一種新的人凝血栓蛋白-1介導因子及其應用和製備方法
2023-05-02 01:10:01 1
專利名稱：一種新的人凝血栓蛋白-1介導因子及其應用和製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明涉及新的編碼人凝血栓蛋白-1介導因子的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和製備。
凝血栓蛋白-1介導因子(Muskelin)是一種新發現的、廣泛表達的胞內凝血栓蛋白-1調節蛋白，它促使凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1)附著於細胞骨架並且是細胞黏附的中介體。(EMBO J 1998，Sep 1；17(17)；4976-74)凝血栓蛋白-1(TSP-1)是一種由血小板a-粒子釋放的對凝血酶有刺激作用的糖蛋白，也是生長和修復所需的胞外基質的成分之一，它的三聚體分子量為420kDa。有很多因子都對TSP-1的表達起調節作用，其蛋白通過胞外和胞內兩種途徑降解(Int J Biochem Cell Biol1997 Jun；29(6)861-5)。研究結果顯示，人黑素瘤細胞G361能在含有TSP-1的基質中迅速附著和擴散，然而，當TSP-1肝磷脂結合位被硫酸化、或與A2.5單克隆抗體結合，可選擇性的抑制細胞擴散而不會影響附著功能；當單克隆抗體結合在凝血栓蛋白-1的其它功能域上，則可有力地抑制其附著功能。(Cancer Metastasis Rev 1992 Nov；11(3-4)313-24)凝血栓蛋白-1調節因子(Muskelin)主要存在於細胞質中，或附著於細胞膜上，對果蠅的kelch ORF1蛋白和C2C12細胞的研究表明，其功能是刺激細胞附著於TSP-1的C』端，TPS-1調節因子缺失會造成含有TSP-1附著劑的細胞在細胞的黏附、擴散和細胞骨架組織方面的活性降低。
凝血栓蛋白-1介導因子是通過其在細胞內對分子的粘附而對細胞的移動、細胞增殖、神經突的生長及血管生成起調節作用。對這些活性的潛在分子機制的研究已經表明，凝血栓蛋白-1在醫學上可用於止血法和血管生成。因此，為治療目的研究和開發人凝血栓蛋白-1介導因子及其激動劑/抑制劑有重要意義。
本發明的一個目的是提供新的分離的人凝血栓蛋白-1介導因子多肽。本發明的多肽鑑定為人凝血栓蛋白-1介導因子是經過胺基酸同源比較得出的。
本發明的另一個目的是提供編碼人凝血栓蛋白-1介導因子多肽的DNA序列。
本發明的另一個目的是提供編碼人凝血栓蛋白-1介導因子多肽的重組表達載體。
本發明的另一個目的是提供含有編碼人凝血栓蛋白-1介導因子多肽的重組表達載體的宿主細胞。
本發明的另一個目的是提供生產編碼人凝血栓蛋白-1介導因子多肽的方法。本發明的另一個目的是提供針對本發明的人凝血栓蛋白-1介導因子多肽的抗體和拮抗劑。
本發明的另一個目的是提供診斷治療與人凝血栓蛋白-1介導因子多肽功能異常相關的疾病的方法。例如本發明多肽或多核苷酸可用於腫瘤、脊髓發育不良、骨硬化等相關疾病的治療。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
在本發明的一個實施方案中，本發明提供了一種分離的或基本上純的人凝血栓蛋白-1介導因子多肽，其基本上由SEQ ID NO2所示的胺基酸序列組成。本發明的多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫中發現的。它包含的多核苷酸序列全長為3011個鹼基，其開放讀框為SEQ ID NO1中24-2231位，編碼735個胺基酸的人凝血栓蛋白-1介導因子。根據胺基酸序列同源比較發現，此多肽與灰鼠凝血栓蛋白-1介導因子之間也有高度同源性，因此被確定為是人的凝血栓蛋白-1介導因子。
術語「分離的」是指材料從其原始環境中被提取。例如，在一個活的動物體內存在的多核苷酸不是分離的，而從天然系統中的一部分或所有共存材料中分離出來的同樣的多核苷酸就是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體或某組合物的一部分，只要這些載體或組合物不是其天然環境的一部分，則多核苷酸仍然是分離的。
本發明的多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫中發現的。它在結構上具有凝血栓蛋白-1介導因子的特徵，同時，此蛋白和灰鼠凝血栓蛋白-1介導因子之間也有高度同源性，在整個胺基酸序列的735個蛋白中有728個蛋白相同，即有99％同源性。
本發明中的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，其中的DNA可以是cDNA、基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈的或單鏈的，如果是單鏈的則可以是編碼鏈或是非編碼鏈(反義鏈)。編碼此成熟多肽的多核苷酸序列可以和SEQ ID NO1所示的核酸序列相同，或者可以是編碼與SEQ ID NO2所示蛋白相同的成熟多肽，但與SEQ ID NO1所示核酸序列不同的多核苷酸。
