基於納米探針直接檢測肺癌樣品中p53基因突變的方法

2023-05-18 07:05:06 1

專利名稱：：基於納米探針直接檢測肺癌樣品中p53基因突變的方法
技術領域：
：本涉及一種基於納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基因突變的方法，更確切地說，本發明涉及一種用於肺癌輔助診斷的P53基因突變檢測的納米診斷晶片。特別是一種直接檢測基因組DNA中基因突變的納米探針晶片檢測方法。
背景技術：
：肺癌是世界上發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其病死率在城市人口惡性腫瘤死亡中居首位。儘管過去20年肺癌的治療有了很大進展，但肺癌病人的預後卻無明顯提高，5年生存率僅10%15%。其主要原因在於肺癌常規篩查程序不夠充分，未能識別癌變的早期損害。隨著分子生物學技術的發展，人們逐漸認識到肺癌本質上是涉及多基因多步驟的複雜的過程，涉及遺傳和環境等諸多因素的相互作用，以及大量相關基因結構和表達調控的改變。這些遺傳學改變隨時間累加有可能引起腫瘤的發生，引起肺癌演變的各種分子遺傳學改變可作為臨床上檢測肺癌細胞的指標，為肺癌的早期診斷和治療提供了一系列的分子生物學標誌，從而使肺癌的早期診斷和個體化成為可能。一些研究從分子病理學角度出發，提出了肺癌的演變是一系列分子變異的模式，其中P53基因突變是肺癌發生的重要關鍵基因之一，深入研究p53基因突變對於了解肺癌的發生發展具有重要的意義。P53基因定位於17號染色體短臂(17P13),全長16-20kb，含有ll個外顯子與IO個內含子，野生型p53是一種抑癌基因，轉錄2.8kb的mRNA.P53基因結構和表達異常是迄今為止肺癌中最常見的分子改變，人類50%以上的腫瘤都與這種基因的失活變異有關。p53基因突變率在小細胞肺癌(SCLC)高達80%90%，非小細胞肺癌(NSCLC)亦達50%60%。p53基因異常(包括突變、缺失和過表達)也存在於無肺癌的吸菸者，從鱗狀上皮組織轉化、不典型增生到原位癌、浸潤癌過程中，p53基因突變率逐漸升高，其中30。/。肺癌在癌前病變或輕度不典型增生就存在p53基因異常，提示p53基因異常是肺癌發生的早期事件。因此P53基因的突變的檢測在肺癌的早期診斷中有著重要作用。各種各樣的分子生物學方法一致被用於檢測肺癌中P53基因的突變。其中DNA測序的方法是檢測基因突變的金標準。然而，這個方法涉及了特殊的測序儀，並且費時費力，超出了大多數臨床實驗室的承受能力。基因診斷晶片是上世紀90年代初由美國提出的技術，可看作PCR技術的進一步發展，實質是PCR、核酸雜交及晶片技術(核心為生物晶片的製備及反應信號的檢測)的有機結合。所謂生物晶片是由固定於不同種類支持介質上的高密度的寡核苷酸分子、基因片段或多肽分子的微數組組成，其中每個分子的位置及序列為已知，當螢光標記的靶分子與晶片上的探針分子結合後，可通過雷射共聚焦螢光掃描或電荷偶聯攝像機對螢光信號的強度進行檢測，從而對雜交結果進行量化分析。基因晶片技術在分子生物學研究領域、醫學臨床檢驗領域、生物製藥領域和環境醫學領域顯示出強了大的生命力。首先，它為臨床檢驗工作提供了一種全新的技術，使一些臨床檢驗工作中難解決的問題成為可能。例如實驗室診斷在單一因素疾病診斷中具有決定性的意義，但由於人體和疾病的複雜性，單一指標在臨床工作的作用是有限的，這是往往需要多指標組合，而晶片技術正好提供了解決的思路。另外，有的實驗室難題在高通量的檢測中可以得以解決，如基因表達譜以及基因突變的檢測等等。然而目前的晶片儘管可以一次性對同一樣品進行大量序列檢測和核酸分析，具有較好的靈敏性和特異度，但是仍然需要事先PC財廣增去增加特異的核苷酸濃度，而PCR反應需要嚴格的實驗室、昂貴的硬體設備和複雜的混合物和才能進行有效的酶反應，整個檢測系統龐雜；並且操作煩瑣、耗時，容易造成汙染。近年來，納米顆粒應用於生物體系引起了普遍重視，納米顆粒比表面積大、表面原子數比例高等特點也使得納米顆粒顯示出明顯的表面效應，其表面具有很高的活性，顆粒官能團密度及選擇性吸附能力變大，達到吸附平衡的時間大大縮短，粒子的穩定性大大提高。