一種利用一步或兩步隨機化反應製備皂甙庫的方法
2023-05-16 13:09:51 2
專利名稱：一種利用一步或兩步隨機化反應製備皂甙庫的方法
技術領域：
本發明涉及一種皂甙庫的製備方法，具體的說是利用一步隨機糖苷化反應或者先經隨機醯化反應再經隨機糖苷化反應，兩步隨機化反應聯用製備各種皂甙庫。
近幾十年來，人們從自然界中分離得到了大量的結構新穎的皂甙化合物。許多研究結果表明皂甙具有多種生理活性和良好的藥理作用，如抗癌、抗菌、消炎、降血壓以及調節免疫功能等。皂甙是一類複雜的糖苷。從分子結構上來看，皂甙是由糖鏈與三萜或甾體通過碳氧共價鍵相連而成的。皂甙中的糖鏈一般較短，多含2-5個糖基，而且其糖基組成比較簡單，主要的糖基有葡萄糖、甘露糖、木糖、巖藻糖、鼠李糖和阿拉伯糖等。由於糖基上多個羥基的存在使皂甙的結構變化多樣，在自然界中它們往往以複雜的同系物存在。許多傳統的中草藥如人參、遠志、麥冬等的有效成分中都含有皂甙。這些有效成分是由多種結構相似的皂甙同系物組成的，它們可以同時起藥理作用。但是到目前為止，對於皂甙的合成還局限於傳統的上保護基一去保護基的分步方法上[Highly efficient glycosylation of sapogenins．Shaojiang Deng，BiaoYu，lianming Xie，Yongzheng Hui．J．Org．Chem．，1999,64,7265-7266]，這大大限制了皂甙化合物的合成和篩選過程。近年來Hindsgaul等人發展了用隨機糖苷化反應製備三糖庫的方法[A strategy of「random glycosylation」for the production of oliogosaccharide libraries．Osamu Kanie，Frank Barresi，Yili Ding，Jill Labbe，Albin otter，L．Scott Fors-berg，Beat ernst，Ole Hindsgaul．Angew．Chem．Iht．Ed．Engl．，1995,34,2720-2722]，但是迄今為止，還沒有製備皂甙庫的報導。因此，發展組合化學的方法從易得的甙元和單糖出發簡便地製備含有所有可能同系物的皂甙庫是很有意義的。
本發明的目的是提供一種利用一步或兩步隨機化反應製備皂甙庫的方法。通過化學合成製備含有所有可能同系物的皂甙庫，並為如藥物篩選等提供新的具有生理活性的化合物庫。
本發明從易得的甙元和單糖出發經過一步隨機糖苷化反應或隨機醯化與隨機糖苷化兩步隨機化反應聯用，再經去除保護基反應製備出具有所有可能性的單糖、二糖、三糖、四糖和五糖的皂甙混合物庫，並使用氣相色譜一質譜聯用的分析方法對其構成進行表徵。
本發明方法製備的皂甙庫是一種含有一個糖基到五個糖基的單糖皂甙到五糖皂甙的同系混合物皂甙庫，該皂甙庫含有如下結構式所述皂甙 上述結構式中，n=0、l、2、3或4，m=3或4，且，n≤m，q=3或4。糖基部分 或L型單糖糖基，如葡萄糖基、甘露糖基、木糖基、巖藻糖基、鼠李糖基或阿拉伯糖基等， 是相同或不同的基團。
甙元基Y=甾體甙元基或包括齊墩果酸在內的三萜基，所述的甾體甙元基如薯蕷甙元基、劍麻甙元基、地高辛甙元基、提果甙元基或薯麻甙元基等。
