Attractin(Atrn)和Attractinlike1(AtrnL1)基因雙敲除小鼠心臟病模型的製作方法

2023-05-13 17:24:36

專利名稱：Attractin(Atrn)和Attractin like 1(AtrnL1)基因雙敲除小鼠心臟病模型的製作方法
技術領域：
本發明涉及用基因敲除的方法建立Attractin like 1 (atrnLl)基因敲除小鼠， 並把它和Attractir^atrn)自然突變的小鼠雜交，得到雙基因敲除，即基因為atrn-/-; atrnLl-/"的小鼠，這種動物除了有象atrn-/- ；atrn-/-小鼠一樣的中樞神經系統海綿狀空泡變性，它們的心臟也出現了嚴重的病變。本發明為我們研究人的心臟病的發病機理、抗心臟病藥物篩選和心臟疾病的治療方法提供了一個非常有價值的動物模型。本發明還涉及所述的基因在心臟病變發生中的作用。
背景技術：
Attractin基因變異的小鼠也被稱為Mahogany，首先被用作描寫Agouti小鼠基因變異所引起的毛髮顏色的改變現象。近來定位克隆mahogany小鼠的變異基因，發現它們是一個由14 個胺基酸組成的富含胱氨酸的I型跨膜蛋白，具有一個很大的細胞外微區，跨膜微區和一個較小的細胞內微區。細胞外微區具有軸突誘導和細胞粘連分子的特徵； 目前我們還不了解細胞內微區的具體功能。Duke-Cohan和他的同事在人體血漿內發現和 Mahogany細胞外微區相似的分泌性糖蛋白，在體外能激活T淋巴細胞和單核細胞之間的相互作用，因而命名為吸引素(Attractin，Atrn)。進一步研究發現人體能夠產生二種Atrn蛋白一種是和小鼠的Mahogany分子非常相似的I型跨膜蛋白，這種Atrn的組織分布和小鼠的Mahogany —樣，包括腦，心，胃，肺，腎和睪丸；而另一種則是沒有跨膜和細胞內微區的分泌型Atrn，它們的分布則更為廣泛，幾乎表達於所有受檢組織內。由於結構的相似，所以小鼠的Mahogany亦被稱之為Atrn。I. Atrn在免疫系統中的作用實驗證明，Atrn能夠介導單核細胞和T淋巴細胞之間的結合反應，而這並非通過簡單的連接作用，其作用機制還不太清楚。當T淋巴細胞向單核細胞運動時，單核細胞還處於靜止狀態。這可能是由於atrn能穩定和維持細胞外的單核細胞到T淋巴細胞的趨化性， 也可能是通過某些趨化因子，或atrn本身和細胞外的基質成分相互結合而形成的一種趨化作用。II. Atrn在毛髮色素信息調控系統方面的作用機制根據Atrn的結構特點，它們可能在細胞-細胞之間的相互反應中發揮重要作用， 但我們現在對它們特異的生物化學功能還知之甚少。Mahogany變異首先是由於它能改變 Agouti小鼠的毛髮顏色而被認知的。黑色素的信號傳導通路為探討Atrn的作用提供了一個較好的系統，使我們能利用現代遺傳學、分子生物學和生物化學的方法著手研究Atrn的多方面生物學功能。在正常毛髮生長過程中，黑色素細胞刺激素(a -melanocyte stimulating hormone, α -MSH)作用於黑色素細胞的膜受體(melanocortin-lrec印tor，Mclr)，一個與G蛋白偶聯的具有7個
