從羅漢果根中提取的皂苷類化合物、其製備方法及其用途的製作方法

2023-05-18 14:35:36 4

專利名稱：：從羅漢果根中提取的皂苷類化合物、其製備方法及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥
技術領域：
，具體涉及從羅漢果根中分離得到結構新穎的皂苷類化合物；本發明還涉及上述皂苷類化合物的製備方法及其用途。(二)
背景技術：
：羅漢果5Y7^'z^a^ro^e/n7(Swingle)C.Jeffrey為葫戶科羅漢果屬多年生宿根莖性的藤本植物，是我國特有的經濟、藥用植物，為廣西桂北地區傳統特產。羅漢果根系發達，塊根肥大，味苦，性微寒，具有清熱祛溼，通絡止痛之功效。經藥理實驗表明，羅漢果根的提取物具有抗炎、鎮痛、解莖、降酶等多種作用，臨床試驗證明其對風溼性關節炎療效顯著。對羅漢果根的提取物進行抗腫瘤篩選，發現它在體內外對多種腫瘤譜均顯示有較強的抗癌活性。前人對羅漢果根已進行的化學成分的研究，主要有1、廣西中醫藥研究所的王雪芬等人首先從羅漢果根的脂溶性部位，分離並鑑定了2個三萜酸(見1996年第27巻第9期《中草藥》第515518頁)，經光譜鑑定和X-衍射晶體結構分析，發現它們為失碳的葫蘆垸型四環三萜酸，分別命名為羅漢果酸甲(SiraiticacidA)，羅漢果酸乙(SiraiticacidB);之後又分離鑑定了羅漢果酸丙(SiraiticacidC)，羅漢果酸丁(SiraiticacidD)(見1998年第29巻第5期《中草藥》第293295頁)。2、中國醫科院藥用植物研究所的斯建勇、陳迪華等人也從羅漢果根提物中分離得到這些成分，並且還另得到一個新的三萜酸，命名為羅漢果酸戊(SiraiticacidE)，還獲得一些已知成分為a_棕櫚精(a-monopalmiten)、a-菠菜甾醇(spinasterol)及硬月旨酸(stearicacid)(見藥學學J艮ActaPharmaceuticaSinica1999，34(12):918920)。至今僅見羅漢果根中脂溶性部位的化學成分的報導，未見有對其水溶性皂苷類化合物的報導。(三)
發明內容本發明要解決的技術問題是提供從羅漢果根中提取分離得到的結構新穎的水溶性皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC，並且還提供這兩種皂苷類化合物的製備方法及其用途。本發明從羅漢果根中提取分離的結構新穎的皂苷類化合物，具體有兩種，分別命名為SiraiticacidIIB(羅漢果酸乙苷II)和SiraiticacidIIC(羅漢果酸丙苷n)，其中，SiraiticacidIIB的結構式如下式(I)所示formulaseeoriginaldocumentpage5SiraiticacidIIC的結構式如下式(II)所示:formulaseeoriginaldocumentpage5(II)本發明還將提供上述皂苷類化合物的製備方法，它包括以下步驟-(1)提取取羅漢果根碎片用甲醇或乙醇溶液加熱回流提取，提取液回收甲醇或乙醇，得到的浸膏溶於蒸餾水中，過濾，溶液通過大孔樹脂柱，依次用水、50%甲醇和100%甲醇洗脫，收集100%甲醇洗脫液，回收甲醇，得總皂苷提取物；(2)分離上述總皂苷提取物應用矽膠柱層析，以氯仿甲醇:水的體積比=20:1:0.15:1:0.1的混合溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的流份；再經葡聚糖凝膠S印hadexLH-20層析，以100%甲醇進行洗脫，薄層層析檢測，收集含目標化合物的流份；最後經d8反相柱層析，以甲醇:水的體積比=1:44:2的混合溶劑進行洗脫，薄層層析檢測，得到SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC。上述製備方法步驟(1)中，羅漢果根碎片用相當於其重量的46倍、體積濃度為80100%的甲醇或乙醇溶液加熱回流提取；提取的次數為23次，每次提取的時間為24小時，優選提取3次，每次提取23小時；所述的大孔吸附樹脂柱可為D101型、AB-8型或DiaionHP20型。對於羅漢果根碎片一般是將羅漢果根粉碎至1040目。本發明還包括:從羅漢果根中提取分離得到的皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC在製備抗腫瘤藥物中的用途。