本發明的方法中，採用單糖基皂甙為原料，在皂甙糖基部分的任意一位或多位羥基處隨機連接另外的糖基得到同系列的糖苷化產物。或者由皂甙和醯基給體首先發生隨機醯化，採用經隨機醯化後的產物作為糖苷化的原料，再進一步發生上述糖苷化反應。糖苷化反應產物經還原脫保護基後得到皂甙庫。這個皂甙庫共含有1-16種皂甙，每種皂甙的相對摩爾含量在0．5-50％之間。
可用兩種反應途徑完成，反應式簡述如下 其中 是單糖基， 是單糖基皂甙，R=甲醯基(Formyl)、乙醯基(Ac)、丁二醯單甲酯基(COCH2CH2COOCH3)、苯甲醯基(Bz)或三甲基乙醯基(Piv)等。
R1是含有1-7個碳原子的醯基或苄基，p=0、1、2、3或4，q=3或4，且p或q≤m，n+p≤m，m，n，Y如上所述。
本發明A方法為兩步隨機化反應聯用再經還原脫除保護基製備皂甙庫首先進行隨機醯化反應。所用的起始原料為由一個糖基與甙元脫水後通過碳氧共價鍵相連而成的分子式為 的單糖皂甙，單糖皂甙和醯基給體在至少含有一個氮原子的有機鹼催化下，在或不在極性溶劑中，發生醯化反應，使上述單糖皂甙的糖基上的羥基發生部分醯化反應。所用醯基給體是含有1-8個碳原子的酸酐或醯滷及其衍生物，如乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐、丁烯二酸酐、鄰苯二甲酸酐、乙醯氯、乙醯溴、正丁醯氯、三甲基乙醯氯、苯甲醯滷、對硝基苯甲醯氯。所用有機鹼可以是三乙胺(Et3N)、吡啶(Py)、二異丙基乙基胺(DIEA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)或聯二吡啶等。所用單糖皂甙、醯基給體和有機鹼的摩爾比是1∶0．5-5∶1-1000，推薦摩爾比為1∶1-2∶1-1000。醯化反應時間為0．5-25小時，反應溫度為-20℃至室溫。
然後進行隨機糖苷化反應用上述隨機醯化產物作為起始原料，醯化產物和糖基給體在極性溶劑中、促進劑及吸水劑作用下發生隨機糖苷化反應，使隨機醯化產物中的未被醯化的羥基與糖基給體發生糖苷化。其中醯化產物、糖基給體和促進劑的摩爾比為1∶0．5-8∶0-5，推薦摩爾比是1∶1-4∶0-5，所述促進劑是C1-C6的滷代醯胺、C1-C6的滷代烴基磺酸、C1-C6的滷代烴基磺酸酯、C1-C6的滷代烴基磺酸鹽、C1-C6的三甲基矽基滷代磺酸酯、三氟化硼-乙醚或它們的混合物，如N-碘代丁二醯亞胺(NIS)、N-碘代丁二醯亞胺(NIS)-三氟甲磺酸銀(AgOTf)混合物、N-碘代丁二醯亞胺(NIS)-三氟甲磺酸(TfOH)混合物、三甲基矽基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)、三氟甲磺酸銀(AgOTf)、三氟化硼-乙醚(BF3·Et2O)。所用吸水劑是分子篩、矽膠、硅藻土或離子交換樹脂，所用糖基給體是由 的異頭碳位置經過活化且其它羥基經全保護後的糖基，其分子式為 其中x是滷基、-SEt、-Sph或 R1是含有1-7個碳原子的醯基或苄基， 如前所述。
例如全苄基化的鼠李糖硫苷，分子式是 全乙醯化的鼠李糖硫苷，分子式是 全苯甲醯化的鼠李糖三氯亞胺酯，分子式是 全苯甲醯化的鼠李的糖溴苷，分子式是 全苯甲醯化的葡萄糖三氯亞胺酯，分子式是 全苄基化的阿拉伯糖溴或碘苷，分子式是 糖苷化的反應時間為0．5-25小時，反應溫度為-20℃至室溫。
隨機醯化或糖苷化反應所用極性溶劑是四氫呋喃(THF)、N，N二甲基甲醯胺(DMF)、吡啶、二氯甲烷或二氧六環等，推薦使用二氯甲烷和二氧六環。
糖苷化反應還可加入弱鹼淬滅反應，通常可加入NH3、(CH3)3N、(C2H5)3N等淬滅反應。
