β－抑制蛋白在製備治療表觀遺傳相關疾病的藥物中的應用的製作方法
2023-05-16 06:14:56
專利名稱：β－抑制蛋白在製備治療表觀遺傳相關疾病的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及人β-抑制蛋白在製備用於與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病的藥物中的應用。
背景技術：
最近的研究發現，人類許多疾病都與表觀遺傳調節紊亂有關，表觀遺傳治療將成為解決這些疾病的有效手段。而且，目前已經有許多這樣的製劑在進行臨床前期研究(Egger等.Nature 2004；429457-463)。組蛋白乙醯化修飾在表觀遺傳調節中作用重大，被譽為真核生物基因轉錄的早期開關(Grewal等.Science 2003；301798-802；Fry等.Science 2002；2951847-1848)。
近來的研究發現，組蛋白乙醯化水平降低是細胞癌變及許多神經系統疾病的重要病因，能促進組蛋白乙醯化水平升高的製劑已經被認為是治療這些疾病的新型製劑(Archer等.Curr Opin Genet Develop 1999；9171-174；Egger等.Nature 2004；429457-463)。體內有兩種酶調控著組蛋白的乙醯化水平，分別為組蛋白乙醯化酶及組蛋白去乙醯化酶。體內調節組蛋白乙醯化水平的方式有兩種，一種是通過影響組蛋白乙醯化酶或組蛋白去乙醯化酶的活性，另一種是通過影響二者和組蛋白的接觸。值得注意的是，目前用於臨床試驗的影響組蛋白乙醯化的製劑都是組蛋白去乙醯化酶的抑制劑，雖然這些製劑有明確的抗癌作用，但它們幾乎抑制了體內全部組蛋白去乙醯化酶的活性。無庸置疑，這樣的製劑對正常細胞組蛋白乙醯化水平造成很大影響，做成藥以後會產生很大的副作用。實際上，這些製劑作用的非特異性是限制其成藥的關鍵。
因此，迫切需要尋找一種理想的組蛋白乙醯化促進劑。這種新型製劑不會影響體內整體組蛋白乙醯化酶或組蛋白去乙醯化酶的活性，但可以區域特異地促進組蛋白乙醯化水平，尤其是影響疾病相關基因所在區域的組蛋白乙醯化水平，從而達到理想的治病效果。
發明內容
為解決上述問題，本發明者進行了深入的研究，結果發現β-抑制蛋白1可以解決上述問題。
本發明第一方面涉及β-抑制蛋白1、其核酸序列、含有該核酸序列的構建物在製備用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病中的應用。在較佳的實施方案中，所述與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病是癌症、神經系統疾病或表觀遺傳疾病。
本發明第二方面涉及DOR受體激動劑或KOR受體激動劑在製備用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病中的應用。在較佳的實施方案中，所述與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病是癌症、神經系統疾病或表觀遺傳疾病。在另一較佳的實施方案中，所述DOR受體激動劑選自[D-Pen2，D-Pen5]腦啡肽(DPDPE)、(D-Ala2，D-Leu5)腦啡肽(DADLE)或δ啡肽-I。
本發明還有一個方面涉及一種用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病藥物組合物，所述組合物包含有效量的至少一種選自β-抑制蛋白1、β-抑制蛋白1的核酸序列、含有所述核酸序列的構建物、δ阿片受體激動劑或κ阿片受體激動劑的物質作為活性組分，以及藥學上可接受的載體。
本發明另一方面還提供了一種從候選物質中篩選出治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病的藥物的方法，該方法包括a)使所述候選物質與表達β-抑制蛋白1的細胞接觸；b)鑑定β-抑制蛋白1在所述細胞的細胞核內的表達水平，並將該表達水平與未接觸所述候選物質的細胞的細胞核內β-抑制蛋白1表達水平相比較；c)選出使細胞核內β-抑制蛋白1表達水平提高的物質作為所述治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病的藥物。
經過研究，本發明者發現β-抑制蛋白1(β-arrestin1)可以很好地促進體內組蛋白乙醯化的水平，但不會影響整體組蛋白乙醯化酶或組蛋白去乙醯化酶的活性。它影響組蛋白乙醯化的方式是通過影響某些組蛋白乙醯化酶在特定染色質區域(例如可以抑制癌細胞增殖的p27基因)的富集來實現的，因此對組蛋白乙醯化水平的影響比組蛋白去乙醯化酶抑制劑要小得多，且有一定的基因特異性。可見，β-抑制蛋白1是一種新穎的靶向性組蛋白乙醯化促進者，在癌症及其他表觀遺傳疾病的治療方面極有前途。本發明的其它目的和優點可以通過下文的詳細描述和具體實施例來獲知。
圖1顯示了胞核βarr1促進了組蛋白H4乙醯化。圖A顯示了從HeLa細胞分離出組蛋白；βarrs+/+，βarrs-/-，或βarrs-/-MEF細胞瞬時表達所示質粒(圖B)；用不同的乙醯化(Ac)組蛋白抗體對等份樣品(6微克)進行Western印跡。另外還測定組蛋白H4的量，以確認每個泳道中有等量的組蛋白。對Western結果進行定量，標準化成組蛋白H4蛋白，圖中顯示了三個獨立試驗的H4、H4K12和H4K16乙醯化平均值。*P＜0.05，**P＜0.01(相對於對照組)。
圖2顯示了βarr1的核聚集促進了p27和c-fos啟動子處組蛋白H4的乙醯化。用抗乙醯化H4(H4Ac)、H3(H3Ac)、βarr1和人或小鼠IgG(作為陰性對照)的抗體進行ChIp實驗。經qPCR分析，輸入的DNA以及抗體結合染色質區段的回收物中存在p27、c-fos和c-jun啟動子序列。將獲得的數據歸一化成對應的輸入對照。採用了相同啟動子的不同區域的引物組，獲得了類似的結果。所示數據是每組引物的三個獨立實驗的平均值。圖A表達所示質粒的HeLa(左)和βarrs-/-MEF(右)細胞。NSD表示未檢測到信號。圖B在1μM DP中培育所示時間的單表達DOR的HeLa細胞。圖C用或不用100nM Na1處理表達DOR或DOR和βarr1 siRNA的HeLa細胞5分鐘，然後用1μM DP培育60分鐘。圖D染色質-蛋白結合試驗。對全細胞裂解液(WCE)離心，沉澱(Crude Pel)用微球菌核酸酶(Mnase)處理，再次離心。所得上清(Mnase Sup)進行超離心，獲得沉澱(Ultra Pel)和上清(Ultra Sup)。用所示抗體對樣品進行Western分析。染色質結合蛋白H4和p300和胞液蛋白微管蛋白和βarr1 Q394L作為對照。圖E，在HeLa細胞中瞬時表達的野生型和突變型βarr1的核分布及其對H4乙醯化和基因轉錄的效果。在共聚焦顯微鏡下觀察到βarr1-HA轉核。用ChIP試驗測得p27啟動子區域內H4乙醯化。用RT-qPCR分析p27的轉錄。數據取自三個獨立試驗，*p＜0.05，**p＜0.01(對應於對照)。
圖3顯示了βarr1對HAT、HDAC和CREB活性的影響。圖A測定純化的βarr1、免疫沉澱的3′HA-βarr1和5′HA-βarr1蛋白的潛在HAT活性。組蛋白乙醯轉移酶PCAF(0.1μg)作為陽性對照。圖B、C從HeLa細胞的全細胞勻漿物提取HAT和HDAC粗製物，測定不同量的GST-βarr1和免疫沉澱的3′HA-和5′-HA βarr1蛋白存在下的體外組蛋白乙醯化(B)和去乙醯化(C)。分別用600μM NiCl2和100nM TSA作為對照。圖D在100nMTSA和25μM sirtinol(STN)存在或不存在下，分析βarrs-/-MEF中βarr1對p27和c-fos啟動子區域中的組蛋白H4乙醯化的影響。對p27和c-fos啟動子中的H4乙醯化水平進行定量，根據對應的輸入值標準化。圖E用GAL4-CREB報導質粒(左)和CREB-螢光素酶報導質粒(右)單獨或與不同量的所示βarr1質粒一起轉染6孔板中的細胞，數據表示成相對於對照的誘導倍數。用10μM福斯高林作(FK)作為陽性對照。數據來自三個獨立實驗。**p＜0.01(相對於對應的對照)。
