無固定點靶物質的適配體篩選方法

2023-05-16 22:00:06

專利名稱：無固定點靶物質的適配體篩選方法
技術領域：
本發明涉及的是一種分析化學核酸適配體篩選技術領域的方法，具體涉及一種利用鏈黴親和素標記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，並通過SELEX技術篩選無固定點靶物質的適配體的方法。
背景技術：
SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,即指數富集配體系統體外進化)技術是20世紀90年代初發展起來的一種新的組合化學技術。利用該技術可以從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選到特異性與靶物質高度親和的核酸適配體。其基本思路是體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，與靶物質混合，形成靶物質-核酸複合物，洗脫未結合的核酸，分離與靶物質結合的核酸分子，並以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進入下輪的篩選。通過重複的篩選與擴增，一些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中未和力的核酸分子被洗去，而與祀物質有強未和力的核酸分子從非常大的隨機庫中分尚出來，且純度隨SELEX過程的進行而增高，最後佔據庫的大多數(>90%左右)。自Tuerk和Ellington等首先運用此技術篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異核酸適配體後，經過十幾年的發展，SELEX技術已經成為一種重要的研究手段和工具。SELEX過程中的關鍵步驟是將未結合的核酸與能與靶物質結合的核酸分開。大多數研究者選擇將靶物質固定，當單鏈寡核苷酸庫與靶物質混合，能與靶物質結合的核酸分子隨著靶物質一起留在固定介質上後，洗去不能結合的核酸。通過固定靶物質的方法，人們運用SELEX技術已成功篩選到包括有機染料、藥物、胺基酸、細胞因子、輔因子、氨基糖苷、氨基類似物、核苷酸和多肽等物質的適配體。但運用該方法的前提是靶物質有固定點，因此有關無固定點靶物質適配體的篩選少見報導。

發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種無固定點靶物質的適配體篩選方法，通過固定寡核苷酸文庫，洗脫未固定的核酸，正向篩選時加入靶物質與固定的核酸作用，洗脫下能與靶物質結合的核酸分子，PCR擴增後用於下一輪篩選；反向篩選時加入與靶物質性質或結構類似的物質，洗脫除去與靶物質非特異性結合的核酸分子。經過多輪次的正、反向篩選，得到能與靶物質高特異性、強親和力作用的核酸適配體。將本方法應用於重金屬鎘離子適配體的篩選，得到13條能與鎘離子高特異性、強親和力作用的適配體。本發明固定效果好、適用性強且成本低，可用於無固定點靶物質的適配體篩選。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明通過構建隨機寡核苷酸文庫以及用於PCR擴增的上遊引物和下遊引物和固定寡核苷酸文庫引物，並利用鏈黴親和素標記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，最終通過SELEX方法篩選得到可用於克隆測序的PCR產物，經測序後得到與無固定點靶物質特異親和性結合的適配體。所述的隨機寡核苷酸文庫的序列為:
5』 -ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3』，其中:兩端分別為Seq ID N0.1和Seq ID N0.2所示的19bp的固定序列，中間30個鹼基為隨機序列。因30個鹼基中每個鹼基有4種可能組成，故此隨機寡核苷酸文庫理論庫容量為430，理論上可從中篩選出任何靶物質的適配體。所述的上遊引物，即Pl序列，如Seq ID N0.1所示，為5』 -ACCGACCGTGCTGGACTCT-3』 ；所述的下遊引物，即P2序列，如Seq ID N0.3所示，為5， -CGCAACGCTCGCTCATACT-3，；所述的固定寡核苷酸文庫引物，即P3序列，為5， -Biotin-CGCAACGCTCGCTCATACT-3』其中:P3序列由Biotin (生物素，與鏈黴親和素有很強作用力)和Seq ID N0.3所示的下遊引物序列組成。所述的固 定寡核苷酸文庫是指:將含有隨機寡核苷酸文庫與含有固定寡核苷酸文庫引物的水溶液混合後進行退火處理，然後將將退火後的混合液加入到裝有表面接枝親和素的瓊脂糖的柱子中，通過生物素-親和素作用將隨機寡核苷酸庫固定在瓊脂糖顆粒上。所述的混合是指:以摩爾比為1: 2 3的比例混合。所述的退火處理是指:在94° C環境下變性60s;然後在59° C環境下退火60min ;再在25。C環境下延伸5min，其中:退火過程及延伸過程的降溫速度為0.1° C/s。