一種抗病增產複合微生物菌劑的製備方法
2023-05-17 22:34:46 1
一種抗病增產複合微生物菌劑的製備方法
【專利摘要】一種抗病增產複合微生物菌劑的製備方法，涉及一種複合微生物菌劑的製備方法。是要解決現有的菌劑功能單一，保質期短的問題。方法：一、將粉煤灰和腐殖酸混合滅菌，得吸附載體；二、螢光假單胞菌接種到金氏B培養基中培養，製備螢光假單胞菌培養液；製備螢光假單胞菌種子液；發酵罐發酵得螢光假單胞菌發酵液；將螢光假單胞菌發酵液與吸附載體混合，得含螢光假單胞菌的粉劑；三、膠質芽孢桿菌接種到培養基中培養，製備膠質芽孢桿菌培養液；製備膠質芽孢桿菌種子液；發酵罐培養，得膠質芽孢桿菌發酵液；將膠質芽孢桿菌發酵液與吸附載體混合，得到含膠質芽孢桿菌的粉劑；四、菌種復配，製成微生物複合菌劑粉劑。用於作物抗病增產。
【專利說明】一種抗病增產複合微生物菌劑的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種複合微生物菌劑的製備方法。
【背景技術】
[0002]化肥是提高糧食產量的主要因素之一，多年來過多及不合理的施用導致土壤板結、地力下降、病害嚴重及品質下降。另一方面，隨著科技與經濟的不斷發展，人們對生活水平的要求也在不斷提高，對農產品提出了多樣化、優質化、無害化的需求，綠色安全食品已成為消費的熱點和時尚。改善環境、發展生態農業，迫切需要提高種植技術，徹底改變以往依靠大量使用化肥農藥提高農作物產量，生產高量低質產品的作法，嚴格限制農藥、化肥的使用量。微生物肥料產品因其具有改良土壤、降低農作物產品的農藥殘留，刺激作物生長與提高作物品質等多重功能而得到越來越廣泛地應用，成為發展生態農業、生產綠色食品的主要施肥品種之一，應用面積逐年擴大，顯示出良好的發展前景。
[0003]此外，農業生產中病、蟲、草、鼠四大威脅，尤其是病害每年對農業生產的收成造成巨大的損失，據統計病菌病害每年使農作物減產10%?20%，目前主要以化學防治為主，然而化學農藥帶來的環境汙染，農藥殘留以及病菌抗藥性等一系列問題日趨嚴重，是制約農業產業轉向綠色發展之路的瓶頸，迫使人們在儘量科學應用化學農藥、加強品種抗病性研究的同時，也在不斷尋求新的防治措施。生物防治作為植物病害管理系統的一項重要措施有其固有的優勢。生物防治環境和諧、無汙染、無殘留，作用機制複雜，不易產生抗藥性，符合市場對綠色農產品的需求，因此開發環保、高效的生物農藥具有重要意義。目前生物農藥的發展已迅速崛起，成為農資產業的一支生力軍。目前我國農藥耗用量每年達150萬噸以上，如生物農藥使用量佔到農藥總數的30%。也就是說，生物農藥使用量每年達45萬噸?50萬噸,而目前我國生物農藥產量僅8-12萬噸,市場發展潛力巨大。
【發明內容】
[0004]本發明是要解決現有的菌劑功能單一，保質期短的問題，提供一種抗病增產複合微生物菌劑的製備方法。
[0005]本發明抗病增產複合微生物菌劑的製備方法，按以下步驟進行:
[0006]一、將粉煤灰和腐殖酸按重量比為4:6均勻混合滅菌，得到吸附載體；
[0007]二、用接種環挑取螢光假單胞菌接種到5mL金氏B培養基中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，然後將螢光假單胞菌劃線接種到金氏B培養基平板上，於30°C培養箱中培養18h，挑取單菌落再次接種到裝有5mL金氏B培養基中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，得螢光假單胞菌培養液；將螢光假單胞菌培養液按照體積百分比5%的接種量接種到10mL金氏B培養基中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，得螢光假單胞菌種子液；然後將螢光假單胞菌種子液全部接種到含有30L金氏B培養基的發酵罐中，連續培養24小時，得螢光假單胞菌發酵液；
[0008]將螢光假單胞菌發酵液與吸附載體混合，螢光假單胞菌發酵液的重量為吸附載體重量的10%，得到含螢光假單胞菌的粉劑；