本發明中的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上面描述的多核苷酸變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。由上可見，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明的多核苷酸還可以是包括前導序列的多核苷酸；編碼一個有成熟蛋白和附加的胺基酸殘基的多肽(蛋白原)的多核苷酸。這樣，本發明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白，或有序列原的蛋白，或同時具有序列原和前導序列的蛋白。
本發明還涉及這樣的多核苷酸，即當其與本發明所描述的多核苷酸序列有50％～70％相同的序列時可與之雜交。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。
術語「嚴格條件」「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
根據本發明的又一個方面，提供的人凝血栓蛋白-1介導因子應包括如SEQ ID NO2的胺基酸序列的多肽和這種多肽的片段、類似物和衍生物。術語『片段』、『衍生物』和『類似物』是指與本發明所述的多肽有相同的生物學功能或活性的多肽。這樣，類似物也包括了切除蛋白原部分能被激活產生活性成熟多肽的蛋白原。
本發明中的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優選是重組多肽。
本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主細胞(例如，細菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據所用的宿主細胞的不同，本發明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括一個起始的甲硫氨酸殘基。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均一。
本發明還涉及包含本發明的多核苷酸的載體，和含有本發明所述的多核苷酸的遺傳工程宿主細胞和用重組技術生產本發明所述的多肽的方法。
本發明中可用於包含多核苷酸序列的載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，比如，細菌質粒；噬菌體DNA；酵母質粒；植物細胞病毒；哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒。總之，只要能在宿主體內複製存活，任何質粒和載體都可以用。
表達載體最好含有提供篩選轉化的宿主細胞的表型性狀的基因，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或大腸桿菌用的四環素或氨苄青黴素抗性。
可以用合適的表達調控序列(啟動子)與表達載體中的DNA序列連接在一起以指導mRNA合成。這些啟動子中有代表性的例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中的表達的啟動子。表達載體還包括有翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入一個增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順勢作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子增強基因的轉錄。例子包括在複製起始點晚期一側的100到270個鹼基對的SV40增強子，細胞肥大病毒早期啟動子增強子，在複製起始點晚期一側的多瘤增強子，和腺病毒增強子。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。有代表性的例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞；腺病毒等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。目標的多核苷酸序列可以通過各種各樣的步驟插入載體上合適的限制性內切酶位點內，構建完的載體可以用來轉化適當宿主細胞以表達此蛋白。
當適當的宿主轉化並生長到適當的細胞密度後，選用的啟動子即可用適當的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導，細胞再培養一段時間。
細胞經離心後收穫，用物理或化學的方法破碎細胞，得到的粗提物留作進一步純化用。破碎包括凍融法、超聲波法、機誡破碎法、或使用細胞裂解試劑。
