一種鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的引物及試劑盒的製作方法

2023-05-13 21:36:21 1

專利名稱：一種鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的引物及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種家畜口蹄疫感染與免疫鑑別試劑盒。
技術背景
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)又稱 口瘡熱(Aphthous fever),是由口蹄 疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染引起的偶蹄動物共患的急性、熱性、高 度接觸性傳染病。除了豬、牛、羊等主要家畜之外，FMDV還可以感染三十多種野生動物，感染 後發病率幾乎高達100%。患病動物的口、舌、蹄和乳房等部位出現水泡，破潰並形成爛斑。 人也可以感染FMD，症狀較輕，大多病程呈良性經過。世界各國都高度重視FMD疫情，世界動 物衛生組織(OIE)和世界糧農組織(FAO)將其列為A類動物傳染病之首。
區分FMD野毒感染動物和疫苗免疫動物能準確反映一個地區的FMD感染狀態，也 是OIE判斷一個國家或地區有無FMD的依據。在採取FMD計劃免疫的預防措施的國家或地 區，也必須實行嚴格的FMD進口檢疫和國內疫情監測。在疫情監測的過程中，通常是以動物 血清抗體檢測為主，然而現有的血清學檢測方法主要是針對FMDV的結構蛋白(structural protein)抗體的監測，這種檢測可以確定動物是否接觸過FMDV，但難以區分FMD免疫動 物和自然感染動物。OIE規定存在FMD的地區必須進行疫苗免疫，而且一般採用滅活苗免 疫。因為在疫苗製備過程中，病毒要經過滅活，純化和乳化等過程，FMDV16的非結構蛋白 (nonstructural protein, NSP)受到嚴重破壞,疫苗中幾乎不存在NSP,因此,免疫動物體內 無NSP抗體。感染FMD的動物，野毒在成熟或裝配過程中伴隨NSP的產生，因此感染動物體 內存在NSP抗體。所以，檢測NSP抗體可以區分免疫動物和感染動物。
NSP抗體檢測方法包括以2C、3A、3B、3ABC和3D為基礎的瓊脂凝膠免疫擴散實 驗(AGID)、乳膠凝集實驗、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、酶聯免疫電轉化斑點實驗(enzyme immuno-transfer blotting, EITB)方法和免疫阻斷方法(immuno-block method), De Dingo等(1997)應用ELISA的結果表明，ELISA是最佳方法，客觀性強，敏感性高，適宜大規 模樣品的檢測。
但是，現有的檢測方法仍存在著缺點和不足，主要有以下幾點①未利用噬菌體表 面展示的多拷貝NSP抗原；②抗原分離純化工藝複雜。發明內容
本發明的主要目的是，提供一種利用噬菌體表面展示的多拷貝NSP抗原，簡化抗 原分離純化製備試劑盒。
為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案
一種鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的試劑盒，所述試劑盒包含
一塊預包被有吸附T4噬菌體表面多拷貝展示的口蹄疫病毒3ABC抗原的ELISA微 孔板，所述口蹄疫病毒3ABC抗原的胺基酸序列如SEQ ID:No.1所示；
一塊預包被有吸附T4噬菌體表面多拷貝展示的口蹄疫病毒3B抗原的ELISA微孔板，所述口蹄疫病毒3B抗原的胺基酸序列如SEQ ID:No. 2所示；
一塊預包被有吸附T4噬菌體表面多拷貝展示的口蹄疫病毒3D抗原的ELISA微孔板，所述口蹄疫病毒3D抗原的胺基酸序列如SEQ ID:No. 3所示；