圖4顯示了βarr1將p300募集到p27和c-fos啟動子區域。圖A和B用抗p300、CBP、Tip60和人或小鼠IgG(作為陰性對照)進行ChIP實驗。經qPCR分析，輸入的DNA以及抗體結合染色質區段的回收物中存在p27、c-fos和c-jun啟動子序列。將獲得的數據歸一化成對應的輸入值。所示數據是每組引物的三個獨立實驗的平均值。*p＜0.05，**p＜0.01(對應於對照)。圖A表達所示質粒的HeLa(左)和βarrs-/-MEF(右)細胞。圖B在1μM DP中培育所示時間的表達DOR的HeLa細胞(上圖)。用或不用100nM Nal處理表達DOR或DOR和βarr1 siRNA的HeLa細胞5分鐘，然後用1μM DP培育60分鐘(中圖和下圖)。圖C使HeLa胞核提取物和p300或βarr抗體免疫沉澱，然後用抗p300或βarr的抗體對免疫複合物進行Western分析。5％總胞核提取物作為對照。
圖5顯示了βarr1-介導的人成神經細胞瘤細胞中基因轉錄的調節。圖A用1μMDP、1μM DADLE(DA)或1μMδ-啡肽-I(DEL)培育內源表達DOR和βarr1的SK細胞所示時間。在右圖中，細胞預先用或未用100nM Na1處理5分鐘，然後用1μM DP培育20分鐘。用Western分析胞核提取物中的βarr1含量並定量。圖B，在用或未用100nM Na1處理5分鐘後，使轉染或未轉染βarr1 siRNA的SK細胞在1μM DP中培育所示時間(左)或60分鐘(中和右)。用ChIP和RT-qPCR分析p27和c-jun啟動子處的H4Ac水平，以及p27和c-jun的轉錄水平。*p＜0.05，**p＜0.01(對應於對照)。圖C用1μM DA或1μM DEL培育SK細胞指定時間，然後用ChIP和RT-qPCR分析p27和c-jun啟動子處的H4Ac水平(左)，以及p27和c-jun的轉錄水平(右)。*p＜0.05，**p＜0.01(相對於對應組中的0分鐘對照)。圖DSK細胞經βga1，βarr1，βarr1Q394L，NSsiRNA，βarr1 siRNA，p27 siRNA或指定組合轉染，在有或沒有1μM DP和DA下培育60分鐘或在1μM DEL下培育30分鐘。測定[3H]胸苷摻入，圖中所示為來自三個獨立實驗的數據。**p＜0.01(相對於對應的對照)。
具體實施例方式
β-抑制蛋白1(基因號NM-004041)是GPCRs的重要調節蛋白，在細胞質與細胞核中都有分布。現在所知的β-抑制蛋白1的功能都是發生於細胞質或細胞質膜，其在細胞核內的功能尚無報導。本發明者研究發現激活δ阿片受體(DOR)導致β-抑制蛋白1向細胞核內轉移，導致β-抑制蛋白1在p27和c-fos基因啟動子區富集，導致這些啟動子區組蛋白H4乙醯化增加，最終促進了這些基因的轉錄。進一步研究發現，β-抑制蛋白1介導了組蛋白乙醯化酶p300在目標基因啟動子區的招募，而且這種招募是受體激活導致組蛋白乙醯化及特異基因轉錄增加所必需的。這些結果不僅展示了GPCR信號從膜到核傳遞的表觀遺傳機制，而且揭示了β-抑制蛋白1作為胞質和核間傳遞GPCR信號信使物質的核內功能。
本發明者首先用轉基因和RNA幹擾的方法影響細胞核內β-抑制蛋白1的水平，發現β-抑制蛋白1顯著提高細胞內整體組蛋白乙醯化的水平。進一步研究發現，β-抑制蛋白1對組蛋白乙醯化的調節具有基因特異性，例如它能顯著促進和細胞增殖關係極為密切的基因p27和c-fos啟動子區組蛋白H4的乙醯化，但不影響c-jun，cyclin A，及cyclin D1啟動子區組蛋白H4的乙醯化。採用GST-β抑制蛋白1和在真核細胞系中免疫沉澱得到的HA-β抑制蛋白1體外進行的組蛋白乙醯化和組蛋白去乙醯化分析表明，β抑制蛋白1既不是組蛋白乙醯化酶和組蛋白去乙醯化酶，也不影響組蛋白乙醯化酶和組蛋白去乙醯化酶的整體活性。用蛋白質--染色質結合實驗和染色質免疫共沉澱實驗發現1，β-抑制蛋白1能和染色質結合；2，在G蛋白偶聯受體如DOR，KOR等的激動劑刺激下，β-抑制蛋白1能進核Fig.1和特異染色質區結合。進一步免疫共沉澱實驗和質譜分析發現β-抑制蛋白1能結合組蛋白乙醯化酶P300。綜合這些結果說明無論何種因素引起β-抑制蛋白1在細胞核內增加，都能促進染色質特異區域的組蛋白乙醯化的水平。
因此，本發明第一方面涉及涉及β-抑制蛋白1、其核酸序列、含有該核酸序列的構建物在製備用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病中的應用。
本文所用的術語「β-抑制蛋白1」的含義中不僅包括了β-抑制蛋白1的全長序列，而且還包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似生物活性或功能的變異形式、片段、衍生物。這些變異形式包括(但並不限於)相對於所述多肽的胺基酸序列有若干個(較佳地1-10個，更佳為1-5個，最佳為1-3個)胺基酸的缺失、插入和/或取代。上述變異形式還包括上述蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異和/或不影響序列的修飾形式上的差異。本發明的術語「β-抑制蛋白1」還包括與其相同(同源)或基本上相同(同源)且有相同或相似生物活性或功能的多肽，例如，有至少60％、更佳70％、還要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的多肽。同樣，術語「β-抑制蛋白1的核酸序列」也涵蓋了能編碼所述蛋白多肽的具有相同或相似生物活性或功能的變異形式、片段、衍生物的核酸序列。包含所述核酸序列的構建物也可用於本發明。
本文所用的術語「組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病」表示可從經處理獲益的與組蛋白乙醯化水平降低相關的任何病徵，例如包括癌症、神經系統疾病或表觀遺傳疾病。「癌症」是指哺乳動物中以無控制性細胞生長為典型特徵的生理性症狀。可從本發明獲益的癌症例子包括，但不局限於，鱗狀細胞癌、肺癌、腸胃癌、胰癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳房癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌等。
本發明者還進行了基因晶片、RT-PCR、免疫印跡和染色質免疫共沉澱的實驗，結果發現引起細胞核內β-抑制蛋白1增加的因素，可以通過影響組蛋白乙醯化這種表觀遺傳修飾調節一些與細胞病變相關的重要基因如p27，c-fos的轉錄及表達。提示β-抑制蛋白1，可以引起β-抑制蛋白1核內增加的G蛋白偶聯受體如DOR，KOR(阿片受體是G蛋白偶連受體的一種，目前發現的阿片受體有三種亞型δ、μ、κ)等都有可能作為表觀遺傳疾病治療的重要分子或靶點。
本發明者還在人神經瘤細胞系SK-N-SH的試驗驗證了這種可能性。發現過表達β-抑制蛋白1或促進β-抑制蛋白1進核的刺激(DOR激動劑處理)都抑制SK-N-SH神經瘤的增殖Fig.7。提示β-抑制蛋白1，以及可以引起β-抑制蛋白1核內增加的G蛋白偶聯受體如DOR，KOR等在表觀遺傳疾病治療方面的良好前景。
因此，本發明另一方面還涉及δ阿片受體激動劑或κ阿片受體激動劑在製備用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病中的應用。