本發明是從羅漢果根的甲醇或乙醇提取物中分離得到兩種結構新穎的皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC，申請人經研究，發現這兩種化合物體外對多種腫廇株具有明顯的抑制作用，為研製新的抗腫瘤藥物提供了先導化合物，對綜合開發利用羅漢果資源具有重要價值。具體實施例方式實施例1:取乾燥的採集於廣西桂林永福龍江鄉的羅漢果根碎片(30目)3000克浸泡於15升體積濃度為80。/q的甲醇中，8(TC回流提取3次，每次3小時，過濾，合併提取液，減壓回收甲醇得浸膏120克。浸膏溶於2升蒸餾水中，過濾，濾液通過D101型大孔樹脂柱，依次用水，體積濃度為50%的甲醇，體積濃度為100%的甲醇梯度洗脫，收集100%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，得浸膏5.1克，然後用矽膠柱層析，以氯仿甲醇:水=20:1:0.15:1:0.1(v/v)混合溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的流份，再經葡聚糖凝膠S印hadexLH-20層析，以體積濃度為100%的甲醇進行洗脫，薄層層析檢測，收集含目標化合物的部分，經U反相柱進行分離，以甲醇:水二3:2(v/v)進行洗脫，薄層層析檢測，得到SiraiticacidIIB64.6毫克和SiraiticacidIIC42毫克，經HPLC檢測，Siraiticacid1IB純度為98.1%，SiraiticacidIIC純度為99.0%。實施例2:取乾燥的採集於廣西桂林永福龍江鄉的羅漢果根碎片(20目)2000克浸泡於8升體積濃度為80%的甲醇中，8(TC回流提取3次，每次2小時，過濾，合併提取液，減壓回收乙醇得浸膏78克。浸膏溶於l升蒸餾水中，過濾，濾液過AB-8型大孔樹脂柱，依次用水，體積濃度為50%的甲醇，體積濃度為100%的甲醇梯度洗脫，收集100%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，得浸膏3.5克，然後用矽膠柱層析，以氯仿甲醇:水=20:1:0.15:1:0.1(v/v)混合溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的流份，再經葡聚糖凝膠S印hadexLH-20層析，以體積濃度為100%的甲醇進行洗脫，薄層層析檢測，收集含目標化合物的部分，經Ci8反相柱進行分離，以甲醇:水=4:2(v/v)進行洗脫，薄，層析檢測，得到SiraiticacidIIB40毫克和SiraiticacidIIC25毫克，經HPLC檢測，Siraiticacid1IB純度為98.40/0,SiraiticacidIIC純度為98.2%。實施例3:取乾燥的採集於廣西桂林永福龍江鄉的羅漢果根碎片(40目)3000克浸泡於18升體積濃度為90%乙醇中，85。C回流提取2次，每次4小時，過濾，合併提取液，減壓回收乙醇，得浸膏130克。浸膏溶於2升蒸餾水中，過濾，濾液過DiaionHP20型大孔樹脂柱，依次用水，體積濃度為50%的甲醇，體積濃度為100%的甲醇梯度洗脫，收集100%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，得浸膏5.7克，然後用矽膠柱層析，以氯仿甲醇:水二20:1:0.15:1:0.1(v/v)混合溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的流份，再經葡聚糖凝膠S印hadexLH-20層析，以100%甲醇進行洗脫，薄層層析檢測，收集含目標化合物的部分，經d8反相柱進行分離，以甲醇:水=1:4(v/v)進行洗脫，薄層層析檢測，得到SiraiticacidIIB70.5毫克和Siraiticacid1IC48毫克，經HPLC檢測，Siraiticacid1IB純度為99.0。/。，Siraiticacid1IC純度為98.5%。實驗例1材料與儀器1.1材料乾燥的羅漢果根碎片(採集於廣西桂林永福龍江鄉)1.2儀器TC-15加熱回流提取儀(鄭州長城科工貿公司)；矽膠200-300目(青島海洋化工廠)；葡聚糖凝膠柱S印hadexLH-20(瑞典AmershamBioschiencesAB);C18反相材料(Chromatorex日本富士化學公司)；JEOLA500MHz核磁共振儀(日本分光株式會社)；JEOLJMS-DX303HF高分辯質譜儀(日本電子株式會社)；METTLERAT200天平(瑞士梅特勒公司)；DIP-1000KUY旋光儀(日本分光株式會社)；R-200型旋轉蒸發儀(瑞士Bllchi公司)；2010型酶標儀(鄭州安圖生物工程有限公司)。2皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的製備同上述實施例1。3結構分析3.1SiraiticacidIIB的結構分析化合物SiraiticacidIIB為白色無定形粉末，[a]25D+10.4°(MeOH，C=0.2)。由快原子轟擊高分辨質譜得該化合物的精密質量數為817.4073[M+Na]+，推算其分子式為C41H62015H和13C核磁共振數據見表1。表l:化合物SimiticacidIIB的^和"'C的麗R數據(inC5D5N)Cno."CNMR'HNMR(J)鵬C(H-C)119,91.13(1H，m)，1.52(1H，m)225.61.52，2.1243209.8450.32.61(d,6.8)590.1625.81.91,2.1728.11.18,1.95845,52.04(1H,br.t,9.7)13,30959.91044.82.79(1H,br.t,9.2)1111209.81233.81.151348.71449.11535.91.291634,81.131749.51.561816.60.65(3H，s)13,171974.63.63(8.6),4.71(8.6)102035.81.302118.20.82(3H,d,6.3)17,202239.92.20，2.322350.62.59,2.7924144.67.06(t,6.8,5.8)25，26，2725127.52612.51.92(3H，s)24，25,2727167.1288.41.34(3H,d，6.8)3,4,53019.91.22(3H,s)8,14,15G-l'96.26.44(1H,d，8.0)272,74.24.12(1H,dd，7.3,6.3)Gl'3,78.54,18(1H,dd,7.9，6.3)G2'，G4'4,70.84,35(1H,dd,5.1,6.3)G5'5,77.94.IO(IH，m)G6'6,69.54.76(1H，11.5),4.31(9,8)G5'G-1"105.35.Ol(lH,d，7.5)G6'2"75.14.02(1H,dd，7.5'6.8)Gl",G3"3"78.43.88(1H，m)G2",G4"4"71.44.19(1H,dd,7.9,6.3)G5"5"78.54.18(1H,dd，7.9，6.3)G6"6"62.54.42(1H，d，8.6)，4.28(9.1)G5"500MHzfor13C，500MHzfor'HG—葡萄糖，括號內數字為偶合常數/(Hz)值。由上述表l中的核磁共振數據可確定SiraiticacidIIB的化學結構式如下o3.2SiraiticacidIIC的結構分析化合物SiraiticacidIIC為白色無定形粉末，[a]25D+18.4°(MeOH，C二0.2)。由快原子轟擊高分辨質譜得該化合物的精密質量數為787.4639[M+Na]+,推算其分子式為C4QH6。0I4。'H和13C核磁共振數據見表2。表2:化合物SimiticacidIIA的^和13C的麗R數據(inC5D5N)tableseeoriginaldocumentpage10"500MHzforI3C,500MHzfor'HG—葡萄糖，括號內數字為偶合常數/(Hz)值。由上述表2中的核磁共振數據可確定SiraiticacidIIC的化學結構式如下o4體外抗腫瘤試驗申請人對製備得到的化合SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC進行了體外抗腫瘤試驗，表明兩種化合物均具有明顯的抑制腫瘤的效果。試驗選用的細胞株為國際通用的腫瘤細胞株，為A549(肺癌)，H印-G2(肝癌)，試驗方法為國際通用的MTT法。4.1SiraiticacidIIB的體外抗腫瘤試驗4.1.1試驗方法取處於對數生長期的A549和H印-G2癌細胞株，細胞計數法後用RPMI-1640培養液調配成濃度為5000個/ml，接種於96孔培養板，每孔加入190ul腫瘤細胞，在37。