溶血鞘脂的生產方法
2023-05-18 04:45:01
專利名稱：溶血鞘脂的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種溶血鞘脂(lysosphingolipids)的生產方法。更具體說，本發明涉及生產溶血鞘脂的在工業上有用的方法，所說的溶血鞘脂適合用於化妝品、藥物、鞘脂化(sphingo)技術、細胞技術等等，本發明還涉及通過所說生產方法獲得的溶血鞘脂。
近來，據證實鞘脂廣泛分布在生物體內(包括低等動物和高等動物)並且起重要的生物活性作用，例如生長、誘導分化和細胞中的編程性細胞死亡。此外，作為細胞膜組成之一的鞘脂已被用作化妝品或藥物的添加劑。
缺少通過醯胺鍵與神經鞘脂類中類鞘脂的氨基相連接的脂肪酸的鞘脂的N-脫醯基化形式(溶血形式)稱為溶血鞘脂。據證實溶血鞘脂與鞘脂相比具有相似的和不同的生物活性。
由於溶血鞘脂在鞘氨醇中含有游離的氨基，因而其可通過再醯化作用用作合成溶血鞘脂衍生物(鞘脂衍生物或鞘脂類似物)的起始原料。例如，可以合成含有同種脂肪酸組成的鞘脂、具有不同的脂肪酸鏈長度的鞘脂、或含有官能性脂肪酸(如二十二碳六烯酸)的新鞘脂。或者，可以獲得用發色團、放射性同位素等標記的鞘脂。此外，可以通過利用溶血鞘脂中的游離氨基來實現固定化到載體上。
溶血鞘脂的常規生產方法包括化學方法、使用酶的方法和使用微生物的方法。
在醇溶劑中的肼解方法和鹼性水解方法是已知的由鞘糖脂獲得溶血鞘脂的化學方法。然而，當使用例如含有唾液酸的糖鞘脂(神經節苷脂)時，在此方法中唾液酸部分的脫醯基反應同時進行。此外，當使用含有氨基糖的鞘糖脂時N-乙醯基被除去，導致形成脫-N-乙醯基的溶血糖脂。使脫醯化的溶血糖鞘脂具有與天然存在的物質相同的糖鏈需要非常複雜的工藝。在一個示例性的方法中，將保護基團選擇性地引入脂類部分的氨基上，將唾液酸部分再醯化，然後脫去保護基團。在另一個示例性的方法中，在摻入脂質體後將糖部分選擇性再醯化。此外，在這些方法中產生了很多副產物。如上所述，通過化學方法生產溶血鞘脂需要大量的勞動和專業技術。
溶血形式的鞘磷脂之一(鞘磷脂)的化學生產通常使用在醇溶劑中使用鹽酸水解的方法。然而，使用這種方法會產生各種副產物。例如，除天然存在的D-赤型(2S,3R)外還形成L-蘇型(2S,3S)類鞘脂的立體異構體。結果，感興趣的天然存在的D-赤型的產量較低，並且從反應混合物中純化D-赤型是非常困難的。
另一方面，使用由鞘脂生產溶血形式的酶的方法是迄今為止已知的方法。已知有以下方法使用通過諾卡氏菌屬的放線菌產生的神經節苷脂神經醯胺酶(ceramidase)的方法(生物化學雜誌1031-4(1988)；JP-A 64-60379)；使用通過紅球菌屬放線菌產生的酶或細胞加工產物的方法(JP-A 6-78782)；使用通過假單胞菌屬細菌產生的鞘脂神經醯胺N-脫醯基酶的方法(生物化學雜誌27024370-24374(1995)；JP-A8-84587)；使用通過非發酵型革蘭氏陰性芽孢桿菌AI-2產生的鞘脂神經醯胺N-脫醯酶的方法(JP-A 10-257884)；以及使用通過假單胞菌屬細菌產生的神經醯胺酶的方法(JP-A 10-14563)。
然而，在這些使用酶的方法中溶血形式的反應產率並不令人滿意。例如，當使用鞘脂神經醯胺N-脫醯酶時，儘管產率根據所用的底物而變化，但由神經節苷脂GM2(其最是容易被水解的底物)的產率最多約為70％，而由神經節苷脂GM1的產率最多約為60％。