基於上述應用，本發明第三方面涉及一種用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病藥物組合物，其特徵在於，所述組合物包含有效量的至少一種選自β-抑制蛋白1、β-抑制蛋白1的核酸序列、含有所述核酸序列的構建物、δ阿片受體激動劑或κ阿片受體激動劑的物質作為活性組分，以及藥學上可接受的載體。本文所用的術語「有效量或治療有效量」指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現出可檢測的治療或預防效果的量。對於某一對象的精確有效量取決於該對象的體型和健康狀況、病症的性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對於某給定的症狀而言，可以用常規實驗來確定該有效量，臨床醫師是能夠判斷出來的。術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑(例如多肽、基因或其它治療劑)給藥的載體或賦形劑，其應當與本發明的蛋白、核苷酸序列、構建物或細胞相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物的效果。可作為藥學上可接受的載體或賦形劑或其組分的一些物質的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，如玉米澱粉和土豆澱粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤溼劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑、穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩衝液等。另外，在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關於藥學上可接受的賦形劑的充分討論。
本發明的藥物組合物可根據需要製成各種劑型，通常可將藥物組合物製成可注射劑，例如液體溶液或懸浮液；還可製成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。脂質體也包括在藥學上可接受的載體的定義中。本發明的藥物組合物可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。為了提高用藥效果，本發明的組合物也可以與其他藥物共同使用。
本發明另一方面還提供了一種從候選物質中篩選出治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病的藥物的方法，該方法包括a)使所述候選物質與表達β-抑制蛋白1的細胞接觸；b)鑑定β-抑制蛋白1在所述細胞的細胞核內的表達水平，並將該表達水平與未接觸所述候選物質的所述細胞的細胞核內β-抑制蛋白1表達水平相比較；c)選出使細胞核內β-抑制蛋白1表達水平提高的物質作為所述治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病的藥物。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。除非另有描述，本發明的實施將採用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，這些均是本領域技術人員所知的。這些技術在下列文獻中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯.1984)；《蛋白質純化原理和實踐》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《實驗免疫學手冊》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯1986)。或者，可按照試劑生產商所提供的說明書進行。
實施例1材料與方法1.1抗體與試劑β-抑制蛋白1鼠抗，p27及c-Jun抗體購自BD Biosciences(San Jose，CA)。β-抑制蛋白多克隆兔抗為Robert J.Lefkowitz(Duke University Medical Center，Durham)所贈。p300 CT，CBP，組蛋白H4，乙醯化組蛋白H4及H3抗體購自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)。針對HA-tag的鼠抗12CA5購自Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)。Tip60抗體購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。CREB抗體購自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)。德克薩斯紅偶聯山羊抗鼠IgG和FITC偶聯山羊抗兔IgG購自Jackson Immunoresearch(West Grove，PA)。IRDyeTM800CW偶聯的親合純化抗小鼠IgG和抗兔IgG購自Rockland Inc.(Gilbertsville，PA)。以下抗體均購自Sigma(Saint Louis，MO)HA兔抗，actin兔抗，Flag，tubulin鼠抗和SP-1兔抗。雙螢光素酶報告基因系統試劑盒購自Promega(Madison，WI)。以下試劑購自Sigma(Saint Louis，MO)異丙(去甲)腎上腺素(isoproterenol)，[D-Pen2，D-Pen5]腦啡肽(DPDPE)，(D-Ala 2，D-Leu 5)腦啡肽(DADLE)，U69593，forskolin，naltrindole。Δ啡肽-I購自BACHEM California Inc(Torrance，CA)。
1.2細胞培養與轉染HEK-293細胞，SK-N-SH細胞和HeLa細胞購自American Type Culture Collection(Rockville，MD)。用添加10％加熱滅活胎牛血清的MEM培養基(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)培養。細胞培養在37℃，5％CO2培養箱中。在培養20小時後，HEK-293細胞用磷酸鈣轉染法轉染，方法見(Kang，J.，等(2003).Toxicol Sci 74，279-286.)。對HeLa細胞用脂質體(Invitrogen，Carlsbad，CA)轉染，方法見Invitrogen公司標準操作規程。野生型和βarr1/2雙敲除(βarrs-/-)鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)由Dr.Robert J.Lefkowitz(Duke University Medical Center，Durham)饋贈，用DMEMmedium(Gibco-BRL)培養，脂質體2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)轉染。
1.3質粒構建β-抑制蛋白1與β-抑制蛋白1的缺失突變體都裝在pcDNA 3.0載體中，HA-tag位於3』端。p300質粒購自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)。
1.4雷射共聚焦螢光顯微鏡觀察細胞轉染後44小時，換無血清的MEM培養液於37℃預孵育2小時。隨後加入激動劑，在37℃預孵育5分鐘，PBS洗滌。使用4％多聚甲醛室溫固定15分鐘，然後在1％BSA/PBS中室溫封閉1小時。封閉結束後，細胞與12CA5(1μg/ml)在1％BSA/PBS中室溫孵育1.5小時，用PBS洗滌，加入Texas-Red標記的二抗室溫孵育1小時，PBS洗滌，最後加50％甘油將蓋玻片置於載玻片上，封片後4℃避光保存。GFP的激發波長為488nm，測定波長515-540nm，Texas-Red的激發波長為543nm，測定波長590nm。TCS NT雷射共聚焦顯微鏡記錄掃描圖像(Leica Microsystems，Bensheim，Germany)。在進行活細胞實時觀察時，細胞轉染後44小時，換無血清的MEM培養液於37℃預孵育2小時。在控溫罩中使用雷射共聚焦顯微鏡實時觀察。首先掃描未刺激前的圖象，加入激動劑後觀測同一層面細胞的變化並實時掃描記錄。然後，在掃描的圖象中選取同一細胞的核、胞漿及胞膜的某一固定區域進行螢光強度分析。螢光強度分析軟體由Leica公司提供。