酶結合物山羊抗豬抗體-辣根過氧化物酶結合物的水溶液，濃度為55 μ mo I/L ；
洗滌液0.15mol/L、ρΗ7· 2 的 PBS ；
底物濃度為O. l%g/mL)的TMB水溶液；
顯色劑濃度為O. 015%g/mL)的H2O2水溶液；
樣本稀釋液0. l%g/mL牛血清白蛋白，添加O. l%g/mL疊氮化鈉作保護劑；
終止液2mol/L的 H2SO4 ；
陽性對照品含FMDV抗體的豬血清，用蒸餾水按照1:500進行稀釋，添加O. l%g/ mL疊氮化鈉作保護劑；
陰性對照品不含FMDV抗體的豬血清，用蒸餾水按照1:500進行稀釋，添加 O. l%g/mL疊氮化鈉作保護劑。
如上所述的試劑盒，其中優選地，所述ELISA微孔板為96孔ELISA微孔板。
如上所述試劑盒的使用方法，其步驟如下
A.用蒸餾水或去離子水將所述洗滌液按1:10的體積比稀釋，作為工作洗滌液；
B.用所述樣本稀釋液 將待檢血清按1:100的體積比稀釋；
C.取所述陰性對照品和陽性對照品各100μ L分別加入一個反應孔內，並取 100 μ L所述樣本稀釋液加入一個反應孔內作為空白對照，其餘的每個樣本檢測孔中分別加已稀釋待檢血清100 μ L ;37°C避光反應30分鐘後甩去孔內液體，每個孔內注滿所述工作洗滌液，重複洗滌3次，每次洗滌均停留I分鐘後甩淨拍幹；
D.除空白對照孔外其餘每孔內加入I滴所述酶結合物，37°C下避光反應30分鐘後甩去孔內液體，按照步驟C中所述的操作對孔進行洗滌，拍幹；
E.各孔內分別加入所述底物和顯色劑各一滴，混勻，37°C下避光顯色10分鐘，之後分別加入所述終止液一滴，混勻，終止反應；
F.通過儀器判斷結果，以空白對照調零，以620nm作參比波長，用酶標儀於450nm 讀取0. D值，若檢孔0. D值大於陰性對照2.1倍為陽性，當陰性對照0. D值低於0. 08時按 0. 08計算。
注意事項試劑盒在2_8°C下保存，每次取出時先平衡至室溫後使用。滴瓶每次用後一定要將蓋擰緊，各瓶蓋之間不可混用，各試劑盒之間不可混用。
洗滌時將蒸餾水加滿孔內，每次停放三十秒鐘後甩去孔內液體。禁用自來水等其它水源。
為提高實驗的可比性建議使用儀器判讀結果，並對陰性對照測復孔以減少誤差。
一對鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的引物，其用來克隆口蹄疫病毒3ABC基因， 其特徵在於，
上遊引物T4-3A的核苷酸序列如SEQ ID:No. 4所示，
下遊引物T4-3C的核苷酸序列如SEQ ID:No. 5所示。
一對鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的引物，其用來克隆口蹄疫病毒3B基因，其特徵在於，
上遊引物T4-3B1的核苷酸序列如SEQ ID:No. 6所示，
下遊引物T4-3B2的核苷酸序列如SEQ ID:No. 7所示。
一對鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的引物，其用來克隆口蹄疫病毒3D基因，其特徵在於，
上遊引物T4-3D1的核苷酸序列如SEQ ID:No. 8所示。
下遊引物T4-3D2的核苷酸序列如SEQ ID:No. 9所示。
本發明的有益效果為
本發明首次將口蹄疫病毒(FMDV)非結構蛋白(NSP)3ABC、3B和3D展示在T4噬菌體表面，並使用改造的高效可溶性表達載體對3B蛋白進行融合表達，建立4種區分FMD野毒感染動物和疫苗免疫動物DIVA - ELISA方法。
本發明還提供了利用T4噬菌體表面多拷貝展示口蹄疫病毒NSP抗原3ABC、3B及 3D製備的ELISA試劑盒，為感染與免疫鑑別診斷提供了新的技術手段。
具體實施方式
一、製備抗原蛋白
1.根據GenBank中註冊的O型FMDV的3ABC和3D基因序列設計特異性的引物對 T4-3A/T4-3C和T4-3D1/T4-3D2，分別用於克隆和表達3ABC 和3D基因
上遊引物T4-3A SEQ ID: No. 4 ；