因此，相比常規材料，納米顆粒具有極高的偶聯容量，可以在單位平面上連接更多的生物活性敏感分子，從而提高檢測的敏感性。特別是納米金，在分子生物學領域的研究和應用己成為目前科學家研究的熱點。金納米粒子在水中形成的分散系俗稱膠體金，金顆粒可與氨基發生非共價的靜電吸附而牢固結合，與巰基之間形成很強的Au-S共價鍵，這使得膠態金可與生物活性分子結合，形成的探針可用於生物體系的檢測中。以膠體金為標記物的免疫金和免疫金銀染色法，可以單標記或多重標記，並可以進行大分子的定性、定位以至定量研究，已被廣泛應用於醫學和生物學的眾多領域。而納米技術和基因晶片技術的結合是基因檢測中的一項重大進展，將納米金標記的探針與互補的目的核酸共雜交錨定於固相載體上，可有效避免納米金溶液體系中的一些非特異性吸附對觀察終點的幹擾。納米金顆粒具有高電子密度的特性，當這些標記物在相應的雜交位點處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而廣泛應用於定性或半定量的快速檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為銀染色。納米金顆粒標記技術具有簡單、快速、準確和無汙染等優點，且檢測不依賴昂貴的雷射檢測儀器，只需普通光學儀器，甚至肉眼即可辨別。因此，生物傳感器中利用納米材料進行標記檢測，對於構建快速、廉價、微型的生物傳感器也具有非常重要的意義。比較傳統的螢光檢測技術，基於納米技術的晶片檢測方法由於微電子技術使帶電荷的分子運動速度加快，分子雜交的時間大大縮短；並且銀增強檢測增加了檢測的靈敏度和特異性，可以直接檢測基因組DNA的突變。
發明內容本發明的目的在於提供一種基於納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基因突變的方法，本發明要解決的技術問題是針對目前PCR以及傳統的晶片螢光檢測方法存在的不足之處，提供一種基於"三明治雜交"原理的用於檢測肺癌患者中P53基因突變的納米探針晶片的檢測方法。本發明所提供的檢測方法包括(l)探針的設計和製備；(2)待測樣品的處理和納米探針的標記；(3)雜交和檢測。用於肺癌p53突變檢測的納米探針晶片主要根據肺癌中P53基因5-8外顯子中常見突變信息設計相應探針，其中每個SNP(單核苷酸多態性)位點至少設計兩個捕捉探針，即一個野生型，一個突變型；原則是每個突變位點儘量位於探針的中間，每個探針的長度相同，為了更好地固定在修飾好的玻片上，探針的5'未端需加16個長度T的連接臂和氨基修飾，探針的合成由大連寶生物有限公司(TAKARA公司)完成。寡核苷酸探針包括捕捉探針和納米探針。雜交特徵主要根據肺癌中常見P53突變位點信息設計捕捉探針(野生型和突變型探針)，並固定在玻片表面；而以P53基因序列中臨近突變位點的一段序列設計巰基修飾的信號探針，並標記為納米金探針。捕捉探針和信號探針與耙DNA序列進行特異性的三明治等位雜交，從而達到檢測的目的。由於P53基因突變檢測與肺癌的早期診斷密切相關，該晶片中設計的探針包括了肺癌中出現頻率較高的P53基因突變信息，本發明的基因晶片可快速檢測肺癌病人組織和血清樣品中P53基因突變，可用於肺癌患者的輔助診斷。具體地說，一種無需擴增基因組DNA用於檢測p53基因突變的納米探針晶片的檢測方法，其特點在於未標記的靶核酸序列以及納米金標記的信號探針與固相支持物連接的捕獲探針進行的夾心雜交，並通過銀染增強金信號放大進行檢測，包括探針的設計和製備、待測樣品的處理和納米探針晶片的製備、雜交和檢測三部分，具體為A.探針的設計和納米探針晶片的製備①根據肺癌中P53基因5-8外顯子中常見突變信息設計相應探針(表1、2),其中每個SNP位點至少有兩個探針，即一個野生型，一個突變型；原則是每個SNP位點設計儘量位於探針的中間，鹼基長度大約16-25bp(探針見表l),為了更好地固定在修飾好的玻片上，探針的5'末端需加16個長度T的連接臂和氨基修飾。根據臨近SNP位點的靶DNA序列設計帶有巰基的信號探針，鹼基數不超過40bp，TM值溫度大致相等。探針的合成由大連寶生物有限公司(TAKARA公司)完成。②晶片的製作:將氨基修飾的捕捉探針通過晶片點樣儀點在醛基修飾的玻片上，37。