[0009]三、用接種環挑取膠質芽孢桿菌接種到5mL培養基中，於31°C、150r/min振蕩培養18h，然後將膠質芽孢桿菌劃線接種到培養基平板上，於31°C培養箱中培養18h，挑取單菌落再次接種到5mL培養基中，於3rC、150r/min振蕩培養18h，得膠質芽孢桿菌培養液；將膠質芽孢桿菌培養液按照體積百分比5%的接種量接種到10mL培養基中，於3rC、150r/min振蕩培養18h，得膠質芽孢桿菌種子液；然後將膠質芽孢桿菌種子液全部接種到含有30L培養基的發酵罐中，連續培養24小時，得膠質芽孢桿菌發酵液；
[0010]將膠質芽孢桿菌發酵液與吸附載體混合，膠質芽孢桿菌發酵液的重量為吸附載體重量的10%，得到含膠質芽孢桿菌的粉劑；
[0011]四、菌種復配:
[0012]將含螢光假單胞菌的粉劑與含膠質芽孢桿菌的粉劑復配均勻，其中螢光假單胞菌與膠質芽孢桿菌的重量比為8:2，製成微生物複合菌劑粉劑。
[0013]所述突光假單胞菌為突光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens),所述膠質芽孢桿菌為膠質芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov),均購買自北京雙龍阿姆斯科技有限公司。
[0014]本發明採用現代生物工程技術，利用本項目的相關農用微生物農藥製劑研究成果，以螢光假單胞菌(抗病菌株)和矽酸鹽細菌(增產菌株)作為重點研究對象，以減少農藥、化肥用量、提高作物品質與產量、改善土壤生態環境等為目標，研究建立相應的生產工藝及配方，通過多點次田間試驗，形成配套應用技術，減輕因施用化肥、農藥而造成的環境汙染日益加重的現狀。
[0015]本發明的優點:本發明所製備的複合菌劑能減少化肥用量20% ;抑制土傳病害的發生，防效達60%以上；改善作物品質，提高產量10%左右。本複合菌劑通過代謝產生多種次級代謝產物，對蔬菜作物常見的枯萎病、晚疫病、灰黴病，惡菌病等有良好的抑制作用，同時也可以產生多種激素類物質，刺激作物生長發育，增加作物產量，充分發揮微生物間的協同、互補、增強作用，達到既增產又抗病的雙重功效。因此該複合菌劑具有安全、高效、廣譜和效果穩定的優勢，在田間應用可同時發揮肥和藥的功能，簡化使用程序。
[0016]本發明的複合菌劑能有效抑制作物根際病原真菌和細菌產生的病害，同時具有增產效果。經多地區、多種作物田間試驗，土壤傳播病害發病率可控制在10%以下，增產達10 %左右，優於國內其他微生物製劑產品。
【具體實施方式】
[0017]本發明技術方案不局限於以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0018]【具體實施方式】一:本實施方式抗病增產複合微生物菌劑的製備方法，按以下步驟進行:
[0019]一、將粉煤灰和腐殖酸按重量比為4:6均勻混合滅菌，得到吸附載體；
[0020]二、用接種環挑取螢光假單胞菌接種到5mL金氏B培養基中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，然後將螢光假單胞菌劃線接種到金氏B培養基平板上，於30°C培養箱中培養18h，挑取單菌落再次接種到裝有5mL金氏B培養基中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，得螢光假單胞菌培養液；將螢光假單胞菌培養液按照體積百分比5%的接種量接種到10mL金氏B培養基中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，得螢光假單胞菌種子液；然後將螢光假單胞菌種子液全部接種到含有30L金氏B培養基的發酵罐中，連續培養24小時，得螢光假單胞菌發酵液；
[0021]將螢光假單胞菌發酵液與吸附載體混合，螢光假單胞菌發酵液的重量為吸附載體重量的10%，得到含螢光假單胞菌的粉劑；