然後取隨機糖苷化反應產物，在極性溶劑和液氨中用一價金屬還原劑還原，通過脫除糖基受體上隨機醯化時所連的醯基以及隨機糖苷化所連的糖基給體上的保護基，將上述基團還原為羥基，獲得最終產物皂甙庫。該還原反應中隨機糖苷化產物與還原劑的摩爾比為1∶1-500，每克隨機糖苷化產物用1-1000ml的液氨，採用更多量的液氨對反應沒有影響。還原反應時間為0．1-2h，所述的一價金屬是鋰、鈉、鉀、銣或銫等。
本發明的方法B為一步隨機化反應後經還原脫除保護基製備皂甙庫所用起始原料是結構式為 的單糖皂甙，單糖皂甙和糖基給體在極性溶劑中、促進劑及吸水劑作用下發生隨機糖苷化反應，生成 隨後還原，上述兩步反應條件與方法A中的隨機糖苷化反應和去保護基的還原反應的相同。
由A或B方法所得皂甙混合物再經衍生化製成部分甲基化的阿爾迪醇乙酸酯後，進行氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)分析，從氣相色譜圖上可以算出每一組分的相對摩爾含量。將與每組色譜峰相對應的色譜圖和標準質譜圖相比較，便可知每一組分的化學組成，從而可推知相應皂甙的具體結構。
本發明首次提供了一種化學合成具有生理活性的皂甙庫的方法。隨機化反應拓展了皂甙化合物的合成和篩選過程，而且原料易得，方法簡便，條件易於控制，大大提高了合成此類化合物的效率，為發現和篩選新的皂甙化合物提供了一種高效、方便的方法，與從天然植物中提取方法相比，具有工業化前景。通過一步或兩步隨機化反應，不僅可以獲得各種類型的皂甙庫，而且也可以為如藥物篩選等製備新的具有生理活性的化合物庫。
通過下述實施例將有助於理解本發明，但不能限制本發明的內容實施例1隨機醯化反應的一般步驟取延齡草甙230mg(0．4mmol)於1-5mlPy或DMAP、Et3N以及10ml二氯甲烷溶液中，冰浴冷卻下緩慢滴加乙酸酐、乙醯氯或丁二酸酐0．2-2．0mmol。冰浴維持0．5h後撤去，於-20℃至室溫繼續攪拌反應0．5-24h。後處理如下減壓下將溶劑大部分除去。殘餘物用70ml CH2Cl2萃取，用飽和NaCl水洗三次並乾燥。將溶劑減壓蒸除後得白色固體。
實施例2隨機糖苷化的一般步驟取隨機醯化產物(或延齡草甙)0．16mmol，全苄基保護的鼠李糖硫苷或全苯甲醯化保護的鼠李糖三氯亞胺酯0．32mmol-0．64mmol溶於二氧六環3-5ml中，並轉移至經火烘乾的帶支管的試管中(含1-5埃分子篩160mg)。氬氣保護下於-20℃至室溫攪拌30min後，加入NIS或BF3·Et2O的量為0．35mmol-0．70mmol，並迅速加入AgOTf甲苯溶液(0．19M)0．33-0．67ml。於-20℃至室溫反應0．5-24h後加入Et3N 1ml淬滅反應。將反應液過濾，用CH2Cl2洗滌濾餅。濾液與洗滌液合併，CH2Cl2100ml稀釋，依次用飽和Na2S2O3，飽和NaCl水洗滌，MgSO4乾燥。減壓蒸除溶劑，殘餘物用粗矽膠拌樣上柱，用矽膠H柱層析純化。用石油醚(10∶1)梯度洗脫，收集CH2Cl2與CH2Cl2-CH3OH(20∶1)洗脫的洗脫液，將其減壓濃縮後得棕色固體或油狀物。