1.5細胞核的製備製備核抽提物，根據已報導過的方法(Neves，S.R.，Ram，P.T.，和Iyengar，R.(2002).Science 296，1636-1639.)，略有改動，簡述如下細胞無血清飢餓12小時後，與1μM DPDPE共孵育不同時間點；用4℃預冷的PBS(pH7.4)洗一遍，再用400μl緩衝液(含有10mM HEPES，pH7.9，10mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF)重懸；冰上孵育10分鐘後，若為HEK293細胞或SK細胞，則加入3μl1％NP-40，若為HeLa細胞則加入3μl10％NP-40，輕輕混勻，冰上放置5分鐘；13000g離心1分鐘。所得上清為細胞質提取物，沉澱部分為細胞核；細胞核用低滲緩衝液洗3遍，然後加入高滲緩衝液(含有20mMHEPES，pH7.9，25％甘油，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，和100μg/ml PMSF)於4℃裂解1小時；13000g離心1分鐘。所獲上清即為核抽提物。用Bradford法測定蛋白濃度後，用SDS-PAGE膠分離。SP-1作為內參，表明所加不同時間點樣品的核蛋白量一致；另外，也作為提核試驗過程中核蛋白的指示蛋白，顯示在抽提過程條件下核蛋白沒有外瀉。Tubulin也作為內參，表明所加不同時間點樣品的胞質蛋白量一致；另外，也作為提核試驗過程中胞質蛋白的指示蛋白，顯示在抽提過程條件下所提出的核沒有胞質蛋白汙染。
1.6Western免疫印跡法核提取物或者細胞裂解液，超聲5分鐘，95℃水浴中變性10分鐘，取約50μg蛋白樣品於10％SDS聚丙烯醯胺凝膠中電泳分離，電泳完畢取出凝膠，將蛋白質電泳轉移至硝酸纖維素膜上，將膜置於用TBST緩衝液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl pH7.4，0.2％Tween-20)配製的10％脫脂牛奶中室溫封閉1小時，之後與特異的一抗和二抗孵育(抗體用TBST緩衝液稀釋，一抗與二抗反應之後用TBST緩衝液洗膜三次，每次10分鐘)，並用ECL試劑盒檢測。
1.7報告基因分析採用Promega公司試劑盒並按所提供的實驗方法進行。以12孔培養板培養HEK293細胞，轉染CREB-luc(0.1μg/孔)和RL-tk-luc(0.2μg/孔，作為對照)，共轉或不共轉βarr1(0.1，0.2，0.4，0.8μg/孔)，並用pcDNA3-βga1補齊質粒的量。轉染44小時後換無血清的MEM培養液，繼續在37℃孵育2小時。然後加入無血清的MEM配製的激動劑(Forsklin10μM)繼續37℃孵育6小時。1×PBS洗滌細胞後，用Promega公司提供的雙螢光素酶報告基因試劑盒中的passive lysis buffer 100μl室溫裂解20分鐘。取5μl細胞裂解液與同體積的底物(試劑盒提供)反應，使用光度計檢測。剩餘樣品用Western免疫印跡法檢測蛋白表達量。
1.8免疫沉澱法細胞用4℃預冷的PBS(pH7.4)洗一遍，再用裂解緩衝液(包含50mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，150mM NaCl，20mM NaF，1％Triton-X100，10％甘油，1mM苯甲基磺醯氯，1x蛋白酶抑制劑混合物(Roche Molecular Biochemicals)於4℃裂解2小時。13000g離心15分鐘。取上清與p300抗體，CREB抗體，β抑制蛋白s抗體或HA抗體在4℃旋轉孵育4小時。加入蛋白G(Amersham Biosciences)，再旋轉孵育1小時。離心後，珠子用裂解緩衝液洗滌3次，加入SDS上樣緩衝液，在50℃水浴20分鐘。蛋白用SDS-PAGE膠分離。根據抗體說明書推薦的步驟及滴度用Western印記法檢測。
1.9RT-PCR抽提HeLa、SK、D2P細胞及小鼠海馬、大腦前額頁皮層的總RNA。用定量RT-PCR的方法檢測細胞中p27，c-fos，c-jun，cyclinA和cyclinD1 mRNA的表達水平。使用引物如下所列在HeLa及SK細胞中，HPRT-有義，5』-CCT GCT GGA TTA CAT CAA AGCACT G-3』(SEQ ID NO1)，反義，5』-TCC AAC ACT TCG TGG GGT CCT-3』(SEQ IDNO2)；p27-有義，5』-GTT AAC CCG GGA CTT GGA GA-3』(SEQ ID NO3)，反義，5』-CAC AGA ACC GGC ATT TGG GGA ACC-3』(SEQ ID NO4)；c-fos-有義，5』-CTCCAG TGC CAA CTT CAT TC-3』(SEQ ID NO5)，反義，5』-CAG CCA TCT TAT TCCTTT CC-3』(SEQ ID NO6)；c-jun-有義，5』-GCA TGA GGA ACC GCA TCG CTG CCTCCA AGT-3』(SEQ ID NO7)，反義，5』-GCG ACC AAG TCC TTC CCA CTC GTGCAC ACT-3』(SEQ ID NO8)；cyclin A-有義，5』-TTA GGG AAA TGG AGG TTA-3』(SEQ ID NO9)，反義，5』-TAG TTC ACA GCC AAA TGC-3』(SEQ ID NO10)；cyclinDl-有義，5』-GAA CAG AAG TGC GAG GAG GAG-3』(SEQ ID NO11)，反義，5』-AGG CGG TAG TAG GAC AGG AAG-3』(SEQ ID NO12)。在βarrs-/-MEFs及鼠腦組織中，HPRT-有義，5』-CCT GCT GGA TTA CAT TAA AGC ACT G-3』(SEQ ID NO13)，反義，5』-TTC AAC ACT TCG AGA GGT CCT-3』(SEQ ID NO14)；TBP-有義，5』-TGCACA GGA GCC AAG AGT GAA-3』(SEQ ID NO15)，反義，5』-CAC ATC ACA GCTCCC CAC CA-3』(SEQ ID NO16)，p27-有義，5』-CAG CTT GCC CGA GTT CTA C-3』(SEQ ID NO17)，反義，5』-CCG GGC TTC TTG GGC GTC TGC T-3』(SEQ ID NO18)；c-fos-有義，5』-CGA AGG GAA CGG AAT AAG-3』(SEQ ID NO19)，反義，5』-CTCTGG GAA GCC AAG GTC-3』(SEQ ID NO20)；c-jun-有義，5』-CTT CTA CGA CGATGC CCT CA-3』(SEQ ID NO21)，反義，5』-GAA GCG TGT TCT GGC TAT GC-3』(SEQ ID NO22)；cyclin A-有義，5』-CCG CCC GAC GTG GAT GAG-3』(SEQ ID NO23)，反義，5』-CTG CGG TCG ATG GGG GAT ACT-3』(SEQ ID NO24)；cyclin D1-有義，5』-TCC CGC TGG CCA TGA ACT ACC-3』(SEQ ID NO25)，反義，5』-GGC GCAGGC TTG ACT CCA GAA-3』(SEQ ID NO26)。
