一種以Rd為底物製備稀有人參皂甙IH-901的方法

2023-08-22 11:30:11

專利名稱：一種以Rd為底物製備稀有人參皂甙IH-901的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備稀有人參皂甙IH-901的方法。
背景技術：
現代藥理研究表明，人參發揮抗腫瘤作用的最終活性物質不是天然人參皂甙如 人參皂甙Rbp Rb2、 Rb3、 Rc、 Rd等，而是其一系列腸道菌群的作用下所產生的代謝物，即天然 人參皂甙只是抗腫瘤天然前體藥物，人參皂甙腸道菌代謝產物才是抗腫瘤活性本質或活性 實體。人參皂甙的代謝研究發現，其中，人參皂甙腸道菌代謝物20-0-P-D-吡喃葡萄糖 苷-20(S)-原人參二醇(簡稱稀有人參皂甙IH-901，M1或Compound K)是天然二醇組人參 皂甙如Rbp Rb2等口服後由腸道細菌所分泌的糖苷酶選擇性水解C-3位糖配體所得的最終 主要代謝產物，是人參皂甙抗腫瘤作用的最終主要活性形式之一。而且大量有關天然人參 皂甙與IH-901的代謝關係研究不斷證實，一些含量較高、極性較大的二醇組皂甙均能通過 腸道菌代謝最終降解為IH-901被機體吸收。 稀有人參皂甙IH-901屬二醇組皂甙，在天然的人參中不存在，是其他二醇組人參 皂甙在人腸道內的降解代謝產物。近年來諸多研究表明人參的許多生物學活性都是由該化 合物引起的，特別是在抗腫瘤、抗衰老，抗炎症等方面都體現良好的藥效。目前其研究的熱 點集中體現在IH-901化合物的大規模製備和生物活性深入研究兩個方面，我國對該化合 物的研究尚處於起步階段，未見系統研究報導。由於IH-901為體內代謝產物，故無毒，研 究表明具有廣泛的抗腫瘤活性，迄今，稀有人參皂甙IH-901的臨床價值已引起各國高度重 視，並成為各大製藥公司研究的熱點。 IH-901將是一個很有前途的抗腫瘤藥物，未來將相繼以保健品及國家新藥形式陸 續上市，稀有人參皂甙項目在21世紀生物醫藥及生物健康品具有前瞻性、稀缺性以及需求 巨大性，國際國內市場對其需求有著巨大的潛力。目前稀有人參皂甙IH-901由於其價格昂 貴，市場上含量在99%以上價格達1000萬元/公斤，而人參皂甙僅800元/公斤，難以被腫 瘤病人使用，因此稀有人參皂甙IH-901的生產方法備受關注。 由於人參皂甙四環三萜母核結構上3位和20位糖苷鍵的特異性，決定了 IH-901 只能由溫和的生物轉化方法獲得，而常用的酸或鹼水解方法是行不通的。目前，生物轉化方 法通常包括微生物發酵和酶轉化兩種主要方法。 微生物發酵法製備所用的微生物主要是腸道厭氧菌，而其他微生物的研究比較 少。腸道厭氧菌發酵最初是以人排洩物中的總菌物進行發酵，後來研究篩選單一腸道菌來 轉化，如採用腸道乳酸菌轉化二醇型皂苷製備IH-901,發現運用Bifidobacterium minimum KK-l和B. choeri皿m KK-2共發酵轉化Rbl時效果最好，轉化率達到41 %左右，但腸道菌多 為厭氧菌，培養條件苛刻，培養基成本高。另有研究篩選原始土壤微生物來降解人參皂苷， 但酶解能力低下，目的產物收率不高，須通過優化發酵條件和菌種誘變等方法來提高轉化 能力。中科院大連化學物理研究所申請發明專利用黑麴黴酶解人參皂苷製備稀有低極性人 參皂苷的方法，所用黑麴黴菌是將各種來源的黑麴黴菌轉入含有人參皂甙的培養基中，經傳代培養、馴化、篩選得到的能夠酵解產生稀有人參皂甙及甙元的菌株。