有與Seq1^1互補的核苷酸序列； X為位於Seqtt和Seq&^^間的間隔序列，並且所述間隔序列與Seqtt和Seqg不互補。
5.如權利要求4所述的方法,其特徵在於,在Seqil^之前,還包含一啟動子,所述啟動子是組成型啟動子或組織特異性啟動子。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，該啟動子為CaMV35S啟動子或p54/l.0啟動子。
7.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的具有SEQID NO:6和SEQ IDNO: 7串聯而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO: 7串聯而成的核苷酸序列；或 所述的啟動子是p54/l.0啟動子。
8.如權利要求4-7任一所述的方法，其特徵在於，所述方法包括: (1)提供攜帶所述的構建物或含有該構建物的載體的農桿菌； (2)將植物細胞、組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使所述構建物轉入植物細胞；並整合到植物細胞的染色體上；和 (3)選擇轉入了構建物的植物細胞、組織或器官，再生成植株。
9.一種分離的多核苷酸,選自: 具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的多核苷酸； 具有SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的多核苷酸； 具有SEQ ID NO:6中第1-165位所示核苷酸序列的多核苷酸； 具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸；或 具有SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的多核苷酸。
10.權利要求9所述的多核苷酸的用途，用於製備提高植物中直鏈澱粉含量的構建物或幹擾分子。
11.一種的構建物，含有式(I)所示的結構: Seq正向_x_Seq反向式(I), 式⑴中， Seq1^1具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQIDN0:6和SEQ ID NO: 7串聯而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ IDNO:7串聯而成的核苷酸序列；
具有與Seq1^1互補的核苷酸序列； X為位於Seqtt和Seq&^^間的間隔序列，並且所述間隔序列與Seqtt和Seqg不互補。
12.如權利要求11所述的構建物，其特徵在於，在Seq1^1之前，還包含與之操作性連接的啟動子，該啟動子為CaMV35S啟動子或p54/l.0啟動子。
13.如權利要求11或12所述 的構建物，其特徵在於，所述的Seq1^1具有SEQID NO: 6和SEQ ID NO: 7串聯而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO: 7串聯而成的核苷酸序列；或 所述的啟動子是p54/l.0啟動子。
14.一種載體，所述的載體含有權利要求11-13任一所述的構建物。
15.權利要求11-13任一所述的構建物或權利要求14所述的載體的用途，用於導入到植物中，從而提高植物中直鏈澱粉的含量。
16.如權利要求15所述的用途，其特徵在於，所述的構建物或載體還用於: 調節植物中的澱粉糊化特性； 調節植物中的澱粉粘度特性； 改變植物中澱粉顆粒的形態。
【文檔編號】C12N15/84GK104017829SQ201410269760
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2011年12月6日 優先權日:2011年12月6日
【發明者】張鵬, 楊俊 , 趙姍姍 申請人:中國科學院上海生命科學研究院