高純度磷脂的製造方法以及以該方法得到的高純度鞘磷脂和縮醛磷脂型甘油磷脂的製作方法

2023-05-18 04:51:36

專利名稱：高純度磷脂的製造方法以及以該方法得到的高純度鞘磷脂和縮醛磷脂型甘油磷脂的製作方法
技術領域：
本發明涉及以簡單的操作從生物材料中，優選從家禽類中，收率良好地製造作為 功能性食品原料、醫藥品原料、化妝品原料等有用的高純度鞘磷脂，特別是人型的鞘磷脂和 高純度縮醛磷脂型甘油磷脂的方法，以及以該方法得到的高純度鞘磷脂和高純度縮醛磷脂 型甘油磷脂。
背景技術：
脂質是指在分子中具有長鏈脂肪酸或類似的烴鏈、存在於生物體內或生物由來的 物質。這種脂質能夠分類為簡單脂質和複合脂質。簡單脂質由C、H和0構成，一般可溶於 丙酮，簡單脂質的三醯甘油在動物體中作為能量的儲存體存在於脂肪組織中。另一方面，復 合脂質為含有磷酸的P或鹼的N等的脂質群。因此，複合脂質包括疏水性部分(脂肪酸部 分)和親水性部分(磷酸或鹼的部分)，顯示兩親性，一般而言，相對於上述簡單脂質可溶於 丙酮，複合脂質不溶於丙酮。這樣的複合脂質是生物膜的構成成分。上述複合脂質能夠大致分為(1)甘油磷脂[包括磷脂醯膽鹼(別名卵磷脂)、磷脂 醯乙胺醇等]；(2)鞘磷脂(sphingophospholipids)(包括鞘磷脂(sphingomyelin)、神經 醯胺氨乙基膦酸等)；C3)鞘糖脂(包括腦苷脂、硫苷脂、神經節苷脂等)以及(4)甘油糖脂 (有存在於微生物或高等植物中的與二醯甘油結合各種糖類的物質等)。另外，上述(2)鞘 氨醇磷脂和( 鞘糖脂總稱為鞘脂。上述甘油磷脂是骨架上具有甘油磷酸的磷脂的總稱，有磷脂醯膽鹼(卵磷脂)、磷 脂醯乙胺醇、雙磷脂醯甘油等。該甘油磷脂中，大多為非極性部分為脂肪酸的酯的甘油磷 脂，也有乙烯基醚鍵的縮醛磷脂型的甘油磷脂。該甘油磷脂作為生物膜的構成成分是重要的，其中縮醛磷脂型的甘油磷脂由於乙 烯基醚鍵的自由基敏感度較高，因此作為具有抗氧化性的磷脂，近年頗受關注。最近，有報 道指出縮醛磷脂型的甘油磷脂通過不同於作為細胞膜的抗氧化性成分的α-生育酚(維生 素Ε)的機制，有助於含有膽固醇的磷脂膜的氧化穩定性(例如，參考非專利文獻1)，另外， 指出縮醛磷脂型的甘油磷脂不僅參與細胞膜或脂蛋白的抗氧化性，而且對細胞的信號轉導 系統有重要的作用(例如，參考非專利文獻2)。這樣的縮醛磷脂型的甘油磷脂防止痴呆症中的腦的神經細胞死亡的作用備受期 待，但是實際情況是仍沒有發現能夠安全且大量地獲得的供給源。另一方面，鞘磷脂是具有鞘氨醇等的長鏈鹼的脂質的總稱，如上所述主要包括鞘 糖脂和鞘磷脂。鞘糖脂除含有糖和長鏈脂肪酸之外，還含有長鏈鹼的鞘氨醇或植物鞘氨醇 及其它。最簡單的鞘糖脂為腦苷脂，還有在其上帶有硫酸基的硫腦苷脂、帶有數分子中性糖 的神經醯胺低聚己糖苷(七，彡κ才'JK )、帶有唾液酸的神經節苷脂等。可以 認為這些物質存在於細胞表層，參與認知機制。鞘磷脂分為神經醯胺1-磷酸的衍生物和神經醯胺1-膦酸的衍生物，前者中已知有鞘磷脂，後者中已知有神經醯胺氨基乙基膦酸(七，彡F ν -J T > ( -fe 7 F T 7