[0022]三、用接種環挑取膠質芽孢桿菌接種到5mL培養基中，於31°C、150r/min振蕩培養18h，然後將膠質芽孢桿菌劃線接種到培養基平板上，於31°C培養箱中培養18h，挑取單菌落再次接種到5mL培養基中，於3rC、150r/min振蕩培養18h，得膠質芽孢桿菌培養液；將膠質芽孢桿菌培養液按照體積百分比5%的接種量接種到10mL培養基中，於3rC、150r/min振蕩培養18h，得膠質芽孢桿菌種子液；然後將膠質芽孢桿菌種子液全部接種到含有30L培養基的發酵罐中，連續培養24小時，得膠質芽孢桿菌發酵液；
[0023]將膠質芽孢桿菌發酵液與吸附載體混合，膠質芽孢桿菌發酵液的重量為吸附載體重量的10%，得到含膠質芽孢桿菌的粉劑；
[0024]四、菌種復配:
[0025]將含螢光假單胞菌的粉劑與含膠質芽孢桿菌的粉劑復配均勻，其中螢光假單胞菌與膠質芽孢桿菌的重量比為8:2，製成微生物複合菌劑粉劑。
[0026]本實施方式製備的複合微生物菌劑，是以抗病菌株-螢光假單胞菌和增產菌株-矽酸鹽細菌進行復配組合，使其發揮多重功效，提高抗病能力、促生、降解、活化功能，其對多種真菌、細菌性病害具有良好的防治作用。能減少化肥用量20% ;抑制土傳病害的發生，防效達60%以上；改善作物品質，提高產量10%左右。同時可使產品保質期延長到一年以上。形成適合本土的兼有「藥-肥」合一功能的新型微生物製劑，減輕因施用化肥、化學農藥而造成的環境汙染日益加重的現狀。
[0027]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟二中金氏B培養基由20g蛋白腖、1.5g磷酸氫二鉀、1.5g硫酸鎂、1g瓊脂和100mL無菌水組成，pH值為7.2±0.2。其它與【具體實施方式】一相同。
[0028]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:步驟二中發酵罐中培養溫度為28.5°C。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0029]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是:步驟三所述培養基由 0.2g ΚΗ2Ρ04、0.8g Κ2ΗΡ04、0.2g MgSO4.7Η20、0.Ig CaSO4.2Η20、0.0lgNa2MoO4.2Η20、0.5g 酵母、20g 甘露醇、0.0lg FeCl3 和 100mL 水組成，pH 值為 7.0 ?7.4。
其它與【具體實施方式】
一至三之一相同。
[0030]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是:步驟三中發酵罐中培養溫度為30°C。其它與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0031]實施例1:
[0032]本實施例抗病增產複合微生物菌劑的製備方法，按以下步驟進行:
[0033]一、將粉煤灰和腐殖酸按重量比為4:6均勻混合滅菌，得到吸附載體；
[0034]二、用接種環挑取螢光假單胞菌接種到裝有5mL金氏B培養基的試管中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，然後將螢光假單胞菌劃線接種到金氏B培養基平板上，於30°C培養箱中培養18h，挑取單菌落再次接種到裝有5mL金氏B培養基的試管中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，得螢光假單胞菌培養液；將螢光假單胞菌培養液按照體積百分比5%的接種量接種到10mL金氏B培養基中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，得螢光假單胞菌種子液；配製30L金氏B培養基，轉入30L發酵罐中，經過121°C 20分鐘高溫滅菌，冷卻到28.5°C保持恆溫，然後將螢光假單胞菌種子液全部接種到發酵罐中，連續培養24小時，得螢光假單胞菌發酵液；螢光假單胞菌發酵液中活菌數達50億/mL以上；