下遊引物T4-3C SEQ ID: No. 5 ；
上遊引物T4-3D1 SEQ ID: No. 8 ；
下遊引物T4-3D2 :SEQ ID:No.9。
採用RT-PCR方法擴增3ABC和3D基因片段並克隆到pGEM_T Easy載體中進行序列測定。對兩個基因的操作過程相同，詳述如下。
(I)總 RNA 的萃取
取含FMDV的乳鼠體，剪碎，加入Eppendorf管中稱重。按照Ig加入IOmL的比例逐漸加入199培養液(美國Gibco公司產品)，在消毒的玻璃研磨器內反覆研磨得到均勻的混懸液。從中吸出250 μ L混懸液，加入TRIZOL LS總RNA抽提溶液(美國Invitrogen公司產品)750 μ L，混合備用，可置-80 V保存。
抽提ΒΗΚ21細胞傳代適應的FMDV時，待細胞單層出現100%細胞病變(CPE)時， 細胞脫壁懸浮。無菌收集細胞和培養液，10, OOOrpm離心lOmin。取沉澱,按照每IOcm2的 BHK21細胞單層加入ImL TRIZOL LS，用移液器吹打溶解為均勻的混懸液，即用或置_80°C保存。
將上述製備好的樣品置Eppendorf管中，15 30°C下孵育5min。然後按照每ImL TRIZOL LS加入O. 2mL氯仿的比例加入氯仿，蓋緊，大力搖動15次(共約15s)，置室溫孵育 2-3min後,在預先致冷至2_8°C的冷凍高速離心機中離心15min。
離心後用ImL —次性注射器吸取上清，置新的無菌Eppendorf管中，按照ImL TRIZOL LS原量加入異丙醇O. 5mL,室溫下置lOmin，再在預先致冷至2_8°C的冷凍高速離心機中離心IOmin0
用移液器吸去上清，沉澱按TRIZOL LS原量加入等量75%乙醇，輕輕振搖，在預先致冷至2_8°C的冷凍高速離心機中離心15min。用移液器去掉酒精，打開Eppendorf管蓋，置超淨工作檯吹風乾燥5-10min。管底 的微量白色物質即為抽提出的總RNA。(2)反轉錄取0. 2mLEppendorf 管，作為 A 管，加入5 X反轉錄酶XL緩衝液 4 ii LdNTP5u LRNA 酶抑制劑0.5iiL將A管置冰盒中，加入AMV反轉錄酶XL2 ii L ;在抽提的總RNA的Eppendorf管中，加入上遊引物2u L下遊引物2u LDEPC 水3-5 u L輕輕吹打溶解，從中吸取8. 5 ii L加入A管。將A管以5，OOOrpm離心10s，置HYBAID PCR儀中，42°C保溫lh。(3) PCR 擴增在0.5mL Eppendorf管中，製備反應體系，總量為lOOyL，其中加入
反轉錄產物10ul
上遊引物1ul
下遊引物1ul
ExTM Taq DNA 聚合酶1 ul
lOxExTMTaq 緩衝液10ul
MgCl2 溶液8ul
dNTP混合物5ul
DEPC-水64『uL5, OOOrpm 離心 10s ;用 0. 2mL Eppendorf 管分裝，10 u L/ 管，向每管中加入 10 y L PCR礦物油，5，OOOrpm離心10s。按照溫度梯度，置HYBAID梯度PCR儀上，進行降落PCR擴 增，相應的循環條件和溫度列表如下
權利要求
1.一種鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包含 一塊預包被有吸附T4噬菌體表面多拷貝展示的口蹄疫病毒3ABC抗原的ELISA微孔板，所述口蹄疫病毒3ABC抗原的胺基酸序列如SEQ ID:No.1所示；一塊預包被有吸附T4噬菌體表面多拷貝展示的口蹄疫病毒3B抗原的ELISA微孔板， 所述口蹄疫病毒3B抗原的胺基酸序列如SEQ ID:No. 2所示；一塊預包被有吸附T4噬菌體表面多拷貝展示的口蹄疫病毒3D抗原的ELISA微孔板， 所述口蹄疫病毒3D抗原的胺基酸序列如SEQ ID:No. 3所示；酶結合物山羊抗豬抗體-辣根過氧化物酶結合物的水溶液，濃度為55 μ mo I/L ； 洗滌液0. 15mol/L、pH7. 