工子卟水7水 > 酸))。近年來，發現這些鞘脂的分解代謝物的神經醯胺、鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸等參與 細胞內的信號傳導，備受關注。另外，發現鞘脂與膽固醇等一同參與被稱為「筏(raft) 」的 膜微結構域的形成，該微結構域作為信號轉導的場所發揮重要作用，因而其受關注程度更 加提高。這樣的鞘脂過去從牛腦中提取、利用，但從安全性的問題，目前利用穀物或真菌由 來的鞘脂。但是，構成這些穀物或真菌由來的鞘脂的鞘氨醇鹼組成和哺乳動物由來的組成 不同，因此存在生物利用度低於人型的鞘脂的問題。但是，為了從食品、動物組織等的總脂質中製造出相對大量的鞘磷脂，以使用矽酸 等的柱色譜法進行梯度洗脫而製造，或用溶劑分餾法梯度分餾製造。每一種都需要複雜的 步驟。在溶劑分餾法中比較常見是向總脂質中添加丙酮使複合脂質(磷脂)沉澱(不溶部 分)，將以酯洗淨不溶部分而除去甘油磷酯的物質作為粗鞘脂餾分的方法。該餾分中不僅含 有鞘磷脂還含有腦苷脂等的鞘糖脂。另一方面，已知雞皮的磷脂中大量含有人型鞘磷脂和縮醛磷脂型甘油磷脂。非專利文獻1 "J. Lipid Res. 」，第 44 卷，第 164 171 頁(2003 年)非專利文獻2「J. Mol. Neurosci. 」，第 16 卷，263 272 頁；discussion 279 284 頁(2001年)

發明內容
發明所要解決的問題基於這樣的事實，本發明的目的在於提供一種以簡單的操作收率良好地從生物材 料製造高純度鞘磷脂，特別是人型鞘磷脂和高純度縮醛磷脂型甘油磷脂的方法。解決問題的方法為了實現上述目的，本發明的發明人進行了深入的研究，其結果發現，通過對生物 材料實施特定的工序，能夠實現該目的，基於該知識而完成了本發明。S卩，本發明在於提供(1) 一種高純度磷脂的製造方法，其特徵在於，包括(A)以脂肪族烴類溶劑和水 溶性酮類溶劑的混合溶劑對從生物材料中提取的乾燥總脂質進行提取處理，分離為以鞘磷 脂為主體的不溶部分和可溶部分的工序；(B)以脂肪族烴類溶劑和水溶性酮類溶劑的混合 溶劑對上述(A)工序中得到的以鞘磷脂為主體的不溶部分進行洗淨處理，得到粗製鞘磷脂 的工序；(C)對上述㈧工序中得到的可溶部分進行溶劑除去處理之後，以水溶性酮類溶劑 進行洗淨處理而得到粗製縮醛磷脂型甘油磷脂的工序；(D)使甘油磷脂水解酶磷脂酶與上 述(B)工序中得到的粗製鞘磷脂作用，對混合存在的甘油磷脂群進行水解處理之後，利用 溶劑萃取法得到純度90%以上的鞘磷脂的工序；和(E)使甘油磷脂水解酶磷脂酶與上述 (C)工序中得到的粗製縮醛磷脂型甘油磷脂作用，對混合存在的甘油磷脂群進行水解處理 之後，利用溶劑萃取法得到純度40%以上的縮醛磷脂型甘油磷脂的工序；(2)如上述(1)項所述的高純度磷脂的製造方法，其中，生物材料為家禽類；(3)如上述( 項所述的高純度磷脂的製造方法，其中，家禽類為產蛋廢雞和/或種雞廢雞；(4)如上述C3)項所述的高純度磷脂的製造方法，其中，產蛋廢雞由經過強制換羽 處理的產蛋雞得到；(5)如上述(1) (4)項中任一項所述的高純度磷脂的製造方法，其中，脂肪族烴 類溶劑為正己烷；(6)如上述(1) ( 項中任一項所述的高純度磷脂的製造方法，其中，水溶性酮 類溶劑為丙酮；(7)以上述(1) (6)項中任一項所述的製造方法得到的、純度為90%以上的高 純度鞘磷脂；(8)以上述(1) (6)項中任一項所述的製造方法得到的、純度為40%以上的高 純度縮醛磷脂型甘油磷脂；(9)如上述(8)項所述的高純度縮醛磷脂型甘油磷脂為純度90%以上的縮醛磷脂 型磷脂醯膽鹼；以及(10)如上述(8)項所述的高純度縮醛磷脂型甘油磷脂為純度90%以上的縮醛磷 脂型磷脂醯乙醇胺。