1.10染色質免疫沉澱(ChIP)染色質免疫沉澱按Upstate Biology公司提供的標準方法。用quantitative PCR的方法檢測細胞中p27，c-fos，c-jun，cyclinA和cyclinD1基因啟動子區βarr1，p300，CBP，Tip60，組蛋白H4，乙醯化組蛋H3及H4的富集程度。使用引物如下所列在HeLa及SK細胞中，p27啟動子-有義，5』-GCT CCC GCC GCC GCA ACC AAT-3』(SEQ IDNO27)；反義，5』-CGA ACC CAG CCG CTC TCC AAA CC-3』(SEQ ID NO28)；c-fos啟動子-有義，5』-ATT AGG ACA CGC GCC AAG GC-3』(SEQ ID NO29)，反義，5』-ACG GTC ACT GCT CGT TCG CT-3』(SEQ ID NO30)；c-jun啟動子-有義，5』-GGGCGG GCC GGG AAA AAC-3』(SEQ ID NO31)，反義，5』-CAT TGG CTC GCG TCGCTC TCA GG-3』(SEQ ID NO32)；cyclin A啟動子-有義，5』-GTG TTG TTC CGGACA CAT AGA AAG-3』(SEQ ID NO33)，反義，5』-CAG TGC ATT GCT TCA GACTCC AC-3』(SEQ ID NO34)；cyclin D1啟動子-有義，5』-TGC CCC TGT AGT CCGGTT TTC ATA-3』(SEQ ID NO35)，反義，5』-GCG CCC CAG TCA CCC CTT CTC-3』(SEQ ID NO36)。在βarrs-/-MEFs及鼠腦組織中，p27啟動子-有義，5』-TCC GAG GCCAGC CAG AGC AGG TTT-3』(SEQ ID NO37)，反義，5』-AGC GGG GAC AGG GGAGGG GGA GAA-3』(SEQ ID NO38)；c-fos啟動子-有義，5』-CGT CAA TCC CTC CCTCCT-3』(SEQ ID NO39)，反義，5』-GGC GCT CTG TCG TCA ACT-3』(SEQ ID NO40)；c-jun啟動子-有義，5』-CTA CCG GCC AGC AAC TTT C-3』(SEQ ID NO41)，反義，5』-CCG CCC GGC CTC CAA CAA-3』(SEQ ID NO42)；cyclin A啟動子-有義，5』-CAG GGG AAG TGG GAT GGA TAG-3』(SEQ ID NO43)；反義，5』-CAG CGC TGGATA CCC CTT GAG-3』(SEQ ID NO44)；cyclin D1啟動子-有義，5』-CCC CCA GCGAGG AGG AAT AGA TGA-3』(SEQ ID NO45)；反義，5』-GTA ACA CCC GAA GATGCC AGA CGA-3』(SEQ ID NO46)。
1.11體外組蛋白乙醯化和去乙醯化分析體外組蛋白乙醯化酶活性，體外組蛋白乙醯化和去乙醯化分析採用UpstateBiology的試劑盒進行。組蛋白乙醯化酶PCAF(0.1μg)，鎳離子(600μM)以及組蛋白去乙醯化酶抑制劑TSA(100nM)分別被用作體外組蛋白乙醯化酶活性，體外組蛋白乙醯化和去乙醯化分析的陽性對照[Broday，L，等(2000).Cancer Res 60，238-241；Kang，J.，等(2003).Toxicol Sci 74，279-286；Koyama，Y.，等(2000).Blood 96，1490-1495]。
1.12蛋白-染色質結合實驗蛋白-染色質結合實驗參照以前發表的方法[Donovan，S.，等(1997).Proc NatlAcad Sci U S A 94，5611-5616；Liang，C.，等(1997)Genes Dev 11，3375-338618，19]。用提取緩衝液(EB；100mM KCl，50mM HEPES-KOH，pH7.5，2.5mM MgCl2，50mM NaF，5mM Na4P2O7，0.1mM NaVO3，0.5％Triton X-100，用前加蛋白酶抑制劑混合物(RocheMolecular Biochemicals))裂解約2×107細胞。在裂解液(WCE)下方放一半體積30％蔗糖溶液，10,000×g離心10min。沉澱(Crude Pel)用CaCl2(至1mM)和5單元微球菌核酸酶(MNase，Takara Biotechnology)消化20秒。用EGTA(至1mM)終止消化，10,000×g，4℃離心5分鐘.上清(MNase Sup)500,000×g離心小時，收穫沉澱(Ultra Pel)和上清(Ultra Sup)。把得到的所有樣品用8％或15％SDS-PAGE凝膠分離，檢測βarr1，p300，組蛋白H4，和微管蛋白的存在。
1.13[3H]胸苷摻入用βarrs或βarr1 siRNA質粒轉染SK細胞42或90小時；或SK細胞用βarr1 siRNA或p27 siRNA質粒轉染90小時，飢餓2小時，再用1μM of DPDPE或DADLE處理1小時，或1μM of DEL處理30min。不同處理細胞在含1μCi/ml of [3H]胸苷(24.0Ci/mmol；Amersham)的新鮮培液中培養6小時，用Beckman multipurpose scintillationS6500記數儀檢測[3H]胸苷摻入情況。
1.14小鼠側腦室注射用尿道麻醉三周齡C57小鼠(中科院上海實驗動物中心)後，側腦室(前囪-0.25mm；側部，1mm；深度，2.25mm)注射2pmol DPDPE(DP，1.5μl/小鼠)。有些組在注射DPDPE前15分鐘，側腦室注射生理鹽水或20fmol naltridole(1.5μl/mice).注射DPDPE後不同時間點取小鼠海馬和大腦皮層，進行RT-PCR及ChIP分析。動物實驗遵循國立衛生研究院關於實驗室動物健康和使用的規定。
1.15數據統計實驗數據以平均值±標準誤表示，用SigmaPlot4.0作圖軟體進行曲線擬合，實驗組間差異顯著性採用Student t檢驗，或採用ANOVA並用Bonferroni post-hoc test做多組間差異比較。
2結果2.1 DOR激活導致β-抑制蛋白1轉核本發明者首先在HEK293細胞中瞬時表達DOR受體和βarrs-GFP融合蛋白，採用雷射共聚焦顯微鏡觀察了βarrs在激動劑刺激下在細胞內分布的變化。在沒有激動劑存在時，βarr1-GFP均勻地分布在細胞漿和細胞核。而βarr2-GFP只分布於細胞漿。在DOR的特異性激動劑DPDPE(1μM)處理5分鐘後，βarr1-GFP和βarr2-GFP在胞漿中的螢光強度下降，而在細胞膜上的螢光強度增加。與βarr2-GFP不同的是，在阿片激動劑刺激後βarr1-GFP在細胞核內的螢光強度也明顯增加。同野生型βarr2相似，βarr1Q394L主要分布於胞漿，在受體激活後也不發生核轉位。為證實βarr1轉核現象，本發明者又在表達DOR和βarr1-GFP的HEK293活細胞上對激動劑誘導的βarr1-GFP的重分布進行了實時觀測。結果顯示，在激動劑處理前，βarr1-GFP均勻地分布在細胞胞漿和核內。加入激動劑後1分鐘，細胞膜和核內βarr1-GFP螢光強度就明顯增加同時胞漿內的螢光強度降低，到3分鐘時細胞膜和細胞核的螢光強度達到最大值而細胞漿內的螢光強度達到最低。這些結果提示在激動劑刺激下βarr1-GFP在向細胞膜轉位的同時也向細胞核轉位。為排除GFP對所觀察到的βarr1轉位的可能影響，本發明者在共表達了DOR和βarr1-HA的HEK293細胞和只表達了DOR的HeLa細胞中用1μM DPDPE刺激，然後採用western免疫印跡的方法來檢測核提取物中βarr1-HA及內源βarr1含量的變化。結果表明無論是βarr1-HA還是βarr1在核內的含量都在激動劑處理後有明顯增加。這些結果表明激活DOR的確誘導了βarr1向細胞核的轉位。進一步研究發現，KOR的激活同DOR的激活一樣，能引起βarr1向細胞核轉位。但激活MOR或β2AR，不能引起βarr1向細胞核轉位。