用硫酸銨或乙醇沉澱，酸抽提，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維層析，疏水相互作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析或植物凝激素層析等方法可將蛋白從重組細胞培養物中回收並純化出來。如果需要，可以使用蛋白質再摺疊步驟以完成成熟蛋白的構象。最後，可以使用高效液相層析(HPLC)來完成最後的純化步驟。
人凝血栓蛋白-1介導因子是通過其在細胞內對分子的粘附而對細胞的移動、細胞增殖、神經突的生長及血管生成起調節作用，因而人凝血栓蛋白-1介導蛋白在醫學上可用於治療免疫系統疾病、惡性腫瘤疾病等，例如獲得性和遺傳性的免疫缺陷、退行性神經疾病、脊髓發育不良疾病、局部貧血性傷害和骨硬化症。
本發明的多肽主要應用於惡性疾病診斷和治療，包括白血病和淋巴瘤類；上皮細胞起源的腫瘤類；間質起源的腫瘤，如肉瘤類；中樞神經系統腫瘤類，特別優選地，可用於治療人的惡性黑素瘤。
本發明的多肽對免疫組織的損傷、缺陷或失調類疾病也有作用，特別是可用於造血系統疾病(如惡性貧血)，皮膚病(如鱗狀上皮細胞癌)等。
本發明的人凝血栓蛋白-1介導因子與灰鼠的凝血栓蛋白-1介導因子(Muskelin)具有99％的同源性，但本發明的多肽來源於人cDNA文庫，更適用於人的疾病治療，特異性高，且不會產生抗體。
現在已經知道了許多種檢測人凝血栓蛋白-1的表達方法，這就提供了一個診斷突變的或非正常水平的人凝血栓蛋白-1介導因子表達的途徑。從而可以根據診斷結果來使用人凝血栓蛋白-1介導因子及其拮抗劑進行各種疾病的治療，也可以在各種疾病的治療期間監控人凝血栓蛋白-1介導因子的表達水平。
人凝血栓蛋白-1介導因子的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等等。
人凝血栓蛋白-1介導因子的拮抗劑可以與人凝血栓蛋白-1介導因子結合併消除其功能，或是抑制人凝血栓蛋白-1介導因子的產生，或是與多肽的活性位點結合使多肽不能發揮生物學功能。用人凝血栓蛋白-1介導因子的拮抗劑可以治療與腫瘤相關的許多疾病，例如人的惡性黑素瘤、人上皮細胞鱗狀癌等等。
本發明的多肽，及其片斷、衍生物、類似物或它們的細胞可以用來作為抗原以生產抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體，且更適合應用於人類。製備單克隆抗體的技術包括雜交瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術，EBV-雜交瘤技術等。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將人凝血栓蛋白-1介導因子加入生物分析測定中，通過測定化合物影響人凝血栓蛋白-1介導因子和其受體之間的相互作用來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。
可以將本發明的多肽和拮抗劑與合適的藥物載體組合後使用。這些載體可以是水，葡萄糖，乙醇，鹽類，緩衝鹽類，甘油以及它們的組合。組合物內包含有效劑量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用於疾病治療。
本發明的多核苷酸可以用於疾病治療，即基因治療，其中包括細胞體內工程化和反義構建體等。
將生產含有編碼本發明的多肽的RNA的病毒顆粒的生產細胞提供患者，以使細胞在體內工程化並在體內表達此多肽。工程化細胞的表達載體可以是反轉錄病毒、腺病毒等。
反義構建體的構建可以通過反義DNA、RNA用來控制基因表達來完成。例如編碼本發明的成熟多肽的多核苷酸序列的5′編碼區用來設計長度為從10到40個鹼基對的反義RNA寡聚核苷酸。反義RNA寡聚核苷酸在體內與mRNA雜交並阻斷mRNA分子翻譯成人凝血栓蛋白-1介導因子，或是反義RNA寡聚核苷酸遞送到細胞內以使反義RNA或DNA在體內表達，從而抑制人凝血栓蛋白-1介導因子的產生。
本發明的多核苷酸也可以用於診斷。如染色體水平上的檢測、DNA水平上的檢測等。
將cDNA克隆與中期染色體進行螢光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。當序列被精確定位到染色體上後，此序列在染色體上的物理位置即可與遺傳圖譜數據相吻合。然後通過分析，可以確定本發明的多核苷酸與一些已經定位到染色體上的疾病的關係。
全長的人凝血栓蛋白-1介導因子基因及其片斷可以用於檢測人凝血栓蛋白-1介導因子相關的疾病或疾病的易感性診斷。從患者的血液、脊髓和組織活體解剖的細胞中獲得的核酸可以通過各種技術在DNA水平上檢測突變。如雜交，化學裂解，DNA直接測序，基因組DNA的Southern雜交等。
本發明多肽和多核苷酸還具有其他用途，例如，本發明多肽可用於肽指紋圖譜鑑定；本發明的編碼序列或其片段可用於製造基因晶片或微陣列。根據本發明的教導，這些應用對於本領域技術人員而已是顯而易見的下面的實施例將進一步說明本發明，但不是以此來限制本發明。