發明的效果 根據本發明，能夠提供以簡單的操作從生物材料中，優選從家禽類中，收率良好地 製造作為功能性食品原料、醫藥品原料、化妝品原料等有用的高純度鞘磷脂，特別是人型鞘 磷脂和高純度縮醛磷脂型甘油磷脂的方法，以及以該方法得到的高純度鞘磷脂和高純度縮 醛磷脂型甘油磷脂。


圖1-1是實施例中從雞皮提取總脂質的流程圖。圖1-2是實施例中從雞胸肉提取總脂質的流程圖。圖2是實施例中從雞皮總脂質提取粗製縮醛磷脂和粗製鞘磷脂的流程圖。圖3是實施例中雞皮由來的磷脂類的HPLC圖譜。圖4是實施例中從粗製鞘磷脂製造精製鞘磷脂的流程圖。圖5是實施例中從雞胸肉的總脂質製造粗製縮醛磷脂(混合物)和粗製鞘磷脂的 流程圖。圖6是實施例中從粗製縮醛磷脂製造精製縮醛磷脂(混合物)的流程圖。圖7是實施例中雞胸肉的磷脂類的HPLC圖譜。圖8是實施例中精製縮醛磷脂的高度純化及其分離方法的說明圖。
具體實施例方式本發明的高純度磷脂的製造方法包括以下所示的(A)工序、(B)工序、(C)工序、 (D)工序和(E)工序。[ (A)工序]該(A)工序是以脂肪族烴類溶劑和水溶性酮類溶劑的混合溶劑對從生物材料中 提取的乾燥總脂質進行提取處理，分離為以鞘磷脂為主體的不溶部分和可溶部分的工序。
在該(A)工序中，作為原料使用的生物材料，只要含有鞘磷脂，特別是人型鞘磷脂 和縮醛磷脂型甘油磷脂即可，沒有特別限制，能夠使用各種生物材料，但從易獲得性、目的 物質的含量和經濟性等的觀點出發，優選家禽類，其中優選為產蛋廢雞或肉雞的種雞廢雞 (雌雄)。作為部位，除了表皮或胸脯肉等，還能夠使用內臟、脖子、翅膀、腳、頭部、骨頭等。上述產蛋廢雞是產蛋雞被廢雞化之後的雞。例如白色羽系(Julia)或褐色羽系 (Boris Brown,Sonia)的產蛋雞在平均550日齡時進行間拔處理，使其絕食數日，進行廢雞 化。作為該產蛋廢雞，根據下述理由優選由經過強制換羽處理的產蛋雞得到的產蛋廢 雞。上述強制換羽處理是使超過約500日齡的產蛋效率降低的產蛋雞絕食10 14 日，進行強制的拔毛操作，通過該處理，產蛋雞的功能再生，能夠使採蛋時間再延長約200 日。關於經過該強制換羽處理的產蛋雞的廢雞化，以上述為基準。另外，再次對上述的經過強制換羽處理的約700日齡的產蛋雞實施強制換羽處 理，能夠延長最大採蛋時間至900日齡(該處理也稱為雙強制換羽處理)。產蛋雞的合適廢雞化時間為500 950日齡，更優選為550 900日齡，更加優選 為600 750日齡。可以認為，產蛋雞，特別是500日齡以上的養雞條件下，與其它雞相比承受更高的 壓力，其結果，如以產蛋率提高的形式使功能再生，在加齡狀態下含有率降低的各種機能表 達成分，例如激素、維生素類、細胞因子等的微量成分等的分泌量亢進，抑制伴隨加齡的含 量的降低。另一方面，肉雞的種雞(雌雞、雄雞，種類Chunky、Cobb)廢雞為在平均450日齡 被廢雞化的雞。在重視肉雞的雄性健壯、雌性的健康而進行飼養，追求高效地生產健康的受 精卵，一般在較好的環境下飼養。因此，可以認為這種廢雞中機能表達成分的含量與最盛期 相比顯示降低的傾向。