2.2DOR激活促進βarr1-介導的p27和c-fos轉錄結合基因晶片的初步結果，本發明者首先應用定量RT-PCR和Western印跡方法研究了βarr1對p27，c-fos，c-jun，cyclinA和cyclin D1這些與細胞增殖相關基因表達的影響。結果顯示，與對照HeLa細胞相比，過表達βarr1(約內源βarr1的8倍)引起p27mRNA和蛋白水平的明顯升高，而同樣水平表達主要分布於胞漿的βarr2或βarr1Q394L則沒有這種作用。與之對應，βarr1 siRNA和βarr2 siRNA的應用同樣顯著地降低了細胞中內源βarr1或βarr2的表達(約降低80％)，但只有βarr1 siRNA可以顯著降低細胞中p27和c-fos的mRNA水平和p27的蛋白水平。由於c-Fos蛋白不穩定，本發明者沒有檢測到c-Fos蛋白。作為對照，βarr1及它的siRNA不影響細胞中c-jun，cyclin A，及cyclin D1的表達。βarr1對基因轉錄的這種影響在βarrs-/-MEF(βarr1和βarr2雙敲除)細胞[Kohout，T.A.，等(2001).Proc Nat1 Acad Sci U S A 98，1601-1606]中也得到證實。這些結果證明βarr1確實調節了p27和c-fos基因的轉錄，而這種調節與βarr1在核內的分布相關。因此，本發明者研究了能引起βarr1轉核的DOR激活對上述基因轉錄的影響。DPDPE處理引起p27mRNA和蛋白水平的明顯升高，對c-jun則沒有作用。DPDPE的這種作用可以被DOR的拮抗劑或βarr1 siRNA所阻斷，但不受Gi/Go(百日咳毒素)，PI3K(渥曼青黴素)，p38(SB203580)，JNK(SP600125)，或ERK(PD98059)的抑制劑影響，顯示DOR激活可以通過誘導βarr1的轉核直接調節基因轉錄。
2.3βarr1核內濃度的升高促進了p27和c-fos啟動子區組蛋白H4的乙醯化本發明者研究了βarr1對組蛋白乙醯化的影響。圖1A的結果顯示HeLa細胞中，表達βarr1和它的siRNA顯著促進或抑制組蛋白H4乙醯化，不影響組蛋白H3乙醯化。進一步發現，在組蛋白H4氨基端可被乙醯化修飾的四個位點[Grunstein，M.(1997).Nature 389，349-352]中，βarr1主要影響Lys-12和Lys-16的乙醯化。同βarr1對基因轉錄的影響一樣，βarr1對組蛋白乙醯化的這種調節作用同樣可以在βarrs-/-MEF細胞中得到證實(圖1B)。象本發明者預計的一樣，βarr2，βarr1 Q394L和βarr2 siRNA都不影響組蛋白乙醯化(圖1)。這些結果顯示，核內的βarr1可以調節組蛋白H4的乙醯化，從而影響包括p27和c-fos在內的一些特定基因的轉錄。
組蛋白乙醯化變化對基因轉錄是否有調節作用取決於這種變化是否發生在特定基因附近，尤其是是否發生在該基因的啟動子區。染色質免疫沉澱實驗(ChIP)顯示，無論在HeLa，還是βarrs-/-MEF細胞中，βarr1都顯著促進p27和c-fos啟動子區組蛋白H4的乙醯化，而βarr1 siRNA則顯著抑制HeLa中這些區域組蛋白H4的乙醯化(圖2A)。同上面一樣，βarr2和βarr1Q394L沒有這種作用(圖2A)，提示βarr1在核內的富集是組蛋白H4乙醯化變化所需要的。βarr1不影響c-jun，cyclin A，及cyclin D1啟動子區組蛋白H4的乙醯化，也不影響所有測定基因啟動子區組蛋白H3的乙醯化(圖2A，cyclin A，cyclin D1的數據未顯示)，顯示βarr1對組蛋白H4乙醯化的調節具有基因特異性。對應地，DPDPE處理βarr1-和受體激活依賴地促進p27(圖2B，2C)和c-fos(數據未顯示)啟動子區組蛋白H4的乙醯化，說明受體激活誘導的βarr1轉核基因特異性地促進了某些啟動子區組蛋白H4的乙醯化。從不同的βarr1突變體得到的數據顯示βarr1對p27啟動子區組蛋白H4的乙醯化的促進與它對這些基因轉錄的調節正相關(圖2E)。
為了研究βarr1調節組蛋白H4乙醯化的機制，本發明者首先研究了βarr1是否與染色質結合。七組分蛋白-染色質結合實驗顯示(圖2D)，與染色質結合蛋白組蛋白H4和p300類似，外轉和內源βarr1分布於初的染色質沉澱組分(泳道3)，微球菌核酸酶(MNase)消化後上清(泳道4)，以及MNase消化上清超速離心後的沉澱(泳道7)中，顯示βarr1可以與染色質結合。ChIP實驗進一步證實HeLa細胞中，βarr1特異性地富集在p27和c-fos啟動子區，而不在c-jun(圖2A)，cyclin A或cyclin D1(數據未顯示)啟動子區。象預計一樣，βarr1抗體βarrs-/-MEFs中沉澱出任何DNA序列(圖2A，cyclin A和cyclin D1的數據未顯示)，證明了該抗體的特異性。與DOR激活對組蛋白H4乙醯化的調節一樣，DOR激活也大大促進了βarr1在p27和c-fos啟動子區的富集(圖2B，c-fos的數據未顯示)。這些結果顯示βarr1在p27和c-fos啟動子區的富集可能與它對這些區域組蛋白H4乙醯化的促進相關。
2.4βarr1招募p300到p27和c-fos啟動子區體內組蛋白乙醯化的水平受組蛋白乙醯化酶(HAT)和組蛋白去乙醯化酶(HDAC)控制。本發明者採用GST-βarr1、免疫沉澱的HA-βarr1體外進行的組蛋白乙醯化和組蛋白去乙醯化分析表明，βarr1既不是組蛋白乙醯化酶和組蛋白去乙醯化酶，體外也不影響組蛋白乙醯化酶和組蛋白去乙醯化酶的活性(圖3A-3C)。更重要的是，I、II、III類組蛋白去乙醯化酶抑制劑trichostatin A(TSA)和sirtinol(STN)，不影響βarr1對p27和c-fos啟動子區組蛋白的乙醯化(圖3D)。這些結果說明βarr1可能是通過在特定基因區域招募組蛋白乙醯化酶促進組蛋白乙醯化的。
p300，CBP和Tip60是很重要的組蛋白乙醯化酶。有報導發現p300和CBP與c-fos啟動子區組蛋白乙醯化有關[Chan，H.M.，等(2001).J Cell Sci 114，2363-2373；Usenko，T.，等(2003).Oncogene 22，7661-7666.]，Tip60則可能與βarr1結合[Salwinski，L，Miller，(2004).Nucleic Acids Res 32，D449-451]。因此，本發明者研究了βarr1對這些酶在p27和c-fos啟動子區富集的影響。研究顯示，表達βarr1 siRNA或βarr1分別降低或促進p300在p27和c-fos啟動子區富集，但不影響CBP和Tip60在這些區富集情況(圖4A)，也不影響p300，CBP和Tip60在c-jun(圖4A)，cyclin A和cyclin D1(數據未顯示)啟動子區的富集。與DPDPE刺激促進p27和c-fos啟動子區βarr1富集及組蛋白乙醯化的結果一致，DPDPE刺激也促進了p300在p27和c-fos啟動子區的富集(圖2B，4B，c-fosβ數據未顯示)。用HeLa細胞核提取物進行免疫共沉澱發現，核內的βarr1和p300間有相互作用。這些結果顯示βarr1基因特異性地促進組蛋白乙醯化的機制可能是它把p300招募到了這些基因區域。
2.5p300在βarr1-介導的組蛋白乙醯化和基因轉錄中的作用無論在HeLa還是βarrs-/-MEF細胞中，p300過表達顯著促進p27和c-fos啟動子區組蛋白H4乙醯化，且p300的這種促進作用可以被βarr1或βarr1 siRNA促進或阻止。更重要的是，p300顯性失活突變體(p300 DN)顯著減小了βarr1對p27和c-fos啟動子區組蛋白H4的。這些數據顯示p300在βarr1-介導的組蛋白乙醯化中發揮重要作用。與之對應，過表達p300 DN也顯著降低了βarr1對p27和c-fos的轉錄激活作用，提示βarr1-介導的基因特異性組蛋白乙醯化與它介導的轉錄激活有關。