[0035]將螢光假單胞菌發酵液與吸附載體混合，螢光假單胞菌發酵液的重量為吸附載體重量的10%，得到含螢光假單胞菌的粉劑；
[0036]所述金氏B培養基由20g蛋白腖、1.5g磷酸氫二鉀、1.5g硫酸鎂、1g瓊脂和100mL無菌水組成，pH值為7.2±0.2。
[0037]三、用接種環挑取膠質芽孢桿菌接種到裝有5mL培養基的試管中，於31°C、150r/min振蕩培養18h，然後將膠質芽孢桿菌劃線接種到培養基平板上，於31°C培養箱中培養18h，挑取單菌落再次接種到裝有5mL培養基的試管中，於31°C、150r/min振蕩培養18h，得膠質芽孢桿菌培養液；將膠質芽孢桿菌培養液按照體積百分比5%的接種量接種到10mL培養基中，於3rC、150r/min振蕩培養18h，得膠質芽孢桿菌種子液；配製30L培養基，轉入30L發酵罐中，經過121°C 20分鐘高溫滅菌，冷卻到30°C保持恆溫，然後將膠質芽孢桿菌種子液全部接種到發酵罐中，連續培養24小時，得膠質芽孢桿菌發酵液；膠質芽孢桿菌發酵液中活菌數達50億/mL以上；
[0038]將膠質芽孢桿菌發酵液與吸附載體混合，膠質芽孢桿菌發酵液的重量為吸附載體重量的10%，得到含膠質芽孢桿菌的粉劑；
[0039]步驟三所述培養基由0.2g ΚΗ2Ρ04、0.8g Κ2ΗΡ04、0.2g MgSO4.7Η20、0.IgCaSO4.2Η20、0.0lg Na2MoO4.2Η20、0.5g 酵母、20g 甘露醇、0.0lg FeC13 和 100mL 水組成，pH值為7.0?7.4。
[0040]四、菌種復配:
[0041]將含螢光假單胞菌的粉劑與含膠質芽孢桿菌的粉劑復配均勻，其中螢光假單胞菌與膠質芽孢桿菌的重量比為8:2，製成微生物複合菌劑粉劑，活菌數> 5億/克。
[0042]所述突光假單胞菌為突光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens),所述膠質芽孢桿菌為膠質芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov),均購買自北京雙龍阿姆斯科技有限公司。
[0043]為驗證本實施例的有益效果進行以下試驗:
[0044]試驗1:本實施例抗病增產複合微生物菌劑在青椒上的田間試驗報告(時間2013.4—2013.7，地點:黑龍江省雞西市)
[0045]一、試驗方案和方法:本實驗設兩個處理，不設重複。
[0046]處理I試驗田:常規施肥+供試菌劑；
[0047]處理2對照田:常規施肥+等量清水。
[0048]試驗田面積I畝，對照田面積I畝。其它管理措施保持一致。
[0049]供試菌劑施用方法和施用時間:每畝用量5公斤，在青椒座果期開始，每隔7天隨灌水衝施，共衝施2次。
[0050]二、試驗結果:
[0051]試驗田青椒在常規施肥的基礎上噴施高技術研究院提供的生物菌劑，比對照田在常規施肥的基礎上噴施等量清水畝增產437.36千克，增產率13.57%，降低發病率8.2%，投入產出比為1:48.60。
[0052]試驗2:微生物複合菌劑在番茄上田間小區實驗(時間:2013.2-2013.6，地點:黑龍江省哈爾濱市阿城區)
[0053]一、試驗設計:試驗分別設計3個處理，3次重複，共計9個試驗小區，小區面積30平方米，各小區隨機排列，設保護行。
[0054]二、試驗處理:
[0055]Kl:常規施肥+衝施菌劑；K2:常規施肥+衝施等量清水；CK:常規施肥。
[0056]施肥方法:①常規施肥:底肥為農家肥500kg/畝、尿素25kg/畝、磷二銨25kg/畝；追肥2次，每次施尿素1kg/畝；②衝施菌劑:共衝施二次，分別在苗期和採收前，每次衝施5公斤/畝(1:100稀釋)③衝施等量清水:共衝施二次，時期與噴施菌劑相同。
[0057]三、試驗結果:
[0058]本實施例的微生物複合菌劑對番茄進行衝施，可提高坐果率，增加產量10.3% ;有效改善品質，降低發病率為6.4%。
[0059]試驗3:微生物複合菌劑在黃瓜上田間小區實驗(時間:2014.2-2014.7，地點:哈爾濱市阿城區)