使用以下微生物或其提取物生產溶血鞘脂的方法是已知的能夠產生糖鞘脂神經醯胺脫醯酶的鏈黴菌屬放線菌[生物科學、生物技術和生物化學592028-2032(1995)；JP-A 7-107988]；以及產生神經鞘脂神經醯胺N-脫醯酶的假單胞菌屬或希瓦氏菌屬的細菌[JP-A-10-41792]。
然而，除在向培養基添加底物的過程中含有感興趣的溶血形式外，反應中還含有諸如染料、糖脂等得自培養基或細胞的大量雜質。因此，為獲得高純度的溶血形式，此方法中需要複雜的純化過程。此外，出於上述原因，在此方法中處理少量的鞘脂以純化溶血形式是非常困難的。
在所有的通過使用酶、微生物或其提取物生產溶血鞘脂的常規方法中，反應僅在含水體系中進行。已知沒有使用兩相體系的方法，所說的兩相由水相和有機溶劑相組成，其中有機相形成與水相不可混和的分離相。
發明目的如上所述，通過化學法、酶法或通過使用微生物生產溶血鞘脂的常規方法效率較差、會產生不期望的副產物、導致較低的反應產率、並且需要大量的勞動和專業技術來進行純化。
因而，本發明的一個目的是提供一種有效生產溶血鞘脂的方法，該方法不產生副產物。
本發明的另一個目的是提供通過上述方法獲得的溶血鞘脂。
通過以下的描述並且參考附圖，本發明的這些和其它的目的和優點將變得顯而易見。
圖2描繪了在有機溶劑的存在下或無有機溶劑的存在下影響溶血形式產率的底物特異性。
圖3描繪了在表面活性劑和有機溶劑的存在下或無表面活性劑和有機溶劑的存在下產生溶血形式的時間過程。
圖4描繪了在有機溶劑的存在下使用不同量的酶時溶血形式的產率。
圖5描繪了所添加的有機溶劑的量和溶血形式的產率之間的關係。
籍此，本發明提供以下方面1、一種通過使用特異性水解鞘脂中類鞘脂和脂肪酸之間醯胺鍵的酶來生產溶血鞘脂的方法，其中酶反應在兩相體系反應混合物中進行，所說的混合物中含有至少一種與水不可混和的有機溶劑；2、據上述(1)的生產溶血鞘脂的方法，其中酶反應在至少一種表面活性劑的存在下進行；3、據上述(1)或(2)的生產溶血鞘脂的方法，其中有機溶劑選自烴、醇、酯和醚。
4、據上述(3)的生產溶血鞘脂的方法，其中烴是六碳或更多碳的烴。
5、據上述(3)的生產溶血鞘脂的方法，其中醇是八碳或更多碳的醇。
6、據上述(3)的生產溶血鞘脂的方法，其中酯由六碳或更多碳的羧酸和二碳或更多碳的醇組成。
7、據上述(3)的生產溶血鞘脂的方法，其中醚選自苯基醚、乙二醇二乙醚、二異丙基醚和乙烯基乙醚；8、據上述(2)的生產溶血鞘脂的方法，其中表面活性劑選自具有甾族化合物主鏈的表面活性劑、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基醚和聚氧乙烯烷基醚；且9、通過上述(1)-(8)任一方法獲得的溶血鞘脂。
這裡所用的「TM」是指商標。發明詳細描述本發明中用作底物的鞘脂包括天然存在的或合成的具有長鏈骨架、類鞘脂的物質，包括單獨的或混和形式的鞘糖脂、鞘磷脂和神經醯胺。
在本文中，溶血鞘脂是指鞘脂的N-脫醯形式，不含有通過醯胺鍵與類鞘脂的氨基相連接的脂肪酸。
關於本發明中使用的特異性水解鞘脂中類鞘脂和脂肪酸之間醯胺鍵的酶沒有限制。酶可以是已知的可從鞘脂中釋放脂肪酸的酶，並且包括，例如通過諾卡氏菌屬放線菌產生的神經節苷脂神經醯胺酶[生物化學雜誌1031-4(1988)；JP-A 64-60379]；通過紅球菌屬放線菌產生的酶(JP-A 6-78782)；通過鏈黴菌屬放線菌產生的糖鞘脂神經醯胺脫醯酶[生物科學、生物技術和生物化學592028-2032(1995)；JP-A 7-107988]；通過假單胞菌屬細菌產生的鞘脂神經醯胺N-脫醯酶[生物化學雜誌27024370-24374(1995)；JP-A 8-84587]；通過希瓦氏菌屬細菌產生的鞘脂神經醯胺N-脫醯酶[JP-A10-45792]；通過假單胞菌屬細菌產生的神經醯胺酶[JP-A 10-14563]；得自哺乳動物組織的神經醯胺酶[生物化學雜誌2413731-3737(1966)；生物化學81692-1698；Biochimica et BiophysicaActa 176339-347(1969)；科學1781100-1102(1972)]；無脊椎動物神經醯胺酶[WO98/03529]。