C度固定，製備P53基因突變檢測晶片。B.待測樣品的處理和納米探針晶片的製備①待測樣品的處理通過如蛋白酶K消化法、快速高鹽提取法、CTAB法、SDS裂解法等方法抽提基因組DNA，然後通過超聲波降解或限制性內切酶切斷DNA的方法,控制條件將基因組DNA降解成500-1000bp的片段。②用金納米顆粒標記帶有巰基修飾的信號探針。納米探針的標記方法為15nm或30nm的納米金(上海水源生物有限公司)200pl加巰基的寡核苷酸探針100umol/L,llpl,，室溫下放置24小時，然後2MNaCl(以及lXPB)加入到該混合液中，使其濃度達到0.075M。2小時後繼續加入NaCl，並調整NaCl濃度到0.1M。繼續放置84小時後，納米顆粒通過12000rpm離心進行分離(終濃度為吸收光譜520nmDNA)。C.雜交和檢測①納米探針的晶片識別靶基因及SNP位點的雜交方法為標記了納米金的探針與晶片上的捕捉探針以及靶DNA的兩步連續的雜交。所述的納米探針晶片的雜交方法為兩步連續的雜交。第一步雜交取降解成500-1000bp的基因組DNA(濃度100ng/|iil)5fil加10pl雜交液混合，滴於晶片陣列處，蓋上蓋玻片，置於50。C雜交箱中半個小時，使DNA樣品與晶片上的特異性捕捉探針結合。然後室溫下取出晶片，在0.5M的NaNO3中洗30秒。第二步雜交將納米金標記的探針2^1與lOpl的雜交液混合後加在陣列處，50°C雜交箱中雜交20-30分鐘，然後0.5M的NaNO3中洗三次(每次30秒)。②其檢測方法是通過銀染顯色的方法，利用銀染試劑的氧化還原反應中形成的銀顆粒聚集在納米金上，而使雜交信號放大。所述的銀染顯色方法是在晶片陣列處加上新配製的銀增強液，蓋上蓋玻片，37°C反應15分鐘，結束後去掉蓋片，超純水洗一下，氮氣吹乾。納米晶片檢測方法使用光學顯微鏡觀察或者電荷藕合器件(CCD)照相採集以及普通光學掃描儀掃描記錄晶片上的信息。該檢測方法具有成本低、操作簡單、重複性好等特點，不需要價格昂貴的檢測儀器，易於在臨床推廣應用。本發明優點及效果(1)肺癌是目前國內發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，P53基因在肺癌中的突變率相較與其它腫瘤更高，利用基因晶片技術可以檢測P53基因大量的突變位點，具有高通量的特點，可用於快速檢測肺癌的發病原因，査明與肺癌相關的基因突變，為臨床醫生診斷和治療提供指導作用；(2)本發明的納米探針檢測方法可直接檢測肺癌血液或組織樣品基因組DNA的突變，不需要特殊的儀器或PCR擴增；(3)本發明的納米晶片檢測方法採用納米探針的三明治雜交方法大大提高了雜交特異性和檢測的靈敏度；(4)本發明的納米探針檢測方法檢測靈敏度超過了螢光檢測法的靈敏度，並且重複性也較好；(5)本發明納米探針晶片檢測方法採用納米金標記，銀染顯色的方法檢測雜交結果，背景低，穩定，快捷。雜交結果易於分析、保存。(6)本發明的納米探針晶片檢測，只需普通的商用掃描儀或普通的CCD採集信號，不需要昂貴的螢光掃描儀，具有成本低、操作簡單、重複性好等特點，更方便臨床的推廣使用。(7)所述的陽性內參照與陰性內參照之間只差一個鹼基。表1.是根據P53基因DNA序列信息所設計的探針表1:根據P53基因5-8外顯子DNA序列信息所設計的探針tableseeoriginaldocumentpage11表2.用於肺癌p53突變檢測的納米探針晶片矩陣tableseeoriginaldocumentpage12圖1是用於肺癌p53突變檢測的納米探針雜交示意圖(a)野生型(b)突變型。圖2是納米金探針標記直接雜交電荷藕合器件(CCD)拍照得到的結果。圖3是肺癌樣品P53基因突變檢測晶片雜交後掃描結果一致性分析，其中，(a)測序結果(b)掃描結果，箭頭所指處為179胺基酸位點突變。具體實施例方式下面通過實施例及其附圖對本發明作進一步說明。1.