有報導顯示，轉錄因子cAMP響應元件結合蛋白(CREB)可以招募CBP和p300，並調節p27和c-fos的轉錄[Mayr，B.，等(2001).Nat Rev Mol Cell Biol 2，599-609；Garcia，C.，等(2004)J Neurosci Res 78，338-346]。最近的研究也顯示組蛋白乙醯化在CREB-依賴的基因(如c-fos)轉錄中有重要作用[Johannessen，M.，等(2004).Cell Signal16，1211-1227]。本發明者免疫共沉澱實驗顯示內源βarr1和CREB間有相互作用。進一步研究顯示CREB siRNA的表達顯著降低了βarr1在p27和c-fos啟動子區的富集，反過來，βarr1及βarr1 siRNA的表達不影響這些區域CREB的富集情況。加之βarr1過表達不影響CREB的轉錄活性，這些結果顯示βarr1不是通過直接激活CREB的轉錄活性調節基因轉錄，GPCR信號刺激下，βarr1和CREB間的相互作用可能參與了βarr1在特異基因區域的富集，這些區域組蛋白乙醯化的變化以及這些基因的轉錄。
2.6激活神經細胞表面DOR促進βarr1-依賴的組蛋白乙醯化，p27轉錄及增殖抑制DOR表達於中樞神經系統的一個重要的神經遞質受體。為了驗證在一個更接近生理的條件下，DOR激活是否同樣引起組蛋白H4乙醯化及p27轉錄，本發明者用1μM DPDPE刺激內源性表達DOR的人腦成神經細胞瘤SK細胞[Yu，V.C.，等(1986).JBiol Chem 261，1065-1070]。圖5A和5B顯示，DPDPE處理時間依賴性地促進βarr1轉核，p27啟動子區組蛋白H4乙醯化及p27轉錄。DPDPE的這些作用可以被naltridole及βarr1 siRNA所阻斷。與之類似，側腦室注射DPDPE也DOR-特異性地促進小鼠海馬區和大腦皮層p27啟動子區組蛋白H4乙醯化及p27轉錄，顯示體內激活DOR同樣引起組蛋白H4乙醯化及p27轉錄。由於p27主要參與細胞增殖抑制[Kiyokawa，H.，等(1996).Cell 85，721-732；Nakayama，K.，等(1996).Cell 85，707-720]，本發明者研究了βarr1和DOR激活是否能夠p27-依賴地抑制SK細胞的增殖。圖5D顯示，βarr1或βarr1 siRNA的表達p27-依賴性地顯著抑制或促進了SK細胞的增殖。與此相對應，DOR激活βarr1-和p27-依賴性地抑制了SK細胞的增殖。同時，DOR的其它激動劑如DADLE(與DPDPE結構相似)或δ啡肽-I(與DPDPE結構不同)也能引起βarr1轉核(圖5A)、組蛋白H4乙醯化、p27轉錄(圖5C)，以及SK細胞的增殖抑制(圖5D)。這些數據提示βarr1-介導的表觀遺傳機制在神經細胞DOR激活調節生理活動過程中發揮重要作用。
3.討論βarrs是眾所周知的胞質內信號的調節者和接頭蛋白(scaffold protein)。受體激活介導的βarrs上膜在受體脫敏以及信號轉導中都起了很重要的作用[Claing，A.，等(2002).Prog Neurobiol 66，61-79；Luttrell，L.M.，等(2002).J Cell Sci 115，455-465]。所有報導的βarr1功能都發生在細胞質或細胞膜上，對於βarr1在核內的功能從未有所涉及。本發明發現，DOR激活導致βarr1轉核，促進βarr1-依賴的p27和c-fos轉錄，揭示了βarr1不僅可以在胞質中介導信號的轉導，而且有可能把從受體來的信號傳遞到細胞核中。βarr1過表達和受體激活導致的βarr1轉核促進了p27和c-fos啟動子區的組蛋白乙醯化和p27和c-fos轉錄，顯示通過改變表觀遺傳修飾調節基因轉錄是βarr1在核內的一個功能。概括地說，本研究證明染色質是GPCR-介導的信號轉導的直接靶標，揭示了GPCR信號從膜到核的表觀遺傳機制。同時也是第一個關於βarr1核內功能的報導。
最近的研究表明，真核生物基因轉錄中，表觀遺傳修飾變化作用重大[Grewal，S.I.，等(2003).Science 301，798-802]。其中，核小體組蛋白的乙醯化修飾變化是染色質結構和基因轉錄活性的重要決定者[Cheung，W.L.，等(2000).Curr Opin Cell Biol 12，326-333；Grunstein，M.(1997).Nature 389，349-352]。本發明者發現核內βarr1的積累促進了p27和c-fos啟動子區組蛋白H4的乙醯化和p27和c-fos轉錄，提示促進組蛋白乙醯化代表了βarr作為核內信使一個十分重要的新功能。進一步研究發現，βarr-介導的組蛋白乙醯化和基因轉錄受外界信號，如DOR和KOR激活調空，提示組蛋白的修飾可能是細胞整合GPCR-介導的外界信號並產生轉錄應答的表觀遺傳機制。
組蛋白乙醯化酶(HAT)和組蛋白去乙醯化酶(HDAC)是細胞中控制組蛋白乙醯化高低的酶蛋白。本發明者的結果顯示HDAC不參與βarr1對組蛋白乙醯化的調節，βarr1也不具有或影響HAT的活性。因此本發明者推測βarr1是通過影響HAT蛋白在基因區域的募集調節組蛋白乙醯化的。本發明者的實驗證實βarr1和βarr1 siRNA的表達分別顯著提高或降低了p300在p27和c-fos啟動子區的積累，而且，p300 DN抑制βarr-介導的組蛋白乙醯化和基因轉錄。結合p300和βarr1之間具有相互作用，本發明者的數據顯示受體激活後，在特定基因區域，βarr通過募集HATs，如p300，促進這些區域組蛋白乙醯化。
有研究表明，基因轉錄起始之前，啟動子區的轉錄因子需要協調性地招募大批包括染色質重建酶在內的蛋白。特定染色質重建酶通過與轉錄因子相互作用保證染色質重建可以在合適的時間合適的細胞正確的基因上發生。本發明者的研究顯示，轉錄因子CREB中介了βarr1在p27和c-fos啟動子區的積累，不過，儘管CREB也存在於c-jun啟動子區，這裡卻沒有βarr1的存在。越來越多的證據顯示轉錄因子外，特定啟動子區預先存在的核蛋白結構在該區域染色質重建中同樣發揮重要作用[Urnov，F.D.，和(2001).Oncogene 20，2991-3006]。本發明者質譜分析的數據顯示除p300和CREB外，βarr1複合物中尚存在多種核蛋白。因此，p27和c-fos啟動子區可能還存在招募βarr1必需的其它因子，這正是βarr1特異性地調節基因轉錄的機制。
先前的研究顯示βarrs的重要功能之一就是作為支架蛋白去增強GPCR信號的效應或/和特異性[Hall，R.A.，(2002).Circ Res 91，672-680]。如，GPCR激活後，βarrs在細胞質中順次結合JNK3 cascade中起作用的激酶，導致JNK3的激活和在細胞質中的阻滯[McDonald，P.H.，等(2000).Science 290，1574-1577]。本發明者先前的研究也發現βarr2可以把Mdm2靶向到激活的GPCR受體，從而抑制Mdm2的自身泛素化及Mdm2介導的p53降解。與之類似，在核內βarr1可能也是作為支架分子和信號分子，通過與轉錄因子及其它核蛋白作用招募HAT到特定基因區域，從而調節基因轉錄。
本發明者的研究發現，βarr1過表達和DOR激活促進βarr1轉核促進了p27和cfos啟動子區的組蛋白乙醯化，提高了p27的表達，但沒有顯著提高c-fos的轉錄，提示對c-fos的正常轉錄而言，細胞內內源βarr1和/或基礎組蛋白乙醯化是足夠的。βarr1siRNA同時降低c-fos啟動子區組蛋白乙醯化和c-fos轉錄支持上述觀點。在檢測的基因中，βarr1過表達和DOR激活引起的βarr1轉核不影響c-jun，cyclin A和cyclin D1的轉錄和這些基因區域的組蛋白乙醯化。結合βarr1核內積累特異性作用於p27和c-fos啟動子區，本發明者推測GPCR激活可以βarr依賴地誘導一系列特定基因區域的組蛋白修飾和基因轉錄。