其中，通過假單胞菌屬細菌產生的鞘脂神經醯胺N-脫醯酶和通過希瓦氏菌屬細菌產生的鞘脂神經醯胺N-脫醯酶具有廣泛的底物特異性，並且特別優選於生產各種溶血鞘脂。
產生鞘脂神經醯胺N-脫醯酶的假單胞菌屬的細菌菌株假單胞菌sp.TK-4被命名為G-182，並且已於1994年6月24日(原始保藏日)遵照布達佩斯條約進行了保藏，其入冊登記號為FERM BP-5096。產生鞘脂神經醯胺N-脫醯酶的希瓦氏菌屬的細菌菌株海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)NS-589已於1996年6月26日保藏，入冊登記號為FERM P-15700。這兩個菌株已被保藏在通商產業省工業技術院生命工學和人體技術研究所，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號。
這些酶可以酶溶液的形式使用或者被固定化至不溶於水的載體上。
將水或水溶液用於本發明的水相。特別是，同針對各種反應的酶和底物等之中添加緩衝液是優選的。
分離相是與水不可混和的有機溶劑相。有機溶劑選自烴、醇、酯、醚和酮，以致在有機溶劑相和水相之間，脂肪酸(神經鞘脂類的降解產物)在有機溶劑相中的分配比高於水相，並且作為底物的神經鞘脂類在有機相中的分配比低於水相。
有機溶劑包括(但不限制於此)例如烴，包括脂族烴，如己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、壬烷、癸烷、十二烷、十五烷、十七烷、十八烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,2,3-三甲基庚烷、2,2,4-三甲基庚烷、己烯、辛烯、癸烯、十二碳烯、十五碳烯和十七碳烯；脂族環烴，如環己烷、甲基環己烷、環癸烷、環己烯和環癸烯；含滷烴，如二氯乙烷、四氯乙烷、三氯乙烯、四氯化碳、辛基氯化物、二苯乙酮基氯化物、氯苯和二氯苯；以及芳族烴，如苯、甲苯、二甲苯、均三苯、乙苯、丁基苯、異丙基苯和對異丙基甲苯。
醇類包括辛醇、癸醇、十二烷醇、辛烯醇、癸烯醇和環癸醇。
酯類包括己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二碳酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、硬脂酸丁酯、檸檬酸丁酯和檸檬酸乙酯。
醚類包括苯基醚、乙烯基乙醚、乙二醇二乙醚、二異丙基醚和辛基醚。
酮類包括辛酮、癸酮和十二烷酮。
在上述列出的有機溶劑中，具體說來在本發明的方法中可以優選使用六碳或更多碳的烴(包括脂族、環狀、芳族和含滷烴)、八碳或更多碳的醇、由六碳或更多碳的羧酸和二碳或更多碳的醇組成的酯、以及選自苯醚、乙二醇二乙醚、二異丙醚和乙烯基乙醚的醚。
此外，本發明中使用的有機溶劑的數量並不限制於一種。可以混合和使用兩種或多種有機溶劑。
本發明中的兩相體系包括其中水相和有機溶劑相所處狀態為水相分散在有機溶劑相中或者所處狀態為有機溶劑相分散在水相中(例如通過攪拌)、或者所處狀態為水相和有機溶劑相分離成彼此接觸的兩個相(例如通過沉降而不分散)的體系。
