紅球菌及用於腈水解合成苯乙酮酸的方法
2023-05-16 16:24:56
專利名稱：紅球菌及用於腈水解合成苯乙酮酸的方法
技術領域：
本發明公開了土壤中分離的腈水解酶產生菌Tfeoi/ococcM sp. CCZUio-I及其用於催化甲醯甲腈水解製備苯乙酮酸的方法，屬於微生物技術領域。
背景技術：
苯乙酮酸是一種重要的有機合成中間體，廣泛地用於農藥和醫藥等合成。隨著其市場的不斷擴展，對苯乙酮酸的需求不斷增加，應用範圍也逐漸拓寬。目前，國內外已報導了很多苯乙酮酸的生產方法，其中化學合成法主要是(1)苯甲醯腈水解法，( 扁桃酸氧化法，(3)傅克醯化法和(4)苯乙烯氧化法。上述各種化學方法已取得了較好的效果，但同時也有一些不足之處，例如，產物中都含有雜質，並且化學合成法通常存在產品收率低、成本高和環境汙染嚴重等缺點，與之相比，由於利用生物法實現苯乙酮酸的合成具有反應條件溫和，產品收率高等優點，符合綠色化學的發展要求，而越來越受到國內外學者的青睞。 生物法中涉及腈水解的酶系主要有腈水解酶、腈水合酶和醯胺酶；腈水解酶能將腈水解生成相應的羧酸和氨，具有選擇性好、反應條件溫和及產品純度高等優點，明顯優於化學法水解。然而，少有報導利用苯甲醯甲腈水解酶催化合成苯乙酮酸，篩選新的苯甲醯甲腈水解酶菌株成為當務之急。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一種紅球菌的培養及用於腈水解製備苯乙酮酸的方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。本發明所述的紅球菌TSoi/ococciAs sp. CCZU10-1，該菌株已於2011年5月25日保藏在位於中國北京的北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 4911。Al^EiUtMRhodococcus sp. CCZU10-1, CGMCC No. 4911，用於催化苯甲醯甲腈生產苯乙酮酸的方法，按照下述步驟進行
一、菌株的培養
(1)種子液的搖瓶培養將所說的紅球菌/Soi/ococc^ssp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，採用本領域常規的方法，在種子液培養基中進行擴增培養在2(Γ40 1下100 160 rpm 的搖床上培養12 36 h，離心、洗滌得到靜息細胞；
(2)發酵罐擴大培養在5L發酵罐中加入適量佔發酵罐體積50-70%的發酵培養基， 接種量佔發酵培養基體積的廣1096，接種至5 L發酵罐中，通氣量1:0.廣1:1 (v/v/m)，攪拌轉速200 450 rpm，溫度20 40 ° C，時間15 72 h，離心、洗滌得到靜息細胞；
二、靜息細胞催化苯甲醯甲腈水解生產苯乙酮酸
將收穫的靜息細胞，以廣100 g溼重/L懸浮於pH為6. (Γ8. 0的體積比為 98%:2%-90%: 10%的磷酸鉀緩衝溶液-有機溶劑兩相體系中，加入苯甲醯甲腈，使其濃度為 10^1000 mM，在20 40 ° C和100 160 rpm的恆溫搖床上振蕩反應2 120 h後，離心除去細胞，利用2 M NaOH溶液調pH至8.5，利用等體積的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然後利用6 M HCl的溶液調pH至1.0，利用等體積的乙醚萃取3次，收集有機相，經無水Na2SO4乾燥過夜後減壓蒸去溶劑，即得粗產品，然後過矽膠柱純化，洗脫液為體積比為25:5:1的苯/ 乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通過旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到黃色苯乙酮酸粉末。其中所述的步驟二也可以採用下述技術方案海藻酸鈣固定化細胞催化苯甲醯甲腈水解生產苯乙酮酸
將收穫的靜息細胞採用海藻酸鈣進行固定化，將海藻酸鈣固定化細胞，以廣200 g溼重 /L懸浮於pH為7. (Γ9. 0的體積比為98%: 2%-90%: 10%Tris_HCl緩衝溶液-有機溶劑兩相體系中，加入苯甲醯甲腈，使其濃度為10 1000 mM，在20 40 ° C和100 160 rpm的恆溫搖床上振蕩反應214 h後，離心除去細胞，利用2 M NaOH溶液調pH至8.5，利用等體積的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然後利用6 M HCl的溶液調pH至1.0，利用等體積的乙醚萃取3 次，收集有機相，經無水Na2SO4乾燥過夜後減壓蒸去溶劑，即得粗產品，然後過矽膠柱純化， 洗脫液為體積比為25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通過旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到黃色苯乙酮酸粉末。其中步驟一(1)中所述的種子液培養基組成為葡萄糖5 15 g，蛋白腖5 20 g，酵母膏 5 20 g, KH2PO4 Γ5 g, NaCl 0. 5 2. 5 g, MgSO4 0. Γ2. 5 g，水 1000 mL, pH 6. 0 9. 0 ；