實施例1、編碼人凝血栓蛋白-1介導因子的cDNA的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene)從總RNA中分離poly(A) mRNA。2ug poly(A) mRNA經逆轉錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到，體的多克隆位點上，轉化DH5α細菌形成cDNA文庫。共獲得3028個克隆。用雙脫氧法測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列資料庫進行比較，結果發現有一個克隆(103B11)的DNA序列為新的DNA，基因長度為3011bp。通過合成一系列引物對該克隆所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明，該克隆所含的全長cDNA是一個新的DNA序列(如Seq ID No 1所示)，該序列被命名為pBS-HTSP1，從第24至2231位有一個2207bp的ORF，編碼一個新的蛋白質(如Seq ID No 2所示)。此蛋白質被命名為人凝血栓蛋白-1介導因子。
實施例2、人凝血栓蛋白-1介導因子在大腸桿菌系統中的表達和純化根據該新的人凝血蛋白-1介導因子相應的基因序列，設計出一對特異性擴增引物，序列如下正向引物5』-GCGGCCGCTACGGTGCTG-3』，反向引物5』-GGACTCCCATAGGGCGA-3』；此倆段序列分別含有ApaⅠ和EcoR1酶切位點，其後分別為目的基因3』端和5』端的編碼序列，以含有全長目的基因的pBS質粒為模板，進行PCR反應。ApaⅠ和EcoR1的酶切位點相應於表達載體質粒上的選擇性內切酶位點。用ApaⅠ和EcoR1分別對擴增序列和質粒PTSA-18進行酶切並連接。將重組質粒轉化入宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)plySs，並IPTG誘導進行表達。表達產物經過超聲破菌和熱變性，再上DEAE柱，得到了純化的目的人凝血栓蛋白-1介導因子蛋白。
實施例3、cDNA克隆的同源檢索用本發明提供的人凝血栓蛋白-1介導因子的多核苷酸的序列及其編碼的蛋白序列到Genbank，Swissport等資料庫進行同源檢索，用於檢索的程序叫Blast(Basic local Alignment search tool)(1993 Proc Nat Acad Sci905873-5877)，Blast可以找出與人凝血栓蛋白-1介導因子同源的許多基因，其中與本發明發明基因同源性最大的基因，其編碼的蛋白在Genbank的準入號為u72194。這些檢索到的基因或蛋白序列可以從Genbank資料庫中調出。調出的序列可以用GCG軟體包中的Pileup(多序列)和Gap(兩序列)程序做連配比較。新蛋白的功能預測可以用Motif程序進行分析。同源檢索的結果顯示本發明提供的人凝血栓蛋白-1介導因子與灰鼠的凝血栓蛋白-1介導因子(Muskelin)具有99％的同源性(詳見下表)。＞gi 3493462(U72194)muskelin[Mus musculus]Length=735Plus Strand HSPsScore=3945(1388.7 bits)，Expect=0.0，P=0.0Identities=728/735(99％)，Positives=731/735(99％)，Frame=+3Query 24 MAAGGAVAAAPECRLLPYALHKWSSFSSTYLPENILVDKPNDQSSRWSSESNYPPQYLIL 203MAAGGAVA APECRLLPYALHKWSSFSSTYLPENILVDKPNDQSSRWSSESNYPPQYLILSbjct 1 MAAGGAVAVAPECRLLPYALHKWSSFSSTYLPENILVDKPNDQSSRWSSESNYPPQYLIL 60Query204 KLERPAIVQNITFGKYEKTHVCNLKKFKVFGGMNEENMTELLSSGLKNDYNKETFTLKHK 383KLERPAIVQNITFGKYEKTHVCNLKKFKVFGGMNEENMTELLSSGLKNDYNKETFTLKHKSbjct 61 KLERPAIVQNITFGKYEKTHVCNLKKFKVFGGMNEENMTELLSSGLKNDYNKETFTLKHK 120Query384 IDEQMFPCRFIKIVPLLSWGPSFNFSIWYVELSGIDDPDIVQPCLNWYSKYREQEAIRLC 563IDEQMFPCRFIKIVPLLSWGPSFNFSIWYVELSGIDDPDIVQPCLNWYSKYREQEAIRLCSbjct121 IDEQMFPCRFIKIVPLLSWGPSFNFSIWYVELSGIDDPDIVQPCLNWYSKYREQEAIRLC 180Query564 LKHFRQHNYTEAFESLQKKTKIALEHPMLTDIHDKLVLKGDFDACEELIEKAVNDGLFNQ 743LKHFRQHNYTEAFESLQKKTKIALEHPMLTD+HDKLVLKGDFDACEELIEKAVNDGLFNQSbjct181 LKHFRQHNYTEAFESLQKKTKIALEHPMLTDMHDKLVLKGDFDACEELIEKAVNDGLFNQ 240Query744 