或者，有機溶劑相和/或水相可以在繼續酶反應的同時偶而交換，從而使溶血鞘脂的連續生產成為可能。有機溶劑的添加量可以不受限制，優選50％或更多，通常為水相體積的5-10倍。
水相中可以添加各種鹽和表面活性劑。例如，可以添加選自以下物質中的至少一種具有甾族化合物主鏈的表面活性劑，如牛磺脫氧膽酸鈉和膽酸鈉；聚氧乙烯烷基苯基醚，如Triton型表面活性劑和Nonidet P-40TM；聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基醚，如吐溫型表面活性劑；以及非離子表面活性劑，如聚氧乙烯烷基醚。優選地，表面活性劑的量不受限制，以反應體系總體積計通常為0.1-2wt％。
關於反應條件沒有限制。在所用的各個酶的最佳條件下(包括pH和溫度)可以更有效地生產溶血鞘脂。
例如，當在反應中使用由假單胞菌屬細菌產生的鞘脂神經醯胺N-脫醯酶時，優選通過添加具有甾族化合物主鏈的表面活性劑(如牛磺脫氧膽酸鈉或膽酸鈉)在pH 6-10下進行反應。此外，通過聯合使用聚氧乙烯烷基苯基醚(如Triton X-100TM或Nonidet P-40TM)可更有效地水解神經鞘脂類。
關於反應時間沒有限制。反應可以進行使用酶從所用底物中獲得所需量的溶血鞘脂所需要的時間，所說的底物如天然存在或合成的鞘脂，包括糖鞘脂、神經鞘磷脂和神經醯胺。
本發明生產的溶血鞘脂可以根據常規的方法來純化。
可以通過沉降後分離成兩相或者通過使用選擇膜或柱來從反應混合物中除去有機溶劑。或者，可以通過減壓濃縮或通過蒸餾來除去溶劑。
如此獲得的在水相中含有溶血形式的反應混合物中含有少量汙染物。因此，通過使用常規提取方法(如反相層析法、藉助矽膠的正相層析法或離子交換層析法)可以容易地純化溶血鞘脂。
此外，通過將有機溶劑蒸發可以獲得得自鞘脂的脂肪酸，其中所說的有機溶劑來自從上述去除步驟中分離出的有機相。
通過薄層層析法、液相層析法、質譜法、核磁共振波譜法等的分析，可以證實純化的溶血鞘脂的結構。
如上所述，根據本發明的方法可以將鞘脂轉化成感興趣的溶血鞘脂。
另外，通過處理本發明獲得的溶血鞘脂，可以生產溶血鞘脂的衍生物。例如，可以如下生產溶血鞘脂的衍生物。
可以根據氨基醯胺化的化學或酶的常規方法來進行再醯化作用。
在化學再醯化中，反應可以通過使用標記或未標記的脂族羧酸或其反應性衍生物來進行。本發明中可以使用的脂族羧酸的實例包括飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、以及所有的具有脂族化合物特性的羧酸，例如其中脂肪酸烴鏈被滷素或諸如取代或未取代的氨基、氧基或羥基的官能團所取代的酸、或者烴鏈中具有氫、硫或氨基的酸。
酶促再醯化可以通過使用已知的脂肪酶來實現。在一個特別有用的方法中，通過利用特異性水解鞘脂中類鞘脂和脂肪酸之間醯胺鍵的酶(例如上述的鞘脂神經醯胺N-脫醯酶(WO98/03529))的逆反應，可以容易地進行再醯化反應。
所得溶血鞘脂中神經醯胺的氨基的標記可以通過將形成發色團的物質、螢光物質、生物素、放射性同位素等引入需要標記的部分中來完成。
以下實施例將對本發明作更詳細的舉例說明，但不要理解為限制本發明的範圍。
使用薄層層析使所得反應混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測檢驗TLC平板。然後，使用圖像光密度計(Bio-Rad)定量測定GM1溶血形式的產率。結果示於表1。
在下表1列出的有機溶劑中，環癸烷來自Aldrich且其它全部來自nacalai tesque。
表1溶劑 溶血形式的產率(％)對照 68