[0060]一、試驗設計:試驗分別設計3個處理，3次重複，共計9個試驗小區，小區面積30平方米，各小區隨機排列，設保護行。
[0061]二、試驗處理:K1:常規施肥+衝施複合菌劑；K2:常規施肥+衝施等量清水；CK:
常規施肥。
[0062]施肥方法:①常規施肥:底肥為農家肥450kg/畝、尿素20kg/畝、磷二銨30kg/畝；追肥2次，每次施尿素1kg/畝衝施複合菌劑:共噴施二次，分別在苗期和採收前，每次噴施5公斤/畝(1:100稀釋)③衝施等量清水:共衝施二次，時期與衝施複合菌劑相同。
[0063]三、試驗結果:
[0064]本實施例的微生物複合菌劑對黃瓜進行衝施，可提高坐果率，增加產量11.9% ;有效改善品質，降低發病率達9.6%。
【權利要求】
1.一種抗病增產複合微生物菌劑的製備方法，其特徵在於該製備方法，按以下步驟進行: 一、將粉煤灰和腐殖酸按重量比為4:6均勻混合滅菌，得到吸附載體； 二、用接種環挑取螢光假單胞菌接種到5mL金氏B培養基中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，然後將螢光假單胞菌劃線接種到金氏B培養基平板上，於30°C培養箱中培養18h，挑取單菌落再次接種到裝有5mL金氏B培養基中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，得螢光假單胞菌培養液；將螢光假單胞菌培養液按照體積百分比5%的接種量接種到10mL金氏B培養基中，於30°C、150r/min振蕩培養18h，得螢光假單胞菌種子液；然後將螢光假單胞菌種子液全部接種到含有30L金氏B培養基的發酵罐中，連續培養24小時，得螢光假單胞菌發酵液； 將螢光假單胞菌發酵液與吸附載體混合，螢光假單胞菌發酵液的重量為吸附載體重量的10%，得到含螢光假單胞菌的粉劑； 三、用接種環挑取膠質芽孢桿菌接種到5mL培養基中，於31°C、150r/min振蕩培養18h，然後將膠質芽孢桿菌劃線接種到培養基平板上，於31°C培養箱中培養18h，挑取單菌落再次接種到5mL培養基中，於3rC、150r/min振蕩培養18h，得膠質芽孢桿菌培養液；將膠質芽孢桿菌培養液按照體積百分比5 %的接種量接種到10mL培養基中，於31 °C、150r/min振蕩培養18h，得膠質芽孢桿菌種子液；然後將膠質芽孢桿菌種子液全部接種到含有30L培養基的發酵罐中，連續培養24小時，得膠質芽孢桿菌發酵液； 將膠質芽孢桿菌發酵液與吸附載體混合，膠質芽孢桿菌發酵液的重量為吸附載體重量的10%，得到含膠質芽孢桿菌的粉劑； 四、菌種復配: 將含螢光假單胞菌的粉劑與含膠質芽孢桿菌的粉劑復配均勻，其中螢光假單胞菌與膠質芽孢桿菌的重量比為8:2，製成微生物複合菌劑粉劑。
2.根據權利要求1所述的一種抗病增產複合微生物菌劑的製備方法，其特徵在於步驟二中金氏B培養基由20g蛋白腖、1.5g磷酸氫二鉀、1.5g硫酸鎂、1g瓊脂和100mL無菌水組成，pH值為7.2±0.2。
3.根據權利要求1所述的一種抗病增產複合微生物菌劑的製備方法，其特徵在於步驟二中發酵罐中培養溫度為28.5°C。
4.根據權利要求1所述的一種抗病增產複合微生物菌劑的製備方法，其特徵在於步驟三所述培養基由 0.2gKH2P04、0.8gK2HP04、0.2gMgS04.7Η20、0.IgCaSO4.2Η20、0.0lgNa2MoO4.2Η20、0.5g 酵母、20g 甘露醇、0.0lgFeCl3 和 100mL 水組成，pH 值為 7.0 ?7.4。
5.根據權利要求1所述的一種抗病增產複合微生物菌劑的製備方法，其特徵在於步驟三中發酵罐中培養溫度為30°C。
【文檔編號】C05F17/00GK104371924SQ201410557938
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月20日 優先權日:2014年10月20日
【發明者】王東凱, 吳瓊, 趙金海, 王雷, 曹滌非, 黃國慶, 李瑤, 孫堯, 薛佳瑩 申請人:黑龍江省科學院高技術研究院