一種治療習慣性流產的生物學製劑的製作方法
2023-05-18 07:27:06 2
專利名稱：：一種治療習慣性流產的生物學製劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種利用非細胞成分取代傳統細胞成分製作治療不明原因習慣性流產的免疫學製劑，屬醫藥
技術領域：
。技術背景習慣性流產是指連續發生三次或以上流產者，發病率約佔總妊娠數的1%，佔自然流產數的15%，為一種嚴重危害孕婦身心健康的產禾4^病。臨床曾有病例連續發生7次流產者，病人十分痛苦。此種疾病病因十分複雜，包括遺傳因素、解剖異常、內分泌異常、感染等等，但是，在排除上述臨床病因後，仍有59.429b的習慣性流產患者，稱為不明原因習慣性流產URSA(Unexplantedrecurrentspontaneousabortion)，它與母體免疫因素有關，已成為目前人們關注的熱點。目前臨床上將URSA患者分為自身免疫型和同種免疫型兩大類，其中國內外針對同種免疫型URSA患者，常規採用"免疫細鵬繼療法"進行治療，旨在誘導受孕母體對半同種異體胎兒抗原的皿耐受，幫助孕婦度過危險期。雖然此方法的療效較肯定，國內外報導有效率達70%-95%，但仍存在以下不足，從而限制了它的臨床應用(O治療用免疫細胞的製備難度較大；(2)個體之間差異較大，影響療效的穩定性；(3)兔度細胞的新鮮分離穩定性差，因此，使用皿細胞的技術方案仍然不是人們理想的方案。有資料表明，採用丈夫^^^性個體淋巴細胞，治療的療^gBt^差異，且發揮免疫耐對秀導作用的是T細胞。這說明，採用男性同種異體T細臓行過繼轉輸均可倉腿過不同男性個體T細胞上的某些共同抗原成分發揮作用，誘導母體對半同種異體胎兒抗原的免疫耐受；而T細胞在生長增殖過程中分泌釋放的一種稱為exosomes的非細胞成分膜性麟結構，濃縮了整套T細胞自身的抗原成分，並可克服細w;分治療的諸多缺點，有可能開闢一條新的治療皿性疾病的m。目前採用exosome進行臨床應用的實l^探索，多局限於做為生物治療載體鵬刊中瘤治療，以腿機體的抗瘤敏艦為目的。但有關其做為敏耐彭秀導劑用於習慣性流產的治療，則尚未見文獻報導，更不用iMA實用治療的製劑了。
發明內容本發明所用於克月艮已有技術的不足、從而衝F種便於臨床規範使用的治療習慣性流產的生物學製劑。本發明的問題是以下述技術方案實現的一種治療習慣性流產的生物學製劑，它以男'砂卜周血為原材料，並按下述步驟進行a.培養男'粉卜周血T細胞抽取,成年男性外周血50ml;玻璃球脫纖維Hanks液1.5倍稀釋，分離淋巴細胞，收集單個核細胞；Hanks液清洗，用RPMI-1640完全培養液重懸、計數，並調整細胞濃度至2xl06/ml，加入植物血凝素(PHA)，使終濃度為lOOpg/ml;37t培養72h;,培養液的上清，代保絲用；b.製備T細胞exosomes:取上砂卜周血T細胞培養上清，以1500g離心10min去除細艦細胞碎片；好量100000超濾管過濾濃縮5倍後；以30mg/ml蔗糖/D2O為密度墊，以100OOOgMjg低溫離心75min，收集底部的緩衝墊；PBS稀釋，100000g皿低溫離心75min，獲得exosomes;0.22pm無菌濾膜過濾分裝，-80弋保存備用。上述治療習慣性流產的生物學製劑，所述體外培養應換用新鮮含PHA的培養液、在體外反覆刺激、培養，均至鏡下觀察轉化率大於75%。一種治療習慣性流產的生物學製劑的用途，可用於製備治療習慣性流產、自身免疫性疾病的藥劑或器官移MB皿耐受的誘導劑。