其中步驟一(2)中所述的發酵培養基組成為葡萄糖5 15 g，蛋白腖5 20 g，酵母膏 5 20 g, KH2PO4 Γ5 g, NaCl 0. 5 2. 5 g, MgSO4 0. 1 2. 5 g，誘導劑(I) 0. 01 10 g，生長素 GO. ΟΓΟ. 1 g，水 1000 mL, pH 6. 0 9· 0 ；
上述培養基中所述的誘導劑I為α -氨基丙腈、丙烯腈、亞氨基二乙腈、乙腈、丁腈、 4-氯-3-羥基丁腈、2，3-二氰基吡嗪，羥基乙腈、苯乙腈、苯甲醯甲腈或己內醯胺；
上述培養基中所述的生長素 G 為CaCl2、CoC12_6H20、CuSO4, FeSO4 7H20、MgSO4, MnSO4 H2O, Na2MoO4 2H20, NiSO4 7H20, aiS04_7H20、生物素、泛酸鈣、葉酸、半胱氨酸、甘氨酸、肌醇、尼克酸、核黃素、維生素B1、對氨基苯甲酸鈉、鹽酸吡哆醛。其中步驟二中所述的有機溶劑為苯、甲苯、甲醇、乙苯、乙醇、叔丁醇、正己烷、正戊烷、正辛醇、異辛醇、乙酸乙酯、二氧六環或聚乙二醇400-4000。本發明的優點本發明利用Tfeoi/ococcM sp. CCZU10-1生物催化劑實現苯甲醯甲腈的水解合成苯乙酮酸，具有工藝路線簡單、反應條件溫和、無汙染、無副產物及轉化率高等優點。
圖1是本發明菌株CCZUio-I CGMCC No. 4911的系統進化樹；
圖2是利用Tfeoi/ococcM sp. CCZU10-1靜息細胞催化苯甲醯甲腈生產苯乙酮酸反應進程曲線；
圖3是固定化細胞催化的多批反覆水解苯甲醯甲腈反應的結果。符號說明附圖2中， 產物苯乙酮酸，〇底物苯甲醯甲腈；附圖3中， 固定化細胞，〇游離細胞。
具體實施例方式本發明發明人從常州大學白雲校區及常州科教城附近的土壤中，經初篩、復篩及分離純化得到一株腈水解酶菌株，經過16S rDNA及理化特徵鑑定，該菌株為紅球菌 Rhodococcus sp.，魚號為 Rhodococcus sp. CCZU10-1 該菌株已於 2011年 5 月 25 日保藏在位於中國北京的北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 4911。菌株進化樹如圖1所示。上述菌株的篩選過程如下
採集了不同環境條件下400份土壤樣品，利用苯甲醯甲腈為唯一氮源進行兩輪液體富集培養，篩選腈水解酶產生菌。通過反覆篩選，分離得到一株高活力的腈水解酶產生菌。本發明中苯乙酮酸的含量用HPLC進行分析。腈水解酶催化劑的活力單位定義每分鐘水解苯甲醯甲腈產生ι μ mol苯乙酮酸所需要的生物催化劑量。菌株理化特徵如表1所示 表1 CCZUlO-I菌株理化特徵
權利要求
1.紅球菌/Soi/ococciAssp. CCZUlO-I，其保藏號為 CGMCC No. 4911。
2.權利要求1所述的紅球菌TSoi/ococciAssp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，用於催化苯甲醯甲腈生產苯乙酮酸的方法，其特徵在於按照下述步驟進行一、菌株的培養(1)種子液的搖瓶培養將所說的紅球菌/Soi/ococc^ssp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，採用本領域常規的方法，在種子液培養基中進行擴增培養在2(Γ40 1下100 160 rpm 的搖床上培養12 36 h，離心、洗滌得到靜息細胞；(2)發酵罐擴大培養在5L發酵罐中加入適量佔發酵罐體積50-70%的發酵培養基， 接種量佔發酵培養基體積的廣1096，接種至5 L發酵罐中，通氣量1:0.廣1:1 (v/v/m)，攪拌轉速200 450 rpm，溫度20 40 ° C，時間15 72 h，離心、洗滌得到靜息細胞；二、靜息細胞催化苯甲醯甲腈水解生產苯乙酮酸將收穫的靜息細胞，以廣100 g溼重/L懸浮於pH為6. (Γ8. 0的體積比為 98%:2%-90%: 10%的磷酸鉀緩衝溶液-有機溶劑兩相體系中，加入苯甲醯甲腈，使其濃度為 10^1000 mM，在20 40 ° C和100 160 rpm的恆溫搖床上振蕩反應2 120 h後，離心除去細胞，利用2 M NaOH溶液調pH至8. 