1-丁醇 441-戊醇 511-己醇 531-庚醇 621-辛醇 702-辛醇 901-癸醇 831-十二烷醇 100己烷 76辛烷 89癸烷 95十五烷 97十七烷 97十八烷 971-己烯 801-辛烯 911-癸烯 941-十二碳烯 93環己烷 87甲基環己烷 93環癸烷 89苯 70甲苯 84二甲苯 95均三苯 97正乙苯 97正丁基苯 99對異丙基甲苯 98異丙基苯 96正辛基氯化物 99正二苯乙酮基氯化物 100氯仿 62
四氯化碳73乙酸乙酯58乙酸丁酯68乙酸己酯60乙酸苯酯55乙酸苄酯67己酸甲酯47辛酸甲酯61癸酸甲酯62十二碳酸甲酯68丙酸乙酯58丁酸乙酯54己酸乙酯73辛酸乙酯73癸酸乙酯75十二碳酸乙酯74肉豆蔻酸異丙酯 91硬脂酸正丁酯84苯醚97乙醚41丙醚54丁醚64乙烯基乙醚 73乙烯基丁醚 61乙二醇二乙醚71二異丙基醚 91
使用薄層層析使所得反應混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測檢驗TLC平板。然後，如實施例1所述使用圖像光密度計(Bio-Rad)定量測定GM1溶血形式的產率。結果示於表2。
表面活性劑的最終濃度以反應體系的體積計為0.8wt％。在下表2列出的表面活性劑中，Triton X-100TM來自Pierce且其它全部來自nacalai tesque。
表2表面活性劑溶血形式的產率(％)沒有添加 25牛磺脫氧膽酸鈉99膽酸鈉92Triton X-100TM64吐溫20TM 42Nonidet P-40TM60Brij-58TM 66Lubrol PXTM 72
使用薄層層析使所得反應混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測檢驗TLC平板。然後，如實施例1所述使用圖像光密度計(Bio-Rad)定量測定GM1溶血形式的產率。結果示於表3．表3中表面活性劑的濃度是最終濃度，以反應體系體積計的wt％來表達。
表3濃度 溶血形式的產率(％)0250.05 550.01 650.2 800.4 880.8 921.0 92
使用薄層層析使所得反應混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測檢驗TLC平板。然後，如實施例1所述使用圖像光密度計(Bio-Rad)定量測定GM1的降解率，即溶血形式的產率。結果如
圖1所示。
圖1描繪了在有機溶劑的存在下針對溶血形式產率的最佳pH。在圖中，縱軸和橫軸分別表示降解率(％)和pH。空心圓圈和空心圓圈、空心三角和空心三角分別代表通過使用乙酸緩衝液、磷酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液和甘氨酸-NaOH緩衝液獲得的結果。
在所得的反應混合物中，通過使用薄層層析展開並且使用茚三酮試劑目測檢驗所產生的鞘氨醇來定量測定得自神經醯胺的溶解形式的產率。通過使用考馬斯亮藍目測檢驗所產生的溶血鞘磷脂來定量測定鞘磷脂的產率。使用薄層層析使含有其它底物的反應混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測檢驗TLC平板。然後，如實施例1所述使用圖像光密度計(Bio-Rad)定量測定得自各個底物的溶血形式的產率。結果如圖2所示。
圖2描繪了在有機溶劑存在或缺少的情況下影響溶血形式產率的底物特異性。在圖中，縱軸和橫軸分別表示產率(％)和各種底物。塗黑條表示在正十七烷存在下的降解率，而透明條表示沒有正十七烷存在下的降解率。