C及5%C02條件下培養24小時後加樣品化合物Siraiticacid1IB(10ul/孔)，設10、20、50、100、150、200ug/ml6個濃度，同時設空白對照組和對照組，每組設3個平行孔，在37'C及5%C02條件下培養96小時後，棄去孔中培養液，每孔加入200ul、0.2mg/mlMTT溶液(用1640培養基配製)，震蕩混勻後繼續在37。C及5%C02條件下培養4小時，棄去上清液，加DMS0200ul/孔,酶標儀測定其0D,值，計算抑制率，並通過濃度-抑制率曲線求IC5Q。抑制率％二(l-實驗組平均0D值/對照組平均0D值)X100%。4.1.2試驗結果結果顯示當樣品作用96小時後，化合物Siraiticacid1IB對A549和H印-G2癌細胞的生長抑制作用的半數抑制濃度IC幼分別為9.2Pg/ml和5.9Pg/ml。實驗結果表明化合物SiraiticacidIIB對A549和Hep-G2癌細胞的生長具有明顯的抑制作用。4.2SiraiticacidIIC的體外抗腫瘤試驗4.2.1實驗方法取處於對數生長期的H印-G2癌細胞株，方法及設置同上述SiraiticacidIIB的抗腫瘤試驗。4.2.2試驗結果結果顯示當樣品作用96小時後，化合物SiraiticacidIIC對癌細胞H印-G2的生長抑制作用的半數抑制濃度IG。為10.4Pg/ml。實驗結果表明化合物SiraiticacidIIC對H印-G2癌細胞的生長具有明顯的抑制作用。權利要求1、從羅漢果根中提取分離的結構新穎的皂苷類化合物，其特徵在於所述皂苷類化合物為SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC，其中，SiraiticacidIIB的結構式如下式(I)所示SiraiticacidIIC的結構式如下式(II)所示2、權利要求1所述皂苷類化合物的製備方法，其特徵在於它包括以下步驟(1)提取取羅漢果根碎片用甲醇或乙醇溶液加熱回流提取，提取液回收甲醇或乙醇，得到的浸膏溶於蒸餾水中，過濾，溶液通過大孔樹脂柱，依次用水、50%甲醇和100%甲醇洗脫，收集100%甲醇洗脫液，回收甲醇，得總皂苷提取物；(2)分離上述總皂苷提取物應用矽膠柱層析，以氯仿甲醇:水的體積比=20:1:0.15:1:0.1的混合溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的流份；再經葡聚糖凝膠S印hadexLH-20層析，以100%甲醇進行洗脫，薄層層析檢測，收集含目標化合物的流份；最後經ds反相柱層析，以甲醇:水的體積比=1:44:2的混合溶劑進行洗脫，薄層層析檢測，得到SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC。3、根據權利要求2所述的皂苷類化合物的製備方法，其特徵在於步驟(1)中，所述甲醇或乙醇溶液的體積濃度為80100%，其用量為羅漢果碎片重量的46倍。4、根據權利要求1所述的皂苷類化合物的製備方法，其特徵在於步驟(1)中，所述提取的次數為23次，每次提取的時間為24小時。5、根據權利要求1所述的皂苷類化合物的製備方法，其特徵在於步驟(1)中，所述大孔吸附樹脂柱為D101型、AB-8型或DiaionHP20型。6、權利要求1所述的皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SimiticacidIIC在製備抗腫瘤藥物中的用途。全文摘要本發明涉及醫藥
技術領域：
，具體為從羅漢果根中提取分離得到的皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC，其製備方法及其在抗腫瘤藥物中的應用。上述兩種化合物的分子式分別為C40H60O14和C41H62O15，經多種現代光譜分析，特別是應用二維核磁共振譜的綜合解析，確定了這兩種化合物的化學結構。體外抗腫瘤實驗表明，化合物SiraiticacidIIB對肺癌細胞A549和肝癌細胞Hep-G2有明顯的抑制作用，化合物SiraiticacidIIC對肝癌細胞Hep-G2也有明顯抑制作用。本發明為研製新的抗腫瘤藥物提供了先導化合物，對綜合開發利用羅漢果資源具有重要價值。文檔編號A61K31/7048GK101440118SQ20081010742公開日2009年5月27日申請日期2008年12月26日優先權日2008年12月26日發明者劉金磊,盧藝芳,盧風來,文永新,李典鵬,野原稔弘,陳月圓,黃永林申請人:廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所