目前在微生物發酵 製備方面並沒有適用大規模製備的成熟的方法或工藝。 而參照腸內菌代謝原理，酶轉化法製備是利用酶作為催化劑實現化學轉化的過 程，是酶製劑對外源性底物進行結構性修飾所發生的化學反應，酶及酶體系能將許多天然 化合物轉化為具有較高生物活性的物質，酶法轉化法的優點在於流程短、專一性強、產物易 分離純化。用於製備的酶大部分是工業酶製劑，一般採用具有酶解糖苷鍵的酶，如柚皮苷 酶、果膠酶、纖維素酶、蝸牛酶以及乳糖酶等。國內學者利用P-葡萄糖苷酶對三七莖葉 總皂苷進行轉化，取得較好的轉化效果。也有從具有轉化活性的菌株中分離專一性更強 的轉化酶，如從食用微生物Bifidobacterium sp. Int57和Bifidobacterium sp. SJ32中 提取的粗酶，可轉化他2和Rc成Rd和&，進而轉化成終產物人參皂甙IH-901，從人腸道 菌Fusodobacterium K-60分離純化的葡萄糖苷酶，亦能直接轉化Rt^生成稀有人參皂甙 IH-901。但這些方法也存在酶的用量大、來源困難、底物成分較高等缺點，所以上述方法也 尚無法應用於工業化生產。酶轉化法選擇性強、 一般產物也便於提取分離，工藝研究控制方 便，該製備法更有利於規模化製備，其研究關鍵在於獲得廉價而有高效專一的工業酶製劑。
隨著天然人參皂甙類化合物腸道代謝研究的深入，研究表明腸道菌代謝降解人參 皂甙其作用的並不是菌體本身，而是腸道菌分泌的生物酶，代謝的實質是酶對天然人參皂 甙的結構進行了生物修飾或改造，而生成直接體現生物活性的代謝產物。參照腸道菌代謝 機理，目前IH-901製備方法主要有微生物發酵法和酶法轉化法兩種方法。微生物發酵法由 於發酵的培養條件苛刻，培養成本高，而且發酵也需要尋找到具高效的菌體，尚無法滿足工 業化生產需要。生物的方法酶解轉化製備，由於酶解反應溫和，條件易於控制，加之酶的選 擇性、專屬性，只作用於特殊結構的固定位置，對其它的結構和空間構型沒有影響，而且人 參皂甙20位的糖苷鍵在酸性介質中的穩定性低於3位糖苷鍵，並且空間阻礙作用使得酶水 解20位的糖苷鍵活力很低，因此，酶轉化法成為目前採用的主要製備方法。實現規模化生 產的體外酶法轉化製備關鍵是篩選到來源廣泛、成本低、高效專一性的生物酶，以及利用廉 價的酶轉化原材料，建立可適用於工業化工藝。目前據研究報導，國內外有酶法轉化中國人 參、高麗參、西洋參或三七等為稀有人參皂甙IH-901的工藝研究和文獻報導，尚未見以廉 價的絞股藍為原料的報導，而且這些方法大多存在酶的來源困難、原料成本高等缺點，尚無 法應用於規模化製備或工業化生產。 絞股藍[Gynostemma pentaphyllum(Thunb. )Makino]又名七葉膽、五葉參、甘茶蔓 等，是葫蘆科絞股藍屬的多年生草質藤本植物。絞股藍總皂苷含量是人參的3倍，其中單體 人參皂甙Rd的含量是人參中的8倍。目前尚未見以在絞股藍中含量極其豐富的單體人參 皂甙Rd為底物，經國產蝸牛酶轉化為稀有人參皂甙IH-901的工藝研究和文獻報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種以廉價、易得的單體人參皂甙Rd為底物，經廉價的酶催 化，來製備昂貴的稀有人參皂甙IH-901的方法。 本發明的技術方案是這樣的一種以Rd為底物製備稀有人參皂甙IH-901的方法， 通過如下方案實現將l單位質量提取自絞股藍的單體人參皂甙Rd、0. 