圖3描繪了在有表面活性劑和有機溶劑或沒有表面活性劑和有機溶劑存在下GM1降解率的時間過程。圖中，縱軸和橫軸分別表示降解率(％)和時間(hr)。符號表示在以下物質的存在下獲得的結果牛磺脫氧膽酸鈉和正癸烷(空心圓圈)、牛磺脫氧膽酸鈉(空心圓圈)、Triton X-100TM和正癸烷(空心方塊)、或Triton X-100TM(空心三角)。
反應條件(A)將100μl等分的正癸烷(nacalai tesque)添加到10μl 50mM的乙酸緩衝液中(pH6.0)，所說的緩衝液含有2mU得自假單胞菌屬細菌的SCD酶[生物化學雜誌27024370-24374(1995)；JP-A8-84587]、0.8％牛磺脫氧膽酸鈉(nacalai tesque)和10nmolGM1 (Matreya)，並且培養。
反應條件(B)10μl等分的50mM乙酸緩衝液(pH6.0)，所說的緩衝液含有2mU得自假單胞菌屬細菌的SCD酶、0.8％牛磺脫氧膽酸鈉和100nmol GM1，並且培養。
反應條件(C)將100μl等分的正癸烷添加到10μl 50mM的乙酸緩衝液中(pH6.0)，所說的緩衝液含有2mU得自假單胞菌屬細菌的SCD酶、0.8％Triton X-100TM(Pierce)和10nmol GM1，並且培養。
反應條件(D)10μl等分的50mM乙酸緩衝液(pH6.0)，所說的緩衝液含有2mU得自假單胞菌屬細菌的SCD酶、0.8％Triton X-100TM和10nmol GM1，並且培養。
使用薄層層析使所得反應混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測檢驗TLC平板。然後，如實施例1所述使用圖像光密度計(Bio-Rad)定量測定GM1的降解率，即溶血形式的產率。結果如圖4所示。
圖4描繪了在牛磺脫氧膽酸鈉、不同濃度Triton X-100TM和有機溶劑的存在下使用不同量的酶的GM1降解率。圖中，縱軸和橫軸分別表示降解率(％)和Triton X-100TM的濃度(％)。
將不同數量的正癸烷(nacalai tesque)或正十七烷(nacalaitesque)添加到10μl 50mM乙酸緩衝液中(pH6.0)，所說的緩衝液含有2mU得自假單胞菌屬細菌的SCD酶[生物化學雜誌27024370-24374(1995)；JP-A 8-84587]、0.8％牛磺脫氧膽酸鈉(nacalaitesque)、0.1％Triton X-100TM(Pierce)和10nmol GM1(Matreya)。將混合物在37℃下培養16小時。
使用薄層層析使所得反應混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測檢驗TLC平板。然後，如實施例1所述使用圖像光密度計(Bio-Rad)定量測定GM1的降解率，即溶血形式的產率。結果如圖5所示。
圖5描繪了有機溶劑的量與溶血形式的產率之間的關係。圖中，縱軸和橫軸分別表示降解率(％)和有機溶劑的量(μl)。透明條表示正癸烷的結果，而塗黑條表示正十七烷的結果。
使用薄層層析使所得反應混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測檢驗TLC平板。然後，如實施例1所述使用圖像光密度計(Bio-Rad)定量測定GM1的溶血形式的產率。結果如表4所示。
表面活性劑的最終濃度以反應體系的體積計為0.1wt％。在下表4所列出的表面活性劑中，Triton X-100TM來自Pierce並且所有其它的物質均來自nacalai tesque。