該肉雞種雞(雌雞、雄雞)的合適的廢雞化時間為300 550日齡，更優選為 370 550日齡，更加優選為400 450日齡。在該(A)工序中，首先從生物材料，例如從產蛋廢雞或種雞廢雞的表皮或胸肉等 中，提取總脂質，並乾燥處理。在使用雞皮時，優選切碎的或粉末化的雞皮，例如根據需要，可以在脫脂處理並一 定程度除去脂肪成分後，進行切碎或粉末化。在雞表皮的脫脂處理中，能夠採用機械的方 法、溫水浸漬加熱的方法、直接加熱方法、利用脂肪族烴類溶劑(正己烷)的方法等。在使 用雞胸肉時，優選使用胸脯肉碎末。接著，從上述雞皮碎末或粉末或者雞胸肉碎末中，使用溶劑提取總脂質，進行乾燥 而得到乾燥總脂質。作為溶劑沒有特別限制，能夠使用各種溶劑，但是優選為正己烷和異丙 醇的混合溶劑。正己烷和異丙醇的混合溶劑的體積比通常為8 2 4 6，優選為7 3 5 · 5 ο提取處理能夠按照通常方法進行，另外，對於提取液，按照通常方法，通過使用旋 轉蒸發器等蒸餾除去溶劑，或通過導入氮氣等，得到乾燥總脂質。以脂肪族烴類溶劑和水溶性酮類溶劑的混合溶劑對這樣得到的乾燥總脂質進行提取處理，分離為以鞘磷脂為主體的不溶部分(以下，也稱為粗鞘磷脂)和可溶部分。在該(A)工序中，作為乾燥總脂質提取處理中使用的混合溶劑其中一個成分的脂 肪族烴類溶劑，可以列舉例如正戊烷、異戊烷、正己烷、異己烷、正庚烷、異庚烷、環戊烷、環 己烷等，這些可以單獨使用1種，也可以混合2種以上使用，但其中優選正己烷。另外，作為上述混合溶劑的另一個成分的水溶性酮類溶劑，例如能夠使用丙酮和/ 或甲乙酮等，但是其中優選丙酮。作為混合溶劑，在使用正己烷和丙酮的混合物時，其比例優選體積比為4 6 6 4，更優選為 4.5 5. 5 5. 5 4.5。另外，該混合溶劑的使用量相對於每Ig乾燥總脂質通常為10 30mL。當該混合 溶劑的使用量不足IOmL時，不能充分進行提取處理，可能會引起不溶部分中的鞘磷脂的純 度降低或回收率低。另一方面，如果超過30mL，則與使用量成比例地難於發揮提高鞘磷脂的 純度或回收率的效果。混合溶劑的優選使用量相對於每Ig乾燥總脂質為15 25mL。提取 方法能夠按照通常方法進行。提取處理液能夠通過實施離心分離處理，分離成可溶部分和以鞘磷脂為主體的不 溶部分。[ (B)工序]該(B)工序是以脂肪族烴類溶劑和水溶性酮類溶劑的混合溶劑對上述(A)工序中 得到的以鞘磷脂為主體的不溶部分進行洗淨處理，得到粗製鞘磷脂的工序。在上述(B)工序中，關於作為洗淨處理中使用的混合溶劑成分的脂肪族烴化合物 和水溶性酮類化合物，使用如上述(A)工序中所說明的溶劑。作為混合溶劑，在使用正己烷和丙酮的混合物時，其比例，優選體積比為4 6 6 4，更優選為 4.5 5. 5 5. 5 4.5。如上操作，得到粗製鞘磷脂。[ (C)工序]該(C)工序是對上述㈧工序中得到的可溶部分進行溶劑除去處理之後，以水溶 性酮類溶劑進行洗淨處理而得到粗製縮醛磷脂型甘油磷脂的工序。作為該(C)工序中的水溶性酮類溶劑，例如能夠使用丙酮和/或甲乙酮等，但其中 優選丙酮。在該(C)工序中，首先，通過蒸餾除去上述(A)工序得到的可溶部分中的溶劑，以 上述水溶性酮類溶劑對殘留部分洗淨處理，得到粗製縮醛磷脂型甘油磷脂。[ (D)工序]該⑶工序是使甘油磷脂水解酶磷脂酶與上述⑶工序中得到的粗製鞘磷脂作 用，對混合存在的甘油磷脂群進行水解處理之後，利用溶劑萃取法得到純度90%以上的鞘 磷脂的工序。