實施例3Li／NH3還原的一般步驟取隨機糖苷化反應產物180mg溶於3ml THF中備用。讓NH3冷凝在三口瓶中。乾燥後，再將其蒸餾至50ml反應瓶中0．2-180ml左右，加入Li或鉀絲300mg並攪拌。緩慢滴加隨機糖苷化產物的THF溶液進行還原反應。滴完後-70℃左右繼續反應0．1-2h，讓其自然升至室溫，至NH3基本揮發完後，冰浴下加入CH3OH淬滅反應，並調體系的PH值為酸性。減壓蒸除甲醇餘一油狀物，用約70ml正丁醇稀釋，用蒸餾水充分洗滌。待有機相與水相充分分層後，將正丁醇分出，在油泵減壓下於水浴室溫-35℃將其濃縮至小體積。加入大量無水乙醚後產生白色沉澱，過濾得Li／NH3還原產物。
實施例4
皂甙庫甲基化分析的一般步驟甲基化5mg皂甙庫樣品溶於2ml DMF中，再加入NaH 30mg。室溫攪拌1h後，加入MeI 2ml，繼續室溫攪拌反應過夜。後處理如下鼓入Ar氣約20min將過量的MeI除去。而後用CH3Cl 20ml稀釋反應液，依次用飽和Na2S2O3，蒸餾水洗滌，乾燥。將其濃縮，取少量樣品真空乾燥2h進行IR分析。如此甲基化直至無羥基峰。其餘樣品抽乾後備用。
水解將甲基化後的樣品用甲酸水溶液溶解並轉移至封管中100℃水解6h。6h後減壓，濃縮至幹，再用CF3COOH 3 ml溶解並水解。水解後濃縮至幹，用甲醇共沸蒸餾除去CF3COOH。
後處理水解後樣品用蒸餾水溶解，加氨水調為鹼性，再加NaBH425mg，室溫反應2-5h。加幾滴HOAc至無氣泡產生。減壓濃縮。再加甲醇5ml及HOAc減壓濃縮帶走硼酸衍生物。反覆6次。將還原產物用Ac2O 2ml溶解，100℃封管反應1h，減壓除過量的Ac2O直至出現白色固體，用CHCl3萃取。洗滌乾燥有機相，濃縮除去溶劑後用於GC-MS分析。
實施例5 通過兩步隨機化反應構建的甾體皂甙庫T1中共含有16種化合物，Rha∶Glc=1．8-2．2∶1，每種皂甙的含量為1．5-14．3％之間，總產率為32-55％。T1中單糖皂甙的含量為4．5-7．0％，二糖皂甙的含量為13．0-29．0％，三糖皂甙的含量為41．5-42．5％，四糖皂甙的含量為15．5-33．5％，五糖皂甙的含量為6．5-7．5％。
實施例6同實施例2和3(一步隨機反應)及實施例1、2和3(二步隨機反應)的反應條件，採用不同的單糖基甙元和糖基給體，獲得結果如表1和表2所示。
表1反應條件及皂甙庫的分布 表2依照表1條件製備的皂甙庫中各皂甙的相對摩爾百分含量 實施例7抗腫瘤生物活性體外篩選實驗結果評定無效l0-5mol／l＜85％弱效10-5mol／l≥85％或10-6mol／l≥50％強效10-6mol／l≥85％或10-7mol／l＞50％
表3篩選方法磺醯羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法細胞株A-549人肺腺癌 作用時間72h對腫瘤細胞生長的抑制率％
表4篩選方法四氮唑鹽(microculture tetrozolium，MTT)還原法細胞株P388小鼠白血病 作用時間48h對腫瘤細胞生長的抑制率％
權利要求
1．一種含有一個糖基到五個糖基的單糖皂甙到五糖皂甙的皂甙庫的製備方法，該皂甙庫含有如下結構式所述皂甙 結構式中，n=0、1、2、3或4，m=3或4，且，n≤m，q=3或4， 或L型單糖糖基， 是相同或不同的基團，甙元基Y=甾體甙元基或包括齊墩果酸在內的三萜基，該皂甙庫是由下述(2)和(3)或通過(1)、(2)和(3)的步驟製得(1)隨機醯化反應單糖皂甙和醯基給體，在或不在極性溶劑中，並用至少含有一個氮原子的有機鹼催化醯化，其中上述單糖皂甙、醯基給體和有機鹼的摩爾比依次是1∶0．