3垮膜微區的細胞膜受體，激活腺苷酸環化酶，使細胞內的cAMP升高，從而產生黑色素。正常的C;3h/fej小鼠毛髮是Agouti顏色(棕黃色)，Agouti等位基因A在毛髮生長過程中能夠短暫地表達Agouti蛋白，作用於黑色素細胞表面的受體Mclr，降低細胞內的cAMP的水平，在黑色素細胞合成黑色素的的某個階段暫時抑制黑色素的產生，轉而合成黃色色素，然後在合成黑色素，從而產生一種特有的毛髮，即在黑色毛髮的毛尖下端的一段呈黃色，從而使小鼠整體上看來呈現棕黃色。然而，在喪失了 atrn基因變異的小鼠，Agouti 失去了產生黃色色素的功能，因此小鼠的毛髮呈黑色，所以Atrn基因自然丟失的小鼠被稱為 Mahogany。我們用轉基因的方法，能在小鼠黑色素細胞特異性地表達atrn，能糾正 atrn, _/_小鼠的表型，這亦提示它是Mclr的一個低親和力的複合受體。利用生物化學的方法在體外去檢查atrn和Agouti蛋白之間的相互反應，發現Agouti蛋白的N-端能夠和 atrn相結合，而C-端則和Mclr有一定的親和力。這個研究結果從分子水平為Atrn在色素改變中的作用提供了解釋。從遺傳學角度來說，在毛髮色素信息調控系統中，Atrn位於 Agouti和MClR之間。總之，這些發現顯示，在黑色素細胞，Atrn是Agouti蛋白的輔助受體。III. Atrn與能量平衡的調節位於下丘腦的一個調節中心的作用和色素轉換的調控非常相似，它們主要控制能量代謝的平衡。α -MSH作用於下丘腦神經元的膜受體Mc4r (melanocortin-4receptor)，能夠降低能量的攝取。而Agrp (Agouti Related Protein)則能夠通過作用於神經細胞膜受體Mc4r，增加能量的攝取。Mc4r喪失功能(Mc4r+)或Agrp的異位高表達都可以引起一種和Ay小鼠相似的肥胖綜合症。因為在體外Agouti能夠作為Mclr和Mc4r的拮抗劑，從而導致一種假設Ay小鼠的肥胖是由於Agouti蛋白在下丘腦的異位表達，模擬Agrp的作用所致。正常情況下，Agouti蛋白僅表達於皮膚，毛囊的真皮乳頭細胞分泌的Agouti蛋白是一種細胞旁的信息分子，能夠使黑色素細胞產生黃色素，並只影響毛髮的顏色。但是，如果它們在腦組織的異常表達能夠模擬Agrp的作用，刺激能量調節中樞神經細胞的受體Mclr，則能引起肥胖。Atrn在飲食和能量平衡方面的作用來源於對Ay小鼠的研究。用atrn變異小鼠和 Ay小鼠交配，純合子Ay小鼠的atrn基因喪失功能後，它們的毛髮由黃色變成棕黑色，而且也不再肥胖。因此，Atrn的丟失抑制了異位表達的Agouti在體重和色素方面的效果；但如果用atrn小鼠和Mclr或Mc4r變異的小鼠交配，則atrn基因喪失功能後並不影響Mclr和 Mc4r變異的小鼠在色素和肥胖方面的表型。所以從遺傳學的角度來說，在色素和能量平衡的調節通路上，Atrn位於Agouti的下遊，而在Mclr和Mc4r的上遊。Agouti蛋白和AGRP 羧基端的胺基酸序列是基本相似的，Agouti蛋白的氨基端能夠和吸引素細胞外微區特異性地結合，而AGRP則不能與吸引素起反應。與這些結果相一致，我們發現Atrn喪失功能可完全地抑制Agouti引起的肥胖，但是對AGRP所誘導的肥胖則沒有效果。IV. Atrn變異所致的動物神經變性在進行的廣泛組織學研究中，出人意料地發現Atrn喪失功能突變的動物具有進行性中樞神經系統的海綿狀變性，其腦組織有廣泛的空泡變和神經元的喪失，它們的組織學特徵和朊蛋白有關的疾病非常相似。
在最初研究Atrn變異小鼠時，我們曾報導腦組織的灰質和白質有空泡樣變，尤以腦幹、小腦髓質和顆粒層、延腦、丘腦、海馬(CA2和CA!3)、尾狀核和蒼白球為明顯，軀體感覺的大腦皮質和脊髓的灰質更為嚴重。最近，我們發現空泡變開始出現於皮質的深層，在疾病的較晚階段逐漸發展到白質。Atrn變異小鼠的神經變性伴隨著行為的異常年幼的小鼠有時出現輕微的震顫，較年老的小鼠活動過度，某些種族的小鼠Atrn變異會導致神經肌肉衰弱及共濟失調。