YISQQEYKPRWSQIIPKSTKGDGEDNRPGMRGGHQMVIDVQTETVYLFGGWDGTQDLADF 923YISQQEYKPRWSQIIPKSTKGDGEDNRPGMRGGHQMVIDVQTETVYLFGGWDGTQDLADFSbjct241 YISQQEYKPRWSQIIPKSTKGDGEDNRPGMRGGHQMVIDVQTETVYLFGGWDGTQDLADF 300Query924 WAYSVKENQWTCISRDTEKENGPSARSCHKMCIDIQRRQIYTLGRYLDSSVRNSKSLKSD 1103 實施例4Northern印跡分析人凝血栓蛋白-1介導因子的基因表達用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進地勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(491)，混合後離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)並將混合物離心得到RNA沉澱。
將得到的RNA沉澱用70％乙醇洗滌，乾燥並溶於水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。然後轉移至硝酸纖維素膜上。用32P-標記的探針(約2×106cpm/ml)在一溶液中於42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲醯胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。用α-32P dATP通過隨機引物法製備32P-標記的DNA探針。所用的DNA探針的PCR擴增的人凝血栓蛋白-1介導因子編碼區序列。雜交之後，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中於65℃洗30min。然後，用Phosphor Imager進行分析和定量。結果表明，人凝血栓蛋白-1介導因子基因可特異性在脊髓組織中表達。實施例5抗人凝血栓蛋白-1介導因子的抗體的製備用多肽合成儀(PE-ABI)合成下述人凝血栓蛋白-1介導因子凝血栓蛋白-1介導因子特異性的多肽Lys Leu Glu Arg Pro Ala Ile Val Gln Asn(胺基酸序列第61-70位)。將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成複合，方法參見Avrameas.Immunochemistry，1969；6∶43。用4mg上述血藍蛋白多肽複合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天後再用血藍蛋白多肽複合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。採用經15μg/ml牛血清白蛋白多肽複合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結合於溴化氰活化的Sepharose 4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉澱法證明純化的抗體可特異性地與本發明的人凝血栓蛋白-1介導因子結合。
序列表(1)一般信息
(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度3011bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1 (2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度735個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21 Met Ala Ala Gly Gly Ala Val Ala Ala Ala Pro Glu Cys Arg Leu16 Leu Pro Tyr Ala Leu His Lys Trp Ser Ser Phe Ser Ser Thr Tyr31 Leu Pro Glu Asn Ile Leu Val Asp Lys Pro Asn Asp Gln Ser Ser46 Arg Trp Ser Ser Glu Ser Asn Tyr Pro Pro Gln Tyr Leu Ile Leu61 Lys Leu Glu Arg Pro Ala Ile Val Gln Asn Ile Thr Phe Gly Lys76 Tyr Glu Lys Thr His Val Cys Asn Leu Lys Lys Phe Lys Val Phe91 Gly Gly Met Asn Glu Glu Asn Met Thr Glu Leu Leu Ser Ser Gly106 Leu Lys Asn Asp Tyr Asn Lys Glu Thr Phe Thr Leu Lys His Lys121 Ile Asp Glu Gln Met