5-5∶1-1000，所述的醯基給體是含有1-8個碳原子的酸酐或醯述單糖皂甙由一個糖基與甙元基通過碳氧共價鍵相連而成，具有 的滷，所結構式；(2)隨機糖苷化反應上述單糖皂甙或(1)的醯化產物和糖基給體在極性溶劑中、促進劑及吸水劑作用下發生隨機糖苷化反應，其中單糖皂甙或(1)的醯化產物、糖基給體和促進劑的摩爾比為1∶0．5-8∶0．2-5，其中所述促進劑是C1-C6的滷代醯胺、C1-C6的滷代烴基磺酸、C1-C6的滷代烴基磺酸酯、C1-C6的滷代烴基磺酸鹽、C1-C6的三氟甲基矽基滷代磺酸酯、三氟化硼-乙醚或它們的混合物，所述吸水劑是分子篩、矽膠、硅藻土或離子交換樹脂，所述糖基給體是異頭碳位置經過活化的其餘羥基全保護的糖基；(3)去除保護基在極性溶劑和液氨的存在下將上述(2)的產物用一價金屬還原，隨機糖苷化產物與還原劑的摩爾比為1∶1-500，反應時間為0．1-2h；上述隨機醯化(1)或糖苷化(2)的反應時間為0．5-25小時，反應溫度為-20℃至室溫。
2．一種如權利要求1所述的皂甙庫的製備方法，其特徵是所述的D或L型單糖糖基是葡萄糖基、甘露糖基、木糖基、巖藻糖基、鼠李糖基或阿拉伯糖基。
3．一種如權利要求1所述的皂甙庫的製備方法，其特徵是所述的甾體甙元基是薯蕷甙元基、劍麻甙元基、地高辛甙元基、提果甙元基或薯麻甙元基。
4．一種如權利要求1所述的皂甙庫的製備方法，其特徵是隨機醯化或糖苷化反應所用極性溶劑是四氫呋喃、N，N二甲基甲醯胺、吡啶、二氯甲烷或二氧六環。
5．一種如權利要求1所述的皂甙庫的製備方法，其特徵是隨機醯化所用的至少含有一個氮原子的有機鹼是三乙胺、吡啶、二異丙基乙基胺、4-二甲氨基吡啶或聯二吡啶。
6．一種如權利要求1所述的皂甙庫的製備方法，其特徵是所述含有1-8個碳原子的酸酐或醯滷的醯基給體是乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐、丁烯二酸酐、鄰苯二甲酸酐、乙醯氯、乙醯溴、正丁醯氯、三甲基乙醯氯、苯甲醯滷、對硝基苯甲醯氯。
7．一種如權利要求1所述的皂甙庫的製備方法，其特徵是隨機醯化反應中所述單糖皂甙和醯基給體的摩爾比是1∶1-2。
8．一種如權利要求1所述的皂甙庫的製備方法，其特徵是所述糖基給體是由 的異頭碳位置經過活化且其餘羥基經全保護後的糖基，其分子式為 其中X是滷基、-SEt、-Sph或 R1是含有1-7個碳原子的醯基或苄基， 如權利要求1所述。
9．一種如權利要求1所述的皂甙庫的製備方法，其特徵是隨機糖苷化所用促進劑是N-碘代丁二醯亞胺、N-碘代丁二醯亞胺-三氟甲磺酸銀混合物、N-碘代丁二醯亞胺-三氟甲磺酸混合物、三甲基矽基三氟甲磺酸酯、三氟化硼-乙醚、三氟甲磺酸銀或其混合物。
10．一種如權利要求1所述的皂甙庫的製備方法，其特徵是隨機糖苷化反應中起始原料單糖皂甙或隨機醯化產物與糖基給體的摩爾比為1∶1-4。
全文摘要
本發明涉及一種利用一步或兩步隨機化反應並經還原反應製備皂甙庫的方法。從易得的甙元和單糖出發經過一步隨機糖苷化反應或隨機醯化與隨機糖苷化兩步隨機化反應聯用,再經去除保護基製備出具有所有可能性的單糖、二糖、三糖、四糖和五糖的皂甙混合物庫。
文檔編號C07H15/00GK1293200SQ0012573
公開日2001年5月2日 申請日期2000年10月20日 優先權日2000年10月20日
發明者俞飈, 惠永正, 邢國文, 李兵 申請人:中國科學院上海有機化學研究所