Barrs是GPCR信號的重要調節者，有βarr1和βarr2兩種亞型。儘管二者享有～80％的同源性，本發明者的研究發現，在激動劑刺激後，只有βarr1向核內轉移。以往的研究顯示這兩種βarrs都可以在細胞質和細胞核間穿梭。但與βarr1不同的是，βarr2的C端帶有一個強的出核信號[20，39]。βarr1的點突變βarr1 Q394L帶有與βarr2同樣的出核信號，本發明者發現刺激劑不能誘導βarr1 Q394L出核，顯示βarrs的C端在調節不同亞型βarrs核內濃度方面具有重要的作用。這些結果同時提示在調節GPCR介導的核內信號中，βarr1亞型發揮更重要的作用。本研究還觀察到，DOR和KOR刺激可以引起βarr1轉核，而β2AR或MOR刺激卻沒有這種功能，顯示一些特定的GPCR信號可能更偏好於這種βarr1介導的表觀遺傳通路。
GPCR信號可以通過細胞質內不同的傳導級聯通路由膜向核傳遞。GPCR激活引起的典型胞內通路包括與受體相連的三聚體G蛋白的激活、與Gα亞基結合的GTP的水解、cAMP生成的變化、不同信號分子如MAPKs和PKA的調節、最終導致目標基因的轉錄變化[Shaywitz，A.J.，等(1999).Annu Rev Biochem 68，821-861；Neves，S.R.，等(2002).Science 296，1636-1639.]。DOR激活可能引起的胞內通路包括Gi蛋白、ERK1/2、JNK、P38和PI3K等級聯通路激活[Eisinger，D.A.，等(2004).J Pharmacol ExpTher 309，776-785；Persson，A.I.，等(2003).Mol Cell Neurosci 23，360-372；Shahabi，N.A.，等(2003).Cell Immunol 221，122-127；Zhang，Z.，等(1999).J Neurochem 73，1502-1509]。本發明者發現激動劑誘導的基因特異性組蛋白乙醯化和基因轉錄可以被DOR的拮抗劑或βarr1 siRNA所阻斷，但不受Gi/Go、PI3K、p38、JNK、或ERK抑制劑的影響。結合p300介導的特異基因區域組蛋白乙醯化和基因轉錄需要βarr1的轉核及在特定染色質區域積累，這些結果提示DOR激活引起的外界信號由膜到核的轉導是由βarr1轉核，而不是由上述已知胞內信號通路介導的。
以往的研究認為，內吞只是膜受體信號的負反饋調節機制。近來的研究顯示接受刺激後，特定組成性在細胞質和細胞核間穿梭的內吞蛋白也直接參與外界信號由膜到核的傳遞[Benmerah，A.(2004).Curr Biol 14，R314-316]。如，在外界刺激下，內吞蛋白APPL1轉核並通過與NuRD/MeCP1複合物相互作用傳遞信號[Miaczynska，M.，等(2004).Cell 116，445-456.]。本發明者的結果顯示，DOR激活引起內吞蛋白βarr1轉核、特定基因區域βarr1和HAT蛋白富集、從而促進了特異基因區域組蛋白的乙醯化和這些基因的轉錄。這些數據展示了βarr作為一個直接的信使和核內具信號作用的支架蛋白把GPCR信號由膜傳遞到核，並通過表觀遺傳修飾調節基因轉錄的新功能。從人神經瘤細胞和鼠海馬得到的實驗進一步證實，激活內源DOR同樣引起βarr1轉核、p27基因區域組蛋白的乙醯化和p27基因的轉錄。
表觀遺傳網絡平衡對人正常發育有重要意義，破壞則引起包括癌症、染色體不穩定綜合症和記憶障礙等多種病變[Egger，G.，等(2004).Nature 429，457-463；Sutherland，J.E.，等(2003).Ann N Y Acad Sci 983，151-160]。越來越多的研究認為表觀遺傳調節是細胞對環境刺激產生整體轉錄應答的重要通路[Levenson，J.M.，等(2005).Nat RevNeurosci 6，108-118]。本發明者的研究顯示DOR激活誘導βarr1轉核，導致組蛋白修飾變化，基因激活和細胞增殖抑制，揭示GPCR信號可以通過表觀遺傳修飾對細胞進行調節，在這一過程中，βarr再次扮演重要角色。深入研究將有助於揭示作為細胞膜和細胞核間信號支架蛋白，βarr調節基因轉錄的機制，也有助於揭示受體誘導的依賴βarr的表觀遺傳信號通路的分子機制。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講述內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110中國科學院上海生命科學研究院復旦大學120β-抑制蛋白在製備治療表觀遺傳相關疾病的藥物中的應用13005875916046170PatentIn version 3.3210121125212DNA213人工序列220
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221misc_feature223引物40046gtaacacccg aagatgccag acga 2權利要求
1.β-抑制蛋白1、其核酸序列、含有該核酸序列的構建物在製備用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病是癌症、神經系統疾病或表觀遺傳疾病。
3.δ阿片受體激動劑或k阿片受體激動劑在製備用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病是癌症、神經系統疾病或表觀遺傳疾病。
5.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述δ阿片受體激動劑選自[D-Pen2，D-Pen5]腦啡肽、(D-Ala2，D-Leu5)腦啡肽或δ啡肽-I。
6.一種用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病藥物組合物，其特徵在於，所述組合物包含有效量的至少一種選自β-抑制蛋白1、β-抑制蛋白1的核酸序列、含有所述核酸序列的構建物、δ阿片受體激動劑或k阿片受體激動劑的物質作為活性組分，以及藥學上可接受的載體。
7.如權利要求6所述的藥物組合物，其特徵在於，所述與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病是癌症、神經系統疾病或表觀遺傳疾病。
8.如權利要求6所述的藥物組合物，其特徵在於，所述δ阿片受體激動劑選自[D-Pen2，D-Pen5]腦啡肽、(D-Ala2，D-Leu5)腦啡肽或δ啡肽-I。
9.一種從候選物質中篩選出治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病的藥物的方法，該方法包括a)使所述候選物質與表達β-抑制蛋白1的細胞接觸；b)鑑定β-抑制蛋白1在所述細胞的細胞核內的表達水平，並將該表達水平與未接觸所述候選物質的細胞的細胞核內β-抑制蛋白1表達水平相比較；c)選出使細胞核內β-抑制蛋白1表達水平提高的物質作為所述治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病的藥物。
全文摘要
本發明涉及β－抑制蛋白1、其核酸序列、含有該核酸序列的構建物在製備用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病中的應用。本發明還涉及δ阿片受體激動劑或κ阿片受體激動劑在製備用於治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病中的應用。本發明還涉及一種從候選物質中篩選出治療與組蛋白乙醯化水平降低相關的疾病的藥物的方法。
文檔編號A61P35/00GK1970074SQ20051011062
公開日2007年5月30日 申請日期2005年11月23日 優先權日2005年11月23日
發明者馬蘭, 裴鋼, 康九紅, 施裕豐, 向斌, 鮑國斌, 蘇文娟 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 復旦大學