Phe Pro Cys Arg Phe Ile Lys Ile Val Pro136 Leu Leu Ser Trp Gly Pro Ser Phe Asn Phe Ser Ile Trp Tyr Val151 Glu Leu Ser Gly Ile Asp Asp Pro Asp Ile Val Gln Pro Cys Leu166 Asn Trp Tyr Ser Lys Tyr Arg Glu Gln Glu Ala Ile Arg Leu Cys181 Leu Lys His Phe Arg Gln His Asn Tyr Thr Glu Ala Phe Glu Ser196 Leu Gln Lys Lys Thr Lys Ile Ala Leu Glu His Pro Met Leu Thr211 Asp Ile His Asp Lys Leu Val Leu Lys Gly Asp Phe Asp Ala Cys226 Glu Glu Leu Ile Glu Lys Ala Val Asn Asp Gly Leu Phe Asn Gln241 Tyr Ile Ser Gln Gln Glu Tyr Lys Pro Arg Trp Ser Gln Ile Ile256 Pro Lys Ser Thr Lys Gly Asp Gly Glu Asp Asn Arg Pro Gly Met271 Arg Gly Gly His Gln Met Val Ile Asp Val Gln Thr Glu Thr Val286 Tyr Leu Phe Gly Gly Trp Asp Gly Thr Gln Asp Leu Ala Asp Phe301 Trp Ala Tyr Ser Val Lys Glu Asn Gln Trp Thr Cys Ile Ser Arg316 Asp Thr Glu Lys Glu Asn Gly Pro Ser Ala Arg Ser Cys His Lys331 Met Cys Ile Asp Ile Gln Arg Arg Gln Ile Tyr Thr Leu Gly Arg346 Tyr Leu Asp Ser Ser Val Arg Asn Ser Lys Ser Leu Lys Ser Asp361 Phe Tyr Arg Tyr Asp Ile Asp Thr Asn Thr Trp Met Leu Leu Ser376 Glu Asp Thr Ala Ala Asp Gly Gly Pro Lys Leu Val Phe Asp His391 Gln Met Cys Met Asp Ser Glu Lys His Met Ile Tyr Thr Phe Gly406 Gly Arg Ile Leu Thr Cys Asn Gly Ser Val Asp Asp Ser Arg Ala421 Ser Glu Pro Gln Phe Ser Gly Leu Phe Ala Phe Asn Cys Gln Cys436 Gln Thr Trp Lys Leu Leu Arg Glu Asp Ser Cys Asn Ala Gly Pro451 Glu Asp Ile Gln Ser Arg Ile Gly Arg Cys Met Leu Phe His Ser466 Lys Asn Arg Cys Leu Tyr Val Phe Gly Gly Gln Arg Ser Lys Thr481 Tyr Leu Asn Asp Phe Phe Ser Tyr Asp Val Asp Ser Asp His Val496 Asp Ile Ile Ser Asp Gly Thr Lys Lys Asp Ser Gly Met Val Pro511 Met Thr Gly Phe Thr Gln Arg Ala Thr Ile Asp Pro Glu Leu Asn526 Glu Ile His Val Leu Ser Gly Leu Ser Lys Asp Lys Glu Lys Arg541 Glu Glu Asn Val Arg Asn Ser Phe Trp Ile Tyr Asp Ile Val Arg556 Asn Ser Trp Ser Cys Val Tyr Lys Asn Asp Gln Ala Ala Lys Asp571 Asn Pro Thr Lys Ser Leu Gln Glu Glu Glu Pro Cys Pro Arg Phe586 Ala His Gln Leu Val Tyr Asp Glu Leu His Lys Val His Tyr Leu601 Phe Gly Gly Asn Pro Gly Lys Ser Cys Ser Pro Lys Met Arg Leu616 Asp Asp Phe Trp Ser Leu Lys Leu Cys Arg Pro Ser Lys Asp Tyr631 Leu Leu Arg His Cys Lys Tyr Leu Ile Arg Lys His Arg Phe Glu646 Glu Lys Ala Gln Val Asp