一種惡臭假單胞菌及在製備(R)‑1‑(2‑三氟甲基苯基)乙醇中的應用的製作方法

2023-05-16 10:05:56 1

(一)技術領域

本發明涉及一株可用於生物催化不對稱還原2-三氟甲基苯乙酮製備高光學純度(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的新菌種——惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)zjph1606及其應用。

(二)

背景技術：

(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的化學結構式為：

(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇是用於合成新型抗腫瘤藥物plk1激酶拮抗劑gsk461364(化學名：5-[6-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-1h-苯並咪唑-1-基]-3-[(1r)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙氧基]-2-噻吩甲醯胺)的重要手性中間體，該化合物競爭atp與受體接合，從而抑制腫瘤細胞惡性分裂，臨床應用上具有較好的療效。

採用化學法製備(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇，需要使用價格昂貴的如銠、釕等金屬催化劑，會對環境造成汙染。採用微生物全細胞催化的生物不對稱還原方法製備(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇具有反應條件溫和、立體選擇性高、環境友好等優點。

已有文獻報導，du等(organometallics,2014,33:974-982)利用手性ru金屬配體催化劑催化還原2-三氟甲基苯乙酮製備(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇，最大轉化數ton、轉化頻率tof和產率分別是495、1450和99％；許建和等(專利cn201210423006.0)利用基因挖掘技術，對來自耐熱克魯維酵母(kluyveromycesthermotolerans)的羰基還原酶基因構建重組工程菌e.colibl21(de3)/pet-ktcr，在催化還原2-三氟甲基苯乙酮製備(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇中，ee>99％，產率只有2％。

(三)

技術實現要素：

本發明目的是提供一株可用於生物催化不對稱還原2-三氟甲基苯乙酮製備高光學純度(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的微生物新菌種——惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)zjph1606，以及該菌種在催化不對稱合成製備(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇中的應用。

本發明採用的技術方案是：

本發明提供一株新菌株--惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)zjph1606，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期：2017年3月9日，保藏編號：cctccno：m2017110，地址：中國，武漢，武漢大學，郵編：430072。

本發明還提供一種所述惡臭假單胞菌zjph1606在催化2-三氟甲基苯乙酮製備(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇中的應用，反應式如下：

進一步，所述的應用為：以2-三氟甲基苯乙酮為底物，以惡臭假單胞菌zjph1606經發酵獲得的溼菌體為酶源，以ph為6.0～9.0的緩衝液(優選磷酸鹽緩衝液)為反應介質構成轉化體系，在25℃～35℃、200r/min下轉化反應，反應結束後，獲得含(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的反應液，將反應液經分離純化，得到(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇。所述底物2-三氟甲基苯乙酮的初始濃度為5～100mmol/l緩衝液(優選5-25mmol/l)，惡臭假單胞菌zjph1606溼菌體的添加量以緩衝液體積計為50～300g/l緩衝液(優選100-300g/l)。

進一步，所述轉化體系中還添加輔助底物，所述輔助底物為下列一種或兩種及以上的任意組合：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甲醇、乙醇、甘油或異丙醇；所述輔助底物為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖或甘油時，加入量為20～300g/l緩衝液，輔助底物為甲醇、乙醇或異丙醇時，加入體積為緩衝液體積的10～30％。所述輔助底物為乳糖和甘油，此時所得產物的光學純度和產率最高。優選輔助底物為50-100g/l緩衝液的乳糖與300g/l緩衝液的甘油的混合。

本發明所述溼菌體由如下方法獲得：

(1)斜面培養：將惡臭假單胞菌zjph1606接種至斜面培養基，30℃培養2天，獲得斜面菌體；斜面培養基終濃度組成如下：葡萄糖10g/l，蛋白腖5g/l，酵母膏4g/l，(nh4)2so42g/l，kh2po41g/l，nacl0.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，瓊脂20g/l，溶劑為水，ph6.5；

(2)種子培養基：從培養成熟的斜面挑一環菌體接入裝有100ml種子培養基的250ml搖瓶中，30℃，200r/min培養24小時，獲得種子液；種子培養基終濃度組成：葡萄糖10g/l，蛋白腖5g/l，酵母膏4g/l，(nh4)2so42g/l，kh2po42g/l，nacl0.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，溶劑為水，ph6.5；