本發明提供了一種非細胞免疫生物學製劑，它能有效地誘導機體的皿耐受，克服了免疫細皿繼療法誘導皿耐受的諸多不足，使臨床應用更為簡單易行；本製劑可以按照GMP標^ii行^Mmx業化製備，使質量控制更為穩定、可控性更強。將其應用於治療習慣性流產，取得良好的療效。本發明掛共的生物學製劑，其鵬也可用於其他自身敏性疾病、器官移植後皿耐受的誘導，等等。具體實施方式本發明分為兩大步驟，一是麟成年男'砂卜周血T細胞的體外刺激和培養，二是以離心超濾及蔗糖密度梯度離心法製備T細胞exosomes。首先抽取麟成年男'砂卜周血50ml，玻璃球脫纖維，1.5倍稀釋後，以淋巴細胞分離液分離收集單個核細胞；Hanks(細胞清洗液)液徹底清洗兩次後，RPMI-1640(細胞培養基)完全培養液重懸細胞，計數並調整細胞濃度至2xl06/ml，加入植物血凝素(PHA)使終濃度為lOOpg/ml;37弋培養72h後鏡下觀察T細胞轉化情況；換用新鮮含PHA的培養液體外反覆刺激、培養。收集的培養上清可於4t保,用。然後製備生物製劑，取經體外刺激、培養的T細胞(2xl07個)培養上清，1500g10min去除細M細胞碎片；分子量100000MWCOCentriplus超濾管超濾濃縮5倍後，以30mg/ml蔗糖/D2O為密度墊，100000g^3i低溫離心75min，收集底部的緩衝墊；PBS(磷酸鹽緩衝液)稀釋，100000g織低溫離心75min，獲得exosomes，0.22|xm無菌濾膜過濾分裝，-80匯保存即得成品。本發明使T細胞在生長增殖過程中可分泌釋放一種稱為exosomes(夕卜來體)的膜性結構，與T細胞相比，T細胞exosomes作為一種非細胞成分，具有以下特點l.濃縮了整套T細胞自身的抗原成分，含有與自身細胞特殊功能相關的蛋白(MHC-n類分子、TCR、整合素等)，可引導exosomes到達耙細胞；2.界膜穩定，一旦獲得即可長時間冷凍jt^，省去了分離並長期培養細胞的不便和困難；3.分離和提純容易，其可操作性和可控性更強；4.非細胞成分，糾只小，易清除，無繁殖能力，抗原性弱，應用於人體副作廂艮小，穩定高效。分離得到的exosomes以紫外分光光度計定量，並採用皿電鏡、Western印跡檢測其所攜帶的特徵性分子(HLA-1、HLA-II、ICAM-1等)，作為質量控制標準。將本發明產品以多點皮下注射的接種方式對URSA患者進行治療，每次間隔3周，受孕後鞏固治療至超過以往流產月份。、臨床療效按如下標準評判以再次流產大於以往流產月份作為治療有效；以足月分娩正常新生兒作為治療成功；以再次流產小於以往流產月份作為治療失敗，可與常規免疫細m繼療法進行對比。其結果是妊娠成功率約90.0%，較過繼轉輸細胞法的84.80%妊功率有顯著升高。本發明在用於治療URSA的動物實驗中，也取得良好結果，其動物試驗如下，動物模型。實-歸物為8~10周齡清潔級CBA/J(雌性？)、DBA/2(雄性3)和BALB/c(雄性^)近交系小鼠。以？CBA/Jxc^DBA/2為URSA實iMS(文獻f腿M丟失率高達25免~45%)，$CBA/Jx^BALB/c為正常對照組(文獻|腿丟失率僅為5%~8%)。雌雄小鼠按2:l交配，自同居之日起，每天8:00和15:00^別觀察一次陰栓，如見陰栓，即確定為妊1天，於妊,12~14天將小i^b死，X!^K^發育情況。父系外周單個核細胞(PBMC)exosomes的製備。