發明內容
心臟疾病是目前威脅人類健康的最主要的疾病之一，心臟病作為全球高致病率、 高死亡率的疾病，很大程度上是由不良的生活習慣造成的。食用脂肪過多、缺乏運動和吸菸會使動脈血管中的有害膽固醇含量上升，這些膽固醇附著在血管壁上，會引起人體自然的免疫反應，使血管壁發炎腫脹造成動脈硬化，切斷流向心臟的動脈血供應，從而引發心臟病。為了更好的防治心臟病，我們必須有很好的動物模型，目前所用的最多的動物模型是手術結紮，部分梗阻冠狀動脈的分支以造成心肌的局部缺血，這種模型的缺點顯而易見。為了更有效地提供心臟病研發、防治所需要的動物模型，克服現有動物模型的缺陷，本發明通過發明者的創造性研究，提供了一種不僅能夠大量、而且病變穩定的基因敲除小鼠的心臟病的動物模型。本發明的第一個方面，是Atrn基因自然丟失的小鼠作為生產小鼠心臟病模型的基礎，如果沒有atrn基因的變異，和對照組的小鼠相比較，僅僅atrn Ll基因的敲除沒有任何異常的表現型；在本發明的實施方案中，只有atrn和atrnLl兩個基因完全丟失，才能產生小鼠的心臟的異常，儘管atrn小鼠有許多其他的異常的表型，如中樞神經系統的變性等。在本發明中，我們發現利用atrn和atrn Ll的雙基因丟失的小鼠作為心臟病的動物模型，是建立在C3H/Fej種系小鼠的背景上。糾正實驗中，表達atrn或atrn Ll都可以糾正小鼠心臟的病變。^X本發明所述術語「雙基因敲除小鼠」是指atrn和atrn Ll兩個基因都完全丟失的小鼠；「小鼠的心臟病模型」指這兩個基因丟失的小鼠的心臟發生的病變即早期的心肌細胞壞死、鈣沉積而導致的心肌鈣化、左心室和室間隔肥大，心力衰竭等心臟病變; "atrn-/-"是指小鼠完全失去的atrn基因；「atrn-/- ；atrn Ll-/- 「指這兩種基因都完全丟失的小鼠。本發明所述術語「對照組」指正常的C3H/Fej種系的小鼠。小鼠心臟病變的建立具體實施方法1，建立小鼠的心臟病的模型必須要有l)atrn基因自然丟失的小鼠，從美國的Jackson lab訂購；2) atrn Ll基因敲除的小鼠，我們用IRES-LacZ-Neo取代了 atrn Ll基因的外顯子2，從而敲除了小鼠的這個基因，建立了 atrn Ll缺失的小鼠系，敲除基因的質粒如圖1所示；3)雜交這兩個系的小鼠，以得到這兩個基因都完全丟失的小鼠系，由於這種小鼠失去了生殖的能力，所以必須用雜合子atrn-/-;atrn Ll+/-來交配來維持種系。2，這種模型要建立在C3h/Fej小鼠的品繫上。心臟病變的發牛及結構說明1，雜交atrn-/-;atrn Ll+/-所得到的子代(Fl)小鼠，它們的基因型有可能是 atrn-/" ；atrnLl，_/_(25% ), atrn-/" ；atrnLl+/"(50% )禾口 atrri_/_ ；atrnLl+/+ (25% )。 其中僅僅基因atrn-/- ；atrnLl, -/-(25% )的小鼠呈現心臟病變。2，在心臟的大體標本，4周的小鼠呈現心臟病變，無一例外的左心室的左上後方可以看到一個病灶，呈白色小灶狀。然後逐漸地迅速向周圍延伸，在40天左右累及整個左心室和室間隔，和右心室(2個月)，從而導致心臟衰竭(圖2)。3，組織學，3周左右開始出現個別心肌細胞的壞死，炎症細胞侵潤，鈣化及纖維化 (圖幻。電子顯微鏡下顯示心肌纖維之間大量的線粒體堆積，水腫和巨大線粒體(圖4)。