(3)發酵培養：以體積濃度8％的接種量將種子液轉接到裝有60ml發酵培養基的250ml搖瓶中，30℃，200r/min培養36小時至生物量達到7～10g(幹菌體)/l，培養結束後發酵液離心，並用ph值6～9的磷酸鹽緩衝液洗滌一次，收集溼菌體；發酵培養基終濃度組成：葡萄糖20～40g/l，牛肉膏20～40g/l，mgso4·7h2o2.0～5.0g/l，ph6.0～7.5。優選發酵培養基終濃度組成：葡萄糖35g/l，牛肉膏30g/l，mgso4·7h2o4g/l，溶劑為水，ph6.0。

本發明所述反應液分離純化方法為：反應結束後，將反應液用過乙酸乙酯萃取後，減壓濃縮蒸乾溶劑，濃縮物用矽膠g進行柱層析，乙酸乙酯：石油醚(1:3，v/v)混合溶液洗脫，收集目標產物，獲得(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇。

採用box-behnken旋轉中心組合實驗設計法對葡萄糖濃度、牛肉膏濃度和mgso4·7h2o濃度三個對產酶影響顯著的因素進行優化，得到惡臭假單胞菌(pseudomonassp.)zjph1606菌株的優化培養基組成為：葡萄糖20～40g/l，牛肉膏20～40g/l，mgso4·7h2o2.0～5.0g/l，ph6.0～7.5。

惡臭假單胞菌(pseudomonassp.)zjph1606的培養條件為：初始ph6.0～7.5，搖瓶裝液量80～120ml/250ml錐形瓶，培養溫度30℃、搖床轉速180～220rpm，接種量4～10％，培養時間36～48h。

本發明從土樣中篩選獲得了與以往同類研究報導不同的微生物新菌種，並且催化轉化的底物濃度和產率均較高，從而在研究微生物催化法製備手性中間體(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇方面提供了有益的參考。

本發明的有益效果主要體現在：本發明提供了一株可用於微生物催化不對稱還原2-三氟甲基苯乙酮製備(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的微生物新菌種，採用該新菌種催化製備光學純(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇具有底物濃度高，立體選擇性好，產物光學純度高等優點。本發明通過採用惡臭假單胞菌(pseudomonassp.)zjph1606細胞為催化劑的手性生物催化，當底物濃度為10mmol/l時，目的產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的ee達到99％，產率達到64％。

(四)附圖說明

圖1為底物標準品氣相色譜圖(含內標十二烷)；

圖2為消旋體產物標準品氣相色譜圖(含內標十二烷)；

圖3為惡臭假單胞菌(pseudomonassp.)zjph1606菌株生物還原反應萃取液氣相色譜圖(含內標十二烷)。

(五)具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此：

實施例1：菌株篩選鑑定

1、具體篩選方法如下：

(1)富集培養：將從浙江省杭州市下城區附近採集的土樣1g加入到裝有50ml富集培養基的250ml搖瓶中，30℃，200rpm，培養5～6d，待培養液變混濁後，取1ml培養液轉接至新鮮的富集培養基中，繼續培養5～6d，如此重複富集培養3～4次。富集培養基中以2-三氟甲基苯乙酮為唯一碳源。富集培養基配方如下：2-三氟甲基苯乙酮25mmol/l，(nh4)2so42g/l，kh2po42g/l，nacl0.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，溶劑為水，ph6.5。

(2)平板培養：隨後將最後一次富集培養液稀釋10-2、10-3、10-4倍，分別塗布到分離平板上，30℃，靜置培養2～3d，經多次分離培養後獲得單菌落菌株。平板培養基組成為富集培養基中加入15-20g/l的瓊脂。

(3)種子培養：挑取單菌落菌株接種到種子培養基，裝有100ml種子培養基的250ml搖瓶中，30℃，200r/min培養24小時。種子培養基配方如下：葡萄糖10g/l，蛋白腖5g/l，酵母膏4g/l，(nh4)2so42g/l，kh2po42g/l，nacl0.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，溶劑為水，ph6.5。

(4)發酵培養：以體積濃度8％的接種量將種子液轉接到裝有60ml發酵培養基的250ml搖瓶中，30℃，200r/min培養36小時至生物量達到7～10g(幹菌體)/l，將發酵液離心，收集溼菌體。發酵培養基終濃度組成：葡萄糖35g/l，牛肉膏30g/l，mgso4·7h2o4g/l，溶劑為水，ph6.0。