5-l單位質量國產的 蝸牛酶和1單位體積無菌水混合均勻，於30-45t:下保溫72-120小時之後，便可將單體人參皂甙Rd轉化為稀有人參皂甙IH-901。 採用上述方案後，本發明的製備稀有人參皂甙IH-901的方法，以提取自絞股藍的 單一人參皂甙Rd為反應底物，反應的酶為廉價的國產蝸牛酶，反應後的體系中成分簡單， 後續的產物提取非常簡單。由於絞股藍中單體人參皂甙Rd的含量是人參中的8倍，與現有 技術相比，本發明的製備方法，採用的原料為在廉價的絞股藍中含量很高的單體人參皂甙 Rd，採用的酶為廉價的國產蝸牛酶，採用的反應介質為無菌水，具有成本低，以及反應結束 後體系中成分簡單有利於產物提取等優點。
具體實施例方式
實施例一 本發明的一種以Rd為底物製備稀有人參皂甙IH-901的方法，通過如下方案實 現 ①取1毫克提取自絞股藍的單體人參皂甙Rd於無菌的反應管內，加入O. 5毫克國 產的蝸牛酶和1毫升無菌水； ②將單體人參皂甙Rd、蝸牛酶和無菌水混合均勻，於3(TC恆溫水浴120小時，反 應底物單體人參皂甙Rd經薄層層析和液相色譜分析被證實已經轉化為產物稀有人參皂甙 IH-901。 實施例二 本發明的一種以Rd為底物製備稀有人參皂甙IH-901的方法，通過如下方案實 現 ①取1毫克提取自絞股藍的單體人參皂甙Rd於無菌的反應管內，加入0. 75毫克 國產的蝸牛酶和1毫升無菌水； ②將單體人參皂甙Rd、蝸牛酶和無菌水混合均勻，於4(TC恆溫水浴100小時，反 應底物單體人參皂甙Rd經薄層層析和液相色譜分析被證實已經轉化為產物稀有人參皂甙 IH-901。 實施例三 本發明的一種以Rd為底物製備稀有人參皂甙IH-901的方法，通過如下方案實 現 ①取1毫克提取自絞股藍的單體人參皂甙Rd於無菌的反應管內，加入1毫克國產 的蝸牛酶和1毫升無菌水； ②將單體人參皂甙Rd、蝸牛酶和無菌水混合均勻，於45t:恆溫水浴72小時，反應 底物單體人參皂甙Rd經薄層層析和液相色譜分析被證實已經轉化為產物稀有人參皂甙 IH-901。
權利要求
一種以Rd為底物製備稀有人參皂甙IH-901的方法，其特徵在於通過如下方案實現將1單位質量提取自絞股藍的單體人參皂甙Rd、0.5-1單位質量國產的蝸牛酶和1單位體積無菌水混合均勻，於30-45℃下保溫72-120小時之後，便可將單體人參皂甙Rd轉化為稀有人參皂甙IH-901。
全文摘要
本發明公開了一種以Rd為底物製備稀有人參皂甙IH-901的方法，通過如下方案實現將1單位質量提取自絞股藍的單體人參皂甙Rd、0.5-1單位質量國產的蝸牛酶和1單位體積無菌水混合均勻，於30-45℃下保溫72-120小時之後，便可將單體人參皂甙Rd轉化為稀有人參皂甙IH-901。本發明的製備稀有人參皂甙IH-901的方法，以提取自絞股藍的單一人參皂甙Rd為反應底物，反應的酶為廉價的國產蝸牛酶，反應後的體系中成分簡單，後續的產物提取非常簡單。由於絞股藍中單體人參皂甙Rd的含量是人參中的8倍，與現有技術相比，本發明的製備方法，採用的原料為在廉價的絞股藍中含量很高的單體人參皂甙Rd，採用的酶為廉價的國產蝸牛酶，採用的反應介質為無菌水，具有成本低，以及反應結束後體系中成分簡單有利於產物提取等優點。
文檔編號C12P33/20GK101768619SQ20101011376
公開日2010年7月7日 申請日期2010年2月10日 優先權日2010年2月10日
發明者林毅 申請人:華僑大學