表4濃度溶血形式的產率(％)Triton X-100TM39吐溫20TM51吐溫80TM69
Nonidet P-40TM64Brij-58TM65Lubrol PXTM67
使用薄層層析使所得反應混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測檢驗TLC平板。然後，如實施例1所述使用圖像光密度計(Bio-Rad)定量測定GM1的溶血形式的產率。結果如表5所示。
混合物中表面活性劑的最終濃度以反應體系的體積計為0.1wt％。在下表5所列出的表面活性劑中，Triton X-100TM來自Pierce並且所有其它的物質均來自nacalai tesque。
表5混合物中的表面活性劑 溶血形式的產率(％)對照 53Triton X-100TM70Nonidet P-40TM68吐溫20TM48吐溫80TM50Brij-58TM53Lubrol PXTM57
將10mg神經節苷脂GM3(Matreya)溶解於10ml 50mM乙酸緩衝液中(pH6.0)，所說的緩衝液含有0.8％牛磺脫氧膽酸鈉。將混合物放入200ml梨形燒瓶中，然後向其中加入2U的SCD酶。其上覆蓋100ml等分的正癸烷，並且將混合物在37℃下放置16小時。向水相加入1U的SCD酶，並且將混合物再在37℃下培養16小時。此時，神經節苷脂GM3的降解率為95％。
在反應完成之後，回收水相，將其分成兩等份並且使用反相層析進行純化。將水相加到POROS R2H柱中(Φ4.6×100mm，PerSeptive)，然後用乙腈∶水=10∶90到乙腈∶甲醇=10∶90進行梯度洗脫。收集含有溶血神經節苷脂GM3的洗脫級分並且濃縮至幹。結果，通過薄層層析、使用苔黑酚-硫酸與重鉻酸(bichromic acid)-硫酸混合物目測檢驗證實獲得了5.6mg純度為95％或者更高的溶血形式。
如上所述，通過本發明的生產方法可以有效地、方便和高純度地大量工業化製備溶血鞘脂。
權利要求
1.一種通過使用特異性水解鞘脂中類鞘脂和脂肪酸之間醯胺鍵的酶來生產溶血鞘脂的方法，其中酶反應在兩相體系反應混合物中進行，所說的混合物中含有至少一種與水不可混和的有機溶劑。
2.據權利要求1的生產溶血鞘脂的方法，其中所述的酶反應在至少一種表面活性劑的存在下進行。
3.據權利要求1或2的生產溶血鞘脂的方法，其中所述有機溶劑選自烴、醇、酯和醚。
4.據權利要求3的生產溶鞘脂類的方法，其中所述的烴是六碳或更多碳的烴。
5.據權利要求3的生產溶鞘脂類的方法，其中所述的醇是八碳或更多碳的醇。
6.據權利要求3的生產溶鞘脂類的方法，其中所述的酯由六碳或更多碳的羧酸和二碳或更多碳的醇組成。
7.據權利要求3的生產溶血鞘脂的方法，其中所述的醚選自苯基醚、乙二醇二乙醚、二異丙基醚和乙烯基乙醚。
8.據權利要求2的生產溶血鞘脂的方法，其中所述的表面活性劑選自具有甾族化合物主鏈的表面活性劑、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基醚和聚氧乙烯烷基醚。
9.通過權利要求1-8任一方法獲得的溶血鞘脂。
全文摘要
一種通過使用能夠特異性水解鞘脂中類鞘脂和脂肪酸之間酸性醯胺鍵的酶來生產溶鞘脂類的方法,其特徵在於酶反應在兩相體系的液體反應混合物中進行,所說的混合物中含有至少一種形成水相和分離相的有機溶劑,如果需要可以有表面活性劑存在。
文檔編號C12P13/00GK1296528SQ99804807
公開日2001年5月23日 申請日期1999年3月30日 優先權日1998年3月31日
發明者慄田豐久, 伊豆博幸, 佐野睦, 加藤鬱之進 申請人:寶酒造株式會社