(5)生物轉化反應：將離心得到的溼菌體1.0g懸浮於10ml、ph值6.5的磷酸鹽緩衝液中，加入終濃度10mmol/l的2-三氟甲基苯乙酮底物、終濃度50g/l乳糖，置30℃、200rpm搖床中轉化24h。轉化結束後，轉化液用等體積乙酸乙酯萃取，經離心後得到上清液，採用手性氣相色譜法分析目的產物和殘留底物的含量，以及產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的光學純度。

(6)分析檢測：

gc法測定目標產物的光學純度和產率：反應萃取液中的產物和殘留底物的濃度採用氣相色譜分析，用內標法定量。內標物為十二烷。取1ml萃取液加入1μl十二烷進行分析。氣相色譜條件：日本島津gc-2014氣相色譜儀，浙大n2000色譜工作站；美國瓦裡安cp-chirasil-dex手性毛細管氣相色譜柱(25m×0.25mm×0.25μm)。載氣為高純氮氣，流量為2ml/min；進樣量1μl，分流比為15:1；檢測器和進樣口溫度均為250℃；色譜柱溫度80～160℃；升溫速度：8℃/min；檢測器為fid。底物,外消旋產物和生物催化產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇氣相色譜圖分別見圖1、圖2和圖3，目的產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的對映體過量值(ee值)，從中篩選得到所述的微生物新菌株zjph1606。

用相對校正因子分別計算出反應液中的底物和產物的濃度。進而求出反應的產率(yield)。計算式為:

產率＝ci/c0×100％

式中c0、ci分別為反應起始底物的摩爾濃度和反應結束時產物的摩爾濃度。

產物的光學純度由對映體過量值(enantiomericexcess，ee)來表示。

e.e.＝(cr-cs)/(cr+cs)×100％

式中cr和cs分別為r型和s型1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的摩爾濃度。

2、新菌種zjph1606的特徵如下：

生理生化特徵：革蘭氏染色陰性，不生芽孢，不運動，無莢膜，不產氣，專性需氧。可以利用的碳源有44種：糊精，d-麥芽糖、海藻糖、龍膽、蔗糖、棉子糖、α-d-乳糖、蜜二糖、d-水楊苷、n-乙醯-d-氨基葡萄糖、n-乙醯基-β-d-甘露糖、n-乙醯-d-半乳糖胺、n-乙醯神經氨酸、α-d-葡萄糖、d-甘露糖、d-果糖、d-半乳糖、3-甲基葡萄糖、海藻糖、l-巖藻糖、鼠李糖、肌苷、山梨醇、甘露醇、d-阿拉伯糖醇、肌醇、甘油、d-葡萄糖-6-po4、d-果糖--6-po4、d-天冬氨酸、d-絲氨酸、明膠、甘氨醯-l-脯氨酸、l-丙氨酸、l-精氨酸、l-焦穀氨酸、果膠、d-半乳糖醛酸、l-半乳糖酸內酯、丙酮酸甲酯、d-乳酸甲酯、吐溫40、γ-氨基丁酸、α-羥基丁酸。

菌種的16srdna序列特性：以提取到的細胞總dna為模板，利用通用引物p1和p2擴增菌株的16srdna基因(seqidno.1所示)，再將pcr產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳。經測序確認新菌株zjph1606的16srdna基因序列如下：

ctcctctgattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgttaagttggatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcaagctagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggaatccttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatgcagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgtaatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagcctagt

將菌株zjph1606的16srrna序列在ncbi網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行同源性比對(blast)，結果表明：菌株zjph1606與惡臭假單胞菌(pseudomonassp.pcfrb017)的部分菌株序列同源性較高。菌株zjph1604與pseudomonassp.菌株(genbank登錄號為no.ab548844.1)的序列同源性達到100％。

根據生理生化特性並結合分子生物學鑑定，該菌株被鑑定為惡臭假單胞菌(pseudomonassp.)，記為惡臭假單胞菌(pseudomonassp.)zjph1606。

實施例2：溼菌體細胞的獲得

(1)斜面培養：將惡臭假單胞菌zjph1606接種至斜面培養基，30℃培養2天，獲得斜面菌體，4℃冰箱保存。斜面培養基終濃度組成如下：葡萄糖10g/l，蛋白腖5g/l，酵母膏4g/l，(nh4)2so42g/l，kh2po41g/l，nacl0.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，瓊脂20g/l，溶劑為水，ph6.5。

(2)種子培養基：從培養成熟的斜面挑一環菌體接入裝有100ml種子培養基的250ml搖瓶中，30℃，200r/min培養24小時，獲得種子液。種子培養基終濃度組成：葡萄糖10g/l，蛋白腖5g/l，酵母膏4g/l，(nh4)2so42g/l，kh2po42g/l，nacl0.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，溶劑為水，ph6.5。