2 的 PBS ；底物濃度為O. l%g/mL的TMB水溶液；顯色劑:濃度為O. 015%g/mL的H2O2水溶液；樣本稀釋液0. l%g/mL牛血清白蛋白，添加O. l%g/mL疊氮化鈉作保護劑；終止液2mol/L 的 H2SO4 ；陽性對照品含FMDV抗體的豬血清，用蒸餾水按照1:500進行稀釋，添加O. l%g/mL疊氮化鈉作保護劑；陰性對照品不含FMDV抗體的豬血清，用蒸餾水按照1:500進行稀釋，添加O. l%g/mL 疊氮化鈉作保護劑。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述ELISA微孔板為96孔ELISA微孔板。
3.權利要求1所述試劑盒的使用方法，其特徵在於，步驟如下A.用蒸餾水或去離子水將所述洗滌液按1:10的體積比稀釋，作為工作洗滌液；B.用所述樣本稀釋液將待檢血清按1:100的體積比稀釋；C.取所述陰性對照品和陽性對照品各100μ L分別加入一個反應孔內，並取IOOyL所述樣本稀釋液加入一個反應孔內作為空白對照，其餘的每個樣本檢測孔中分別加已稀釋待檢血清100 μ L ;37°C避光反應30分鐘後甩去孔內液體，每個孔內注滿所述工作洗滌液，重複洗滌3次，每次洗滌均停留I分鐘後甩淨拍幹；D.除空白對照孔外其餘每孔內加入I滴所述酶結合物，37°C下避光反應30分鐘後甩去孔內液體，按照步驟C中所述的操作對孔進行洗滌，拍幹；E.各孔內分別加入所述底物和顯色劑各一滴，混勻，37°C下避光顯色10分鐘，之後分別加入所述終止液一滴，混勻，終止反應；F.通過儀器判斷結果，以空白對照調零，以620nm作參比波長，用酶標儀於450nm讀取 O. D值，若檢孔O. D值大於陰性對照2.1倍為陽性，當陰性對照O. D值低於O. 08時按O. 08 計算。
4.一對鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的引物，其用來克隆口蹄疫病毒3ABC基因，其特徵在於，上遊引物T4-3A的核苷酸序列如SEQ ID:No. 4所示，下遊引物T4-3C的核苷酸序列如SEQ ID:No. 5所示。
5.一對鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的引物，其用來克隆口蹄疫病毒3B基因，其特徵在於，上遊引物T4-3B1的核苷酸序列如SEQ ID:No. 6所示，下遊引物T4-3B2的核苷酸序列如SEQ ID:No. 7所示。
6.一對鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的引物，其用來克隆口蹄疫病毒3D基因，其特徵在於，上遊引物T4-3D1的核苷酸序列如SEQ ID:No. 8所示。 下遊引物T4-3D2的核苷酸序列如SEQ ID:No. 9所示。
全文摘要
一種鑑別進境動物口蹄疫感染與免疫的試劑盒，包含3塊預包被ELISA微孔板分別預包被有吸附T4噬菌體表面多拷貝展示的口蹄疫病毒3ABC抗原、吸附T4噬菌體表面多拷貝展示的口蹄疫病毒3B抗原、吸附T4噬菌體表面多拷貝展示的口蹄疫病毒3D抗原；山羊抗豬抗體-辣根過氧化物酶結合物；洗滌液0.15mol/L、pH7.2的PBS；底物0.1%TMB溶液；顯色劑0.015%H2O2；樣本稀釋液0.1%牛血清白蛋白，0.1%疊氮化鈉作保護劑；終止液2mol/LH2SO4；陽性對照品，500倍稀釋，0.1%疊氮化鈉作保護劑；陰性對照品，500倍稀釋，0.1%疊氮化鈉作保護劑。
文檔編號G01N33/531GK103063838SQ201210385688
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月11日 優先權日2012年10月11日
發明者林志雄, 田純見, 馬靜雲, 羅瓊, 魚海瓊, 羅長保, 陳茹, 劉志玲, 王宏, 吳曉薇, 畢英佐 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心