圖1 =AtrnLl基因敲除小鼠的質粒，A 敲除atrnLl基因的質粒；B Southern blot 顯示clone 3的atrn Ll被敲除；C :atrn Ll敲除小鼠被敲除的基因和蛋白序列。圖2:Atrn和Atrn L 1雙基因敲除小鼠的心臟，左心室左後靠心房的部分壞死，纖維化，呈現白色的版塊狀；左上心臟前面觀，右上背面觀(6x)，左下Gx)和右下(IOx) 心室的橫斷面。圖3 40天的Atrn和Atrn L 1雙基因敲除小鼠的心臟，左心室肌纖維壞死，纖維化，炎細胞侵潤和鈣鹽沉積。上圖40x，左下圖ΙΟΟχ，右下圖，200x。圖4，Atrn和AtrnLl小鼠心肌病變的電鏡下改變左上圖未正常對照，其他顯示心
肌纖維變形，之間堆滿線粒體，右的線粒體腫脹，形成巨大線粒體。
權利要求
1.為了獲得Attractin(atrn)和Attractinlike 1 (atrn Li)基因雙敲除小鼠心臟病的模型，必須是經過如下步驟第一步，購買atrn-/-自然突變的小鼠，其基本特徵是此小鼠的種系背景是C3h/fej， 2-3個月時開始在腦組織內出現海綿狀變性；第二步，設計atrnLl基因敲除小鼠的質粒，其分子結構具有附圖IA所示的特徵；第三步，轉染atrnLl質粒進入小鼠的胚胎幹細胞(ES) 內，並篩選正常的atrn Ll基因被敲除的ES細胞。第四步，用這種ES細胞生產atrn Ll基因敲除的小鼠，傳代獲得atrn Ll-/-的純合子小鼠。第五步，雜交atrn和atrn Ll基因敲除的小鼠，獲得雙基因敲除的小鼠，即心臟病模型小鼠。
2.如權利要求1所述，atrn自然突變小鼠，用於心臟病動物心臟病的模型製作。
3.如權利要求1所述，atrnLl基因敲除小鼠的質粒，其分子結構具有附圖IA所示的特徵。
4.如權利要求1所述，轉染atrnLl質粒進入小鼠的胚胎幹細胞(ES)內，並篩選正卻的 atrn Ll基因被敲除的ES細胞，其DNA雜交結構如附圖1B，第3株ES細胞所示。
5.如權利要求1所述，用這種ES細胞生產atrnLl基因敲除的小鼠，傳代獲得atrn Ll-/-的純合子小鼠。
6.如權利要求1所述，雜交atrn和atrnLl基因敲除的小鼠，獲得雙基因敲除的小鼠， 即心臟病模型小鼠。
7.權利要求1-6中任一權利要求所述的任何步驟和產物，在製備各種動物心臟病模型的作用和用途。
全文摘要
Attractin和Attractin like 1基因雙敲除小鼠心臟病模型本發明在世界上首次建立了Attractin like 1(atrnL1)基因敲除小鼠，把這種小鼠和Attractin(atrn)自然突變的小鼠雜交，其後代中雙基因敲除，即基因為atrn-/-；atrnL1-/-的小鼠的中樞神經系統海綿狀空泡變性和atrn-/-；atrn-/-小鼠一樣，沒有明顯加重的變化，但這種小鼠的心臟出現了嚴重的病變。本發明為我們研究人的心臟病的發病機理、治療方法和抗心臟病藥物篩選提供了一個非常有價值的動物模型。本發明還涉及所述的基因在心臟病變發生中的作用。
文檔編號C12N15/85GK102399817SQ20101027926
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月13日 優先權日2010年9月13日
發明者沈士亮, 沈贊 申請人:上海眾申生物科技有限公司