Pro Leu Ser Ala Leu Lys Tyr Leu Gln661 Asn Asp Leu Tyr Ile Thr Val Asp His Ser Asp Pro Glu Glu Thr676 Lys Glu Phe Gln Leu Leu Ala Ser Ala Leu Phe Lys Ser Gly Ser691 Asp Phe Thr Ala Leu Gly Phe Ser Asp Val Asp His Thr Tyr Ala706 Gln Arg Thr Gln Leu Phe Asp Thr Leu Val Asn Phe Phe Pro Asp721 Ser Met Thr Pro Pro Lys Gly Asn Leu Val Asp Leu Ile Thr Leu參考文獻
權利要求
1．一種分離的人凝血栓蛋白-1介導因子多肽，它包含具有SEQ ID No.2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2．如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID No.2胺基酸序列的多肽。
3．一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少80％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4．如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ ID No.2所示胺基酸序列的多肽。
5．如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID No.1中24-2231位的序列；(b)具有SEQ ID No.1中1-3011位的序列。
6．一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7．一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它是選自下組的一種宿主細胞(a)用權利要求6所述的載體轉化的宿主細胞；(b)用權利要求3所述的多核苷酸轉導的宿主細胞。
8．一種具有人凝血栓蛋白-1介導因子活性的多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達人凝血栓蛋白-1介導因子的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人凝血栓蛋白-1介導因子活性的多肽。
9．一種能與權利要求1所述的人凝血栓蛋白-1介導因子多肽特異性結合的抗體。
10．一種核酸分子，它含有權利要求3所述的多核苷酸中連續的10-3000核苷酸。
11．一種化合物，其特徵在於，它選自下組(a)模擬權利要求1所述多肽的活性的化合物，(b)促進權利要求1所述多肽的活性的化合物，(c)拮抗權利要求1所述多肽的活性的化合物，(d)抑制權利要求1所述多肽的表達的化合物。
12．如權利要求11所述的化合物，其特徵在於，它是SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列或其片段的反義序列。
13．一種應用權利要求11所述化合物來調節人凝血栓蛋白-1介導因子蛋白在體內、體外活性的方法。
14.一種檢測與權利要求1所述的多肽異常表達相關的疾病或疾病的易感性的方法，其特徵在於，包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中的突變。
15.如權利要求1所述的多肽的用途，其特徵在於，它被用於篩選促進人凝血栓蛋白-1介導因子多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人凝血栓蛋白-1介導因子多肽活性的拮抗劑、或者被用於肽指紋圖譜鑑定。
16.如權利要求10所述的核酸分子的用途，其特徵在於，它被作為引物用於PCR擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列。
17.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明公開了人凝血栓蛋白－1介導因子和編碼此多肽的DNA(RNA)以及通過重組技術生產此多肽的方法。本發明還公開了此多肽用於治療多種疾病的方法,如獲得性和遺傳性的免疫缺陷、退行性神經疾病、脊髓發育不良疾病、局部貧血性傷害、骨硬化病等。本發明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發明還公開了編碼該人凝血栓蛋白－1介導因子的多核苷酸的用途。
文檔編號C07K14/47GK1288056SQ9911685
公開日2001年3月21日 申請日期1999年9月10日 優先權日1999年9月10日
發明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海生元基因開發有限公司