在該⑶工序中，首先使甘油磷脂水解酶磷脂酶與上述⑶工序中得到的粗製鞘 磷脂作用，對該粗製鞘磷脂中混合存在的甘油磷脂群進行水解處理。在該酶反應中，作為酶 的磷脂酶的使用量相對於粗製鞘磷脂Ig通常為0. 15 0. 45g，優選為0. 2 0. 3g。反應 溫度通常為30 70°C，優選為45 55°C，pH通常為3. 5 5. 5，優選為4 5。另外，反 應時間為1 5小時左右是充分的。
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這樣操作，進行酶反應之後，利用溶劑萃取法分離鞘磷脂。作為溶劑萃取法中使用 的溶劑，優選為脂肪族烴類溶劑和水溶性酮類溶劑的組合，作為脂肪族烴類溶劑優選正己 烷，作為水溶性酮類溶劑優選丙酮。在使用正己烷和丙酮的組合時，其使用比例通常優選體 積比為4 6 6 4，更優選為4.5 5. 5 5. 5 4.5。利用溶劑萃取法分離處理後，以脂肪族烴類溶劑和水溶性酮類溶劑的混合溶劑， 優選體積比為4 6 6 4的正己烷和丙酮的混合溶劑，對在冰浴中靜置1小時後通過 離心分離將固液分離得到的固形物進行洗淨處理，在冰浴中靜置1小時後以離心分離等的 方法通過固液分離，得到純度90%以上，優選為95%以上，更優選為99%以上的高純度鞘磷脂。[ (E)工序]該(E)工序為使甘油磷脂水解酶磷脂酶與上述(C)工序中得到的粗製縮醛磷脂 型甘油磷脂作用，對混合存在的甘油磷脂群進行水解處理之後，利用溶劑萃取法得到純度 40%以上的縮醛磷脂型甘油磷脂的工序。在該(E)工序中，首先，使甘油酯水解酶磷脂酶與上述(C)工序中得到的粗製縮醛 磷脂型甘油磷脂作用，對該粗製鞘磷脂中混合存在的甘油磷脂群進行水解處理。在該酶反 應中，作為酶的磷脂酶的使用量相對於粗製縮醛磷脂型甘油磷脂Ig通常為0. 15 0. 45g， 優選為0. 2 0. 3g。反應溫度通常為30 70°C，優選為45 55°C，pH通常為3. 5 5. 5， 優選為4 5。另外，反應時間為1 5小時左右是充分的。這樣操作，進行酶反應之後，利用溶劑萃取法，提取縮醛磷脂型甘油磷脂。作為溶 劑萃取法中使用的溶劑，優選為脂肪族烴類溶劑和低級醇類溶劑的組合，作為脂肪族烴類 溶劑優選正己烷，作為低級醇類溶劑優選為異丙醇。在使用正己烷和異丙醇的組合時，其使 用比例通常優選體積比為8 2 4 6，更優選為7 3 5 5。利用溶劑萃取法提取處理後，對脂肪族烴類溶劑層進行水洗，對蒸餾除去該溶劑 得到的固形物成分以脂肪族烴類化合物和水溶性酮類化合物的混合溶劑，優選體積比為 4 6 6 4的正己烷和丙酮的混合溶劑進行洗淨處理，通過離心分離等的方法固液分 離，得到純度40%以上，優選95%以上，更優選99%以上的高純度縮醛磷脂型甘油磷脂。另外，作為縮醛磷脂型磷脂醯膽鹼，能夠得到純度95%以上，優選99. 5%以上的 產物，作為縮醛磷脂型磷脂醯乙醇胺，能夠得到純度95%以上，優選99. 5%以上的產物。根據本發明的方法，在使用雞皮作為原料時，能夠從脫油濃縮雞皮中，通常以 0. 2 0. 6質量％左右得到純度90%以上的高純度鞘磷脂，以及以0. 3 2質量％的比例 得到純度40%以上的高純度·混合縮醛磷脂型甘油磷脂。在使用胸脯肉作為原料時，能夠 通常以0. 2 1質量％左右得到純度40%以上的高純度·混合縮醛磷脂型甘油磷脂，以及 以0. 01 0. 1質量％的比例得到純度90%以上的高純度鞘磷脂。鞘磷脂為神經醯胺的一級醇羥基與磷酸膽鹼的磷酸二酯鍵結合的物質，具有下式 (I)的結構，不僅存在於通常動物體的腦組織，而且還廣泛存在於臟器組織中。