所述的固定寡核苷酸文庫在SELEX方法篩選前經緩衝液充分洗滌，離心除去未固定的寡核苷酸和P3序列。所述的SELEX方法是指:依次進行若干輪的正向SELEX篩選和反向SELEX篩選。所述的正向SELEX篩選是指:向固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒加入無固定點靶物質，經孵育後離心處理並收集離心液，作為非對稱PCR擴增的模板，經PCR程序擴增後收集產物並純化，作為後續正向篩選用文庫，使得無固定點靶物質濃度降低。所述的無固定點靶物質的濃度可參考美國環保署(EPA)及世界衛生組織(WHO)的相關規定來設定。所述的孵育是指:無固定點靶物質與固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒在一定溫度下作用一段時間。所述的擴增是指:擴大上述收集的離心液中能與靶物質作用的寡核苷酸的含量。所述的正向SELEX篩選的次數優選為以無固定點靶物質濃度降低至標準檢出限(具體濃度可參考美國環保署(EPA)及世界衛生組織(WHO)的相關規定)以下時終止，並進行反向SELEX篩選。所述的反向SELEX篩選是指:當靶物質為某種重金屬離子，則向固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒先加入與無固定點靶物質性質或結構類似的不同的重金屬離子，孵育後離心處理並去除離心液，然後加入無固定點靶物質，孵育後離心處理並收集離心液，作為PCR擴增寡核苷酸的模板，經PCR程序擴增後收集產物並純化，作為後續反向篩選的文庫。所述的反向SELEX篩選的次數優選為3 5次。本發明的原理在於:體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，通過生物素與親和素之間的作用將單鏈寡核苷酸固定在介質上，洗脫未固定的核苷酸，正向篩選時，加入無固定點靶物質與固定的核苷酸孵育，孵育過程中有核苷酸與靶物質發生親和性作用，該作用足以克服生物素與親和素之間的作用力，當分離靶物質與固定介質時，結合部分的核苷酸就隨著靶物質脫離固定介質，再分離與靶物質結合的核酸分子，並以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進入下輪的正向篩選。通過重複的正向篩選與擴增，一些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中親和力的核酸分子被離去。反向篩選時，在加入靶物質之前，先加入與靶物質結構或性質類似的其他物質與固定的核酸作用，若有核酸分子隨該物質從固定介質上脫離，則其為靶物質的非特異性結合核酸，也當被除去。如此經過多輪次的正、反向篩選，最終將與靶物質有高特異性、強親和力的核苷酸分子從隨機庫中分離出來，該核酸分子即為靶物質的適配體。
技術效果與現有技術相比，本發明提供的篩選方法不需要大型儀器設備，固定效果好、操作方便、適用性強且成本低，可用於無固定點靶物質的適配體篩選。


圖1為本發明鎘離子核酸適配 體篩選的技術路線示意圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
實施例1如圖1所示，本實施例包括以下步驟:步驟I)構建總長度為68bp的隨機寡核苷酸文庫，寡核苷酸文庫的序列為:5』_ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3』，其中兩端為 19bp 的固定序列，中間 30個鹼基為隨機序列。步驟2)設計三條引物，其中 Pl(5』-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3』)和P2 (5 』 -CGCAACGCTCGCTCATACT-3，)分別用作PCR擴增寡核苷酸的上遊引物和下遊引物，P3 (5』-Biotin-CGCAACGCTCGCT CATACT-3』)用於將寡核苷酸文庫固定在鏈黴親和素標記的瓊脂糖顆粒上。步驟3)取隨機寡核苷酸文庫，與P3序列按體積比1:2 3均勻混合，混合液進行退火處理，退火條件為:94° C變性60s，59° C退火60min，25° C延伸5min，降溫速度為
0.1° C/s。退火過程中寡核苷酸3』端的19個鹼基將與P3形成配對。將退火後的混合液加入到裝有表面接枝親和素的瓊脂糖的柱子中，通過生物素-親和素作用將隨機寡核苷酸庫固定在瓊脂糖顆粒上。用緩衝液充分洗滌，離心除去未固定的寡核苷酸和P3序列。步驟4)向上述柱子中加入一定200 μ M鎘離子進行正向篩選，孵育一定時間後離心，收集離心液。步驟5)將上述收集的離心液用作非對稱PCR擴增的模板，經一定的PCR程序擴增後，收集PCR產物並純化，用作下一輪篩選的文庫。
步驟6)按步驟3)和4)做下一輪篩選，每進行一輪篩選，將步驟(4)中加入的鎘離子濃度降低。步驟7)當鎘離子濃度降低至0.002 μ M時，按步驟3)-5)進行反向篩選。步驟4)中加入鎘離子之前，先加入其他的金屬離子，孵育一定時間後離心，棄掉離心液，再向柱子中加入200 μ M鎘離子，孵育一定時間後離心，收集離心液，用作PCR擴增寡核苷酸的模板，經一定的PCR程序擴增後，收集PCR產物並純化，用作下一輪反向篩選的文庫。經過十輪正向SELEX篩選後得到的結果分析如下:
權利要求
1.一種無固定點靶物質的適配體篩選方法，其特徵在於，通過構建隨機寡核苷酸文庫以及用於PCR擴增的上遊引物和下遊引物和固定寡核苷酸文庫引物，並利用鏈黴親和素標記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，最終通過SELEX方法篩選得到可用於克隆測序的PCR產物，經測序後得到與無固定點靶物質特異親和性結合的適配體； 所述的隨機寡核苷酸文庫的序列為: 5』 -ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3 』，其中:兩端分別為 Seq IDN0.1和Seq ID N0.2所不的19bp的固定序列，中間30個喊基為隨機序列； 所述的上遊引物，即Pl序列，如Seq ID N0.1所示； 所述的下遊引物，即P2序列，如Seq ID N0.3所示； 所述的固定寡核苷酸文庫引物，即P3序列，為5』-Biotin-CGCAACGCTCGCTCATACT-3』其中:P3序列由Biotin和Seq ID N0.3所示的下遊引物序列組成。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是，所述的固定寡核苷酸文庫是指:將含有隨機寡核苷酸文庫與含有固定寡核苷酸文庫引物的水溶液混合後進行退火處理，然後將將退火後的混合液加入到裝有表面接枝親和素的瓊脂糖的柱子中，通過生物素-親和素作用將隨機寡核苷酸庫固定在瓊脂糖顆粒上。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵是，所述的混合是指:以摩爾比為1:2 3的比例混合。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵是，所述的退火處理是指:在94°C環境下變性60s;然後在59° C環境下退火60min ;再在25° C環境下延伸5min，其中:退火過程及延伸過程的降溫速度為0.1° C/s。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵是，所述的固定寡核苷酸文庫在SELEX方法篩選前經緩衝液充分洗滌，離心除去未固定的寡核苷酸和P3序列。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵是，所述的SELEX方法是指:依次進行若干輪的正向SELEX篩選和反向SELEX篩選。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵是，所述的正向SELEX篩選是指:向固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒加入無固定點靶物質，經孵育後離心處理並收集離心液，作為非對稱PCR擴增的模板，經PCR程序擴增後收集產物並純化，作為後續正向篩選用文庫，使得無固定點祀物質濃度降低。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特徵是，所述的正向SELEX篩選的次數為以無固定點靶物質濃度降低至標準檢出限以下時終止，並進行反向SELEX篩選。
9.根據權利要求6所述的方法，其特徵是，所述的反向SELEX篩選是指:當靶物質為某種重金屬離子，則向固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒先加入與無固定點靶物質性質或結構類似的不同的重金屬離子，孵育後離心處理並去除離心液，然後加入無固定點靶物質，孵育後離心處理並收集離心液，作為PCR擴增寡核苷酸的模板，經PCR程序擴增後收集產物並純化，作為後續反向篩選的文庫。
10.根據權利要求6或9所述的方法，其特徵是，所述的反向SELEX篩選的次數為3 5次。
全文摘要
一種分析化學核酸適配體篩選技術領域的無固定點靶物質的適配體篩選方法，通過構建隨機寡核苷酸文庫以及用於PCR擴增的上遊引物和下遊引物和固定寡核苷酸文庫引物，並利用鏈黴親和素標記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，最終通過SELEX方法篩選得到可用於克隆測序的PCR產物，經測序後得到與無固定點靶物質特異親和性結合的適配體。將本方法應用於重金屬鎘離子適配體的篩選，得到13條能與鎘離子高特異性、強親和力作用的適配體。本發明固定效果好、適用性強且成本低，可用於無固定點靶物質的適配體篩選。
文檔編號C12Q1/68GK103114147SQ20131006384
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者周培, 吳遠根, 詹深山, 王法澤, 劉樂, 邢海波, 詹學佳 申請人:上海交通大學