職性DBA/2小鼠，摘眼^^文雄死，無菌解剖取脾，研磨、200目銅網過濾獲得單個細5R懸液；離心棄去上清液後，依次加A)K蒸水1.5mL、等量1.8%NaCl，洗滌後計數，培養液配製成2.5xl0"ml，加人刀豆蛋白A(ConA)使終濃度為l(Vg/ml;37t培養72h後鏡下觀察5T細胞轉化情況。將URSA動,型小鼠隨機分為無治療對照組、被細鵬繼治療組、exosomes治療組:對無治療對照組確定懷孕後，不進行任何治療；對被細胞過繼治療組確定懷孕後，取父系PBMC進行注射治療；對exosomes治療組確定懷孕後，將提取的經ConA刺激後父系PBMC的exsomes進行注針冶療；對孕,臺吸收率的影響M吸收的判斷標準為M糊明顯縮小，胎JL^盤單位有明顯出血或壞死者。胎盤吸收一吸TO臺鋭(吸TO胎數+存活ra數)其結果為..URSA動物模型無治療對照組的胚胎吸收率為28.21免:t2.569&，顯著高於正常對照組5.26%±0.69%。經傳統免疫細胞過繼治療後，胚胎吸收率11.40%±1.84%顯著降低。exosomes治療組的胚胎吸收率為9.76%±1.27%，均顯著低於流產無治療對照組和傳統被細胞過繼治療祖。從而說明採用製劑可取得更好的效果，詳情見下表附表不同治療方式或製劑對小鼠URSA治療效果的比較CT)tableseeoriginaldocumentpage6權利要求1.一種治療習慣性流產的生物學製劑，其特徵在於，它以男性外周血為原材料，並按下述步驟進行a.培養男性外周血T細胞抽取健康成年男性外周血50mi；玻璃球脫纖維Hanks液1.5倍稀釋，分離淋巴細胞，收集單個核細胞；Hanks液清洗，用RPMI-1640完全培養液重懸、計數，並調整細胞濃度至2×106/ml，加入植物血凝素(PHA)，使終濃度為100μg/ml；37℃培養72h；收集培養液的上清，4℃保存備用；b.製備T細胞exosomes取上述外周血T細胞培養上清，以1500g離心10min去除細胞及細胞碎片；分子量100000超濾管過濾濃縮5倍後；以30mg/ml蔗糖/D2O為密度墊，以100000g超速低溫離心75min，收集底部的緩衝墊；PBS稀釋，100000g超速低溫離心75min，獲得exosomes；0.22μm無菌濾膜過濾分裝，-80℃保存備用。2.根據權利要求1所述的治療習慣性流產的生物學製劑，其特徵在於，所述體外培養應換用新鮮含PHA的培養液、反覆刺激、培養，至鏡下轉化率大於75%。3.—種治療習慣性流產的生物學製劑的用途，其特徵在於，將其用於製備治療習慣性流產、自身皿性疾病的藥劑或器官移IIB，耐受的誘導劑。全文摘要一種治療習慣性流產的生物學製劑，屬醫藥
技術領域：
。其技術方案是，抽取健康成年男性外周血；玻璃球脫纖維Hanks液1.5倍稀釋，分離淋巴細胞，收集單個核細胞；Hanks液清洗，用RPMI-1640完全培養液重懸、計數，並調整細胞濃度至2×106/ml，加入植物血凝素，37℃培養72h；收集培養液的上清，以離心超濾及蔗糖密度梯度離心法製備T細胞exosomes；用無菌濾膜過濾分裝，-80℃保存即得成品。本發明能有效地誘導機體的免疫耐受，克服了免疫細胞過繼療法誘導免疫耐受的諸多不足，使臨床應用更為簡單易行；製劑可大規模工業化製備，使質量控制更為穩定、可控性更強。將其應用於治療習慣性流產，取得良好的療效。文檔編號A61P15/06GK101129405SQ20071006248公開日2008年2月27日申請日期2007年7月31日優先權日2007年7月31日發明者瀓崔,楊彥忠申請人:崔澂