5，利用等體積的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然後利用6 M HCl的溶液調pH至1.0，利用等體積的乙醚萃取3次，收集有機相，經無水妝2504乾燥過夜後減壓蒸去溶劑，即得粗產品，然後過矽膠柱純化，洗脫液為體積比為25:5:1的苯/ 乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通過旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到黃色苯乙酮酸粉末。
3.權利要求2所述的紅球菌TSoi/ococciAssp. CCZU10-1, CGMCC No. 4911，用於催化苯甲醯甲腈生產苯乙酮酸的方法，其特徵在於其中所述的步驟二採用下述技術方案海藻酸鈣固定化細胞催化苯甲醯甲腈水解生產苯乙酮酸將收穫的靜息細胞採用海藻酸鈣進行固定化，將海藻酸鈣固定化細胞，以廣200 g溼重 /L懸浮於pH為7. (Γ9. 0的體積比為98%: 2%-90%: 10%Tris_HCl緩衝溶液-有機溶劑兩相體系中，加入苯甲醯甲腈，使其濃度為10 1000 mM，在20 40 ° C和100 160 rpm的恆溫搖床上振蕩反應214 h後，離心除去細胞，利用2 M NaOH溶液調pH至8.5，利用等體積的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然後利用6 M HCl的溶液調pH至1.0，利用等體積的乙醚萃取3 次，收集有機相，經無水Na2SO4乾燥過夜後減壓蒸去溶劑，即得粗產品，然後過矽膠柱純化， 洗脫液為體積比為25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通過旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到黃色苯乙酮酸粉末。
4.根據權利要求2 或 3 所述的紅球菌TSoi/ococciAs sp. CCZU10-1, CGMCC No. 4911， 用於催化苯甲醯甲腈生產苯乙酮酸的方法，其特徵在於其中步驟一(1)中所述的種子液培養基組成為葡萄糖5 15 g，蛋白腖5 20 g，酵母膏5 20 g, KH2PO4 Γ Ο g, NaCl 0.廣2. 5 g, MgSO4 0. Γ2. 5 g，水 1000 mL, pH 6. 0 9· 0 ；其中步驟一(2)中所述的發酵培養基組成為葡萄糖5 15 g，蛋白腖5 20 g，酵母膏 5 20 g, KH2PO4 Γ10 g, NaCl 0. 1 2. 5 g，MgSO4 0. 1 2. 5 g，誘導劑(I) 0. 0廣 10 g，生長素 G0. ΟΓΟ. 1 g，水 1000 mL, pH 6. 0 9· 0 ；上述培養基中所述的誘導劑I為α -氨基丙腈、丙烯腈、亞氨基二乙腈、乙腈、丁腈、 4-氯-3-羥基丁腈、2，3-二氰基吡嗪，羥基乙腈、苯乙腈、苯甲醯甲腈或己內醯胺；上述培養基中所述的生長素 G 為CaCl2、CoC12_6H20、CuSO4, FeSO4 7H20、MgSO4, MnSO4 H2O, Na2MoO4 2H20, NiSO4 7H20, aiS04_7H20、生物素、泛酸鈣、葉酸、半胱氨酸、甘氨酸、肌醇、尼克酸、核黃素、維生素B1、對氨基苯甲酸鈉、鹽酸吡哆醛。
5.根據權利要求 2 或 3 所述的紅球菌TSoi/ococciAs sp. CCZUlO-I, CGMCC No. 4911， 用於催化苯甲醯甲腈生產苯乙酮酸的方法，其特徵在於其中步驟二中所述的有機溶劑為苯、甲苯、甲醇、乙苯、乙醇、叔丁醇、正己烷、正戊烷、正辛醇、異辛醇、乙酸乙酯、二氧六環或聚乙二醇 400-4000。
全文摘要
本發明公開了紅球菌及用於腈水解合成苯乙酮酸的方法，屬於微生物技術領域。紅球菌Rhodococcussp.CCZU10-1，保藏號為CGMCCNo.4911。以苯甲醯甲腈為起始原料，以通過在發酵培養基中進行擴增培養得到的紅球菌Rhodococcussp.CCZU10-1細胞為生物催化劑在一定條件下進行苯甲醯甲腈的水解，得到產物苯乙酮酸。本方法具有工藝路線簡單、反應條件溫和及無汙染等特點。
文檔編號C12P7/40GK102250802SQ20111017133
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月23日 優先權日2011年6月23日
發明者何玉財, 周瓊, 張躍, 朱孝霖, 李亮, 王利群, 蔡志強, 趙希嶽, 鄭明 , 馬翠鸞, 高大舟 申請人:常州大學