準備材料與試劑(1)EasyHtyb雜交液:購於Roche公司；(2)所有探針合成在大連寶生物工程(大連)有限公司(大連TaKaRa公司)(3)15nm和30nm的納米金購於上海水源生物科技有限公司(4)NaN03洗液1MNaN03300ml0.2MNa2HP0430.5ml0.2MNaH2P049.5ml定容到1000ml(5)PB溶液0.3mol/LNaN03和10mmol/LNa2HPO4/NaH2PO4，PH7.0(6)銀染增強液1%明膠2.55g擰檬酸/2.35g;檸檬酸三鈉/10mlH20;lOpl1.7g氫醌/30mlH20，30^10.5gAgNO32mlH20;1，具體實施方法1.取病人血清、痰液或組織樣品，按試劑盒提供的試劑及使用方法抽提基因組DNA，酶切或超聲降解DNA片段，使DNA片段大致為500-1000bp的片段。2.參照表1、2探針序列和矩陣設計探針和晶片，根據肺癌中P53基因5-8外顯子中常見突變信息設計相應探針，其中每個單核苷酸多態性(SNP)位點至少設計兩個捕捉探針，即一個野生型，一個突變型；原則是每個突變位點儘量位於探針的中間，每個探針的長度相同，為了更好地固定在修飾好的玻片上，探針的5'未端需加16個長度T的連接臂和氨基修飾，探針的合成由大連寶生物有限公司(TAKARA公司)完成。3.納米探針晶片的製作將氨基修飾的捕捉探針通過晶片點樣儀點在醛基修飾的玻片上，37。C度固定72小時，製備P53基因突變檢測晶片。4.而根據p53基因序列中臨近突變位點的一段序列設計巰基修飾的信號探針，信號探針的鹼基數不超過40bp，並用納米金進行標記。標記過程如下30nm的納米金200^1加巰基的寡核苷酸探針100umol/L,llpl,，室溫下放置24小時，然後2MNaCl(以及lxPB)加入到該混合液中，使其濃度達到0.075M。2小時後繼續加入NaCl，並調整NaCl濃度到O.IM。繼續放置84小時後，納米顆粒通過12000rpm離心進行分離。5.兩個質量控制核酸探針陽性內參照和陰性內參照的設計之間只差一個鹼基。陽性內參照用於檢測雜交和檢測信號是否正常，藉此評估晶片實驗的過程的有效性。如果陽性內參照在試驗結果中呈現雜交信號，說明此次試驗有效；如果陽性參照在試驗結果中未呈現信號，說明此次試驗無效。陰性內參照用於檢測雜交條件是否嚴謹。如果陰性內參照在試驗中未出現信號，說明此次試驗有效；如果陰性內參照在試驗結果中呈現信號，說明此次試驗無效。6.納米探針晶片的兩步雜交取打斷的基因組DNA(濃度100ngVl)5^1加10pl雜交液混合，滴於晶片陣列處，蓋上蓋玻片，置於50。C雜交箱中半個小時，使DNA樣品與晶片上的特異性捕捉探針結合。室溫下取出晶片，在0.5M的NaN03中洗30秒。然後進行第二次雜交，將納米金標記的探針2pl與10^1的雜交液混合後加在陣列處，50°C雜交箱中雜交20-30分鐘，然後0.5M的NaN03中洗三次(每次30秒)。7.加入銀染增強液1%明膠60|ll2.55g檸檬酸/2.35g;擰檬酸三鈉/10mlH20;10^11.7g氫醌/30mlH20，30^10.5gAgNO32mlH20;1，前三種最好新鮮配製，銀染用時再加1.2^1AgN03迅速混勻立即加到晶片陣列處，蓋上蓋玻片，放在37"C溫箱裡反應15min，結束後去離子水中洗一下，終止反應。8.使用電荷藕合器件(CCD)照相採集以及普通光學掃描儀掃描記錄晶片上的信息。如圖3為肺癌p53突變檢測的納米探針晶片用於肺癌組織樣品檢測雜交後普通掃描儀掃描結果。參照圖1示意圖納米金標記的探針與晶片上的捕捉探針以及靶基因組DNA直接雜交後，用銀染增強的方法，銀顆粒與納米金結合形成可見的銀沉積層，圖2是CCD拍照的納米探針晶片雜交結果。圖3是一個肺癌組織樣品經過抽提取後，用p53突變檢測的納米探針晶片檢測後普通光學掃描儀掃描後的結果，顯示肺癌樣品中179胺基酸位點突變被納米晶片檢測出來(鹼基C變成了T)，經過測序對比，晶片的檢測結果和測序的結果完全一致。權利要求1、一種基於納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基變突變得方法，其特徵在於未標記的靶核酸序列以及納米金標記的信號探針與固相支持物連接的捕獲探針進行夾心雜交，並通過銀染增強液使信號放大進行檢測；所述的方法包括探針的設計和製備、待測樣品的處理和納米探針晶片的製備、雜交和檢測三部分，具體為A.