(3)發酵培養：以體積濃度8％的接種量將種子液轉接到裝有60ml發酵培養基的250ml搖瓶中，30℃，200r/min培養36小時至生物量達到7～10g(幹菌體)/l，培養結束後發酵液離心，並用ph值6～9的磷酸鹽緩衝液洗滌一次，收集溼菌體細胞，備用。發酵培養基終濃度組成：葡萄糖35g/l，牛肉膏30g/l，mgso4·7h2o4g/l，溶劑為水，ph6.0。

實施例3：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph6.5)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為100g/l；加入終濃度10mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應24h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為1.3mmol/l，光學純度ee值99％，產率14.1％。

實施例4：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph6.5)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為100g/l；加入終濃度10mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入100g/l緩衝液的乳糖作為輔助底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應24h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為4.1mmol/l，光學純度ee值99％，產率41％。

實施例5:

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph6.5)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為100g/l；加入終濃度10mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入100g/l緩衝液的甘油作為輔助底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應24h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為3.9mmol/l，光學純度ee值99％，產率39％。

實施例6：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph6.5)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為200g/l；加入終濃度10mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入終濃度100g/l緩衝液的乳糖作為輔助底物，置於37℃，200r/min的搖床中反應24h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為3.8mmol/l，光學純度ee值99％，產率38％。

實施例7：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph7.0)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為150g/l；加入終濃度10mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入300g/l緩衝液的甘油作為輔助底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應48h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為4.0mmol/l，光學純度ee值99％，產率40％。

實施例8：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於15ml磷酸鹽緩衝液(ph6.5)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計濃度為200g/l；加入終濃度15mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入終濃度200g/l緩衝液的甘油作為輔助底物，置於37℃，200r/min的搖床中反應48h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為4.5mmol/l，光學純度ee值99％，產率30％。

實施例9：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph7.0)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為100g/l；加入終濃度25mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入終濃度100g/l緩衝液的乳糖和終濃度300g/l緩衝液的甘油作為輔助底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應24h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為10.2mmol/l，光學純度ee值99％，產率41％。

實施例10：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於20ml磷酸鹽緩衝液(ph7.0)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為200g/l；加入終濃度10mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入終濃度50g/l緩衝液的乳糖和300g/l緩衝液的甘油作為輔助底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應48h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為5.4mmol/l，光學純度ee值99％，產率54％。

實施例11：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph7.4)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為300g/l；加入終濃度10mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入終濃度50g/l緩衝液的乳糖和終濃度300g/l緩衝液的甘油作為輔助底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應24h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為6.4mmol/l，光學純度ee值99％，產率64％。

實施例12：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph7.4)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計濃度為250g/l；加入終濃度5mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入終濃度50g/l緩衝液的乳糖和終濃度300g/l緩衝液的甘油作為輔助底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應36h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為4.3mmol/l，光學純度ee值99％，產率86％。

實施例13：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph8.0)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為250g/l；加入終濃度15mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入終濃度300g/l緩衝液的甘油作為輔助底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應36h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為6.1mmol/l，光學純度ee值99％，產率40％。

實施例14：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph9.0)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為100g/l；加入終濃度25mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入終濃度300g/l緩衝液的葡萄糖作為輔助底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應48h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為3.2mmol/l，光學純度ee值99％，產率12.8％。

實施例15：

將實施例2所得的溼菌體懸浮於10ml磷酸鹽緩衝液(ph9.0)中，其中溼菌體用量以緩衝液體積計為300g/l；加入終濃度20mmol/l緩衝液的2-三氟甲基苯乙酮作為底物，再加入50g/l緩衝液的乳糖和300g/l緩衝液的甘油作為輔助底物，置於30℃，200r/min的搖床中反應48h。採用實施例1的檢測方法，產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的濃度為10.4mmol/l，光學純度ee值99％，產率52％。

實施例16：

將實施例12所得反應產物，經過乙酸乙酯萃取後，濃縮，蒸乾溶劑，用矽膠g進行柱層析，乙酸乙酯：石油醚(1:3，v/v)混合溶液洗脫，收集目標產物，分離純化得到產物(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇，收率72.6％，產物純度大於97％。

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浙江醫藥高等專科學校，浙江工業大學

一種惡臭假單胞菌及在製備(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇中的應用

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