權利要求
1.一種高純度磷脂的製造方法，其特徵在於，包括(A)以脂肪族烴類溶劑和水溶性酮類溶劑的混合溶劑對從生物材料中提取的乾燥總脂 質進行提取處理，分離為以鞘磷脂為主體的不溶部分和可溶部分的工序；(B)以脂肪族烴 類溶劑和水溶性酮類溶劑的混合溶劑對所述(A)工序中得到的以鞘磷脂為主體的不溶部 分進行洗淨處理，得到粗製鞘磷脂的工序；(C)對所述(A)工序中得到的可溶部分進行溶劑 除去處理之後，以水溶性酮類溶劑進行洗淨處理而得到粗製縮醛磷脂型甘油磷脂的工序； (D)使甘油磷脂水解酶磷脂酶與所述(B)工序中得到的粗製鞘磷脂作用，對混合存在的甘 油磷脂群進行水解處理之後，利用溶劑萃取法得到純度90%以上的鞘磷脂的工序；和(E) 使甘油磷脂水解酶磷脂酶與所述(C)工序中得到的粗製縮醛磷脂型甘油磷脂作用，對混合 存在的甘油磷脂群進行水解處理之後，利用溶劑萃取法得到純度40%以上的縮醛磷脂型甘 油磷脂的工序。
2.如權利要求1所述的高純度磷脂的製造方法，其特徵在於 生物材料為家禽類。
3.如權利要求2所述的高純度磷脂的製造方法，其特徵在於 家禽類為產蛋廢雞和/或種雞廢雞。
4.如權利要求3所述的高純度磷脂的製造方法，其特徵在於 產蛋廢雞由經過強制換羽處理的產蛋雞得到。
5.如權利要求1 4中任一項所述的高純度磷脂的製造方法，其特徵在於 脂肪族烴類溶劑為正己烷。
6.如權利要求1 5中任一項所述的高純度磷脂的製造方法，其特徵在於 水溶性酮類溶劑為丙酮。
7.一種高純度鞘磷脂，其特徵在於以權利要求1 6中任一項所述的製造方法得到，純度為90%以上。
8.一種高純度縮醛磷脂型甘油磷脂，其特徵在於以權利要求1 6中任一項所述的製造方法得到，純度為40%以上。
9.如權利要求8所述的高純度縮醛磷脂型甘油磷脂，其特徵在於 其為純度90%以上的縮醛磷脂型磷脂醯膽鹼。
10.如權利要求8所述的高純度縮醛磷脂型甘油磷脂，其特徵在於 其為純度90%以上的縮醛磷脂型磷脂醯乙醇胺。
全文摘要
本發明在於提供一種以簡單的操作收率良好地從生物材料製造高純度鞘磷脂和高純度縮醛磷脂型甘油磷脂的方法。該高純度磷脂的製造方法包括(A)以特定的混合溶劑對從生物材料中提取的乾燥總脂質進行提取處理，分離為不溶部分和可溶部分的工序；(B)以特定的混合溶劑對上述(A)工序中得到的不溶部分進行洗淨處理，得到粗製鞘磷脂的工序；(C)以水溶性酮類溶劑對上述(A)工序中得到的可溶部分進行洗淨處理而得到粗製縮醛磷脂型甘油磷脂的工序；(D)使酶與上述(B)工序中得到的粗製鞘磷脂作用，得到純度90％以上的鞘磷脂的工序；和(E)使酶與上述(C)工序中得到的粗製縮醛磷脂型甘油磷脂作用，得到純度40％以上的縮醛磷脂型甘油磷脂的工序。
文檔編號C11B3/02GK102099453SQ20098012849
公開日2011年6月15日 申請日期2009年6月19日 優先權日2008年6月20日
發明者名達義剛, 馬渡志郎 申請人:丸大食品株式會社, 醫療法人社團布庫思, 有限會社梅田事務所