探針的設計和納米探針晶片的製備①根據肺癌中P53基因5-8外顯子中常見突變信息設計相應探針，其中每個SNP位點至少有兩個探針，即一個野生型，一個突變型；每個SNP位點設計儘量位於探針的中間，鹼基長度為16-25bp，固定在修飾好的玻片上，探針的5』末端需加16個長度T的連接臂和氨基修飾；根據臨近SNP位點的靶DNA序列設計帶有巰基的信號探針，鹼基數不超過40bp，TM值溫度相等；②納米晶片的製作將氨基修飾的捕捉探針通過晶片點樣儀點在醛基修飾的玻片上，37℃度固定，製備P53基因突變檢測晶片；B.待測樣品的處理和納米探針晶片的製備①待測樣品的處理通過蛋白酶K消化法、快速高鹽提取法、CTAB法或SDS裂解法方法抽提基因組DNA，然後將基因組DNA降解成500-1000bp的片段；②用金納米顆粒標記帶有巰基修飾的信號探針；納米探針的標記方法為15nm或30nm的納米金200μl加巰基的寡核苷酸探針100umol/L，11μl，室溫下放置24小時，然後2MNaCl和1×PB加入到所述的混合液中，使其濃度達到0.075M。2小時後繼續加入NaCl，並調整NaCl濃度到0.1M。繼續放置84小時後，納米顆粒通過12000rpm離心進行分離；C.雜交和檢測①標記了納米金的探針與晶片上的捕捉探針以及靶DNA的兩步連續的雜交；所述的納米探針晶片的第一步雜交是取步驟B中①降解成500-1000bp的基因組DNA5μl加10μl雜交液混合，滴於晶片陣列處，蓋上蓋玻片，置於50℃雜交箱中半個小時，使DNA樣品與晶片上的特異性捕捉探針結合；然後室溫下取出晶片，在0.5M的NaNO3中洗30秒；第二步雜交是將納米金標記的探針2μl與10μl的雜交液混合後添加在陣列處，50℃雜交箱中雜交20-30分鐘，然後0.5M的NaNO3中清洗三次；②檢測方法是通過銀染顯色的方法，利用銀染增強液試劑的氧化還原反應中形成的銀顆粒聚集在納米金上，而使雜交信號放大，所述的銀染顯色方法是在晶片陣列處加上新配製的銀增強液，蓋上蓋玻片，37℃反應15分鐘，結束後去掉蓋片，超純水清洗且氮氣吹乾；使用光學顯微鏡觀察或者電荷藕合CCD器件照相採集以及普通光學掃描儀掃描記錄晶片上的信息。2、按權利要求1所述的基於納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基變突變的方法，其特徵在於根據P53基因DNA序列信息設計的探針為探針編號(Number)探針位置探針序列(sequencefrom5'to3')tableseeoriginaldocumentpage33、按權利要求1所述的基於納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基變突變的方法，其特徵在於所述的納米探針晶片的短陣為cA:l-Cl~8Dl~8numberprobenamenumberprobenameoCI157wtDl157mut:陽性內C2158wtD2158mutC3171wtD3171mut參照探C4175wtD4175mutC5179wtD5179mut華C6245wtD6245mutC7248wtD7248mutC8273wtD8273mutC9298wtD9298mutC10陰性內參照探針D10陰性內參照探針4、按權利要求3所述的基於納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基變突變的方法，其特徵在於陽性內參照和陰性內參照的之間只差一個鹼基。5、按權利要求1所述的基於納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基變突變的方法，其特徵在於第一步雜交使用的基因組濃度為100ng/Vl。6、按權利要求1所述的基於納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基變突變的方法，其特徵在於第二步雜交後用O.5M的NaN03清洗時，每次30秒。7、按權利要求1所述的基於納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基變突變的方法，其特徵在於銀染增強液組成為1%明膠6(^12.55g檸檬酸/2.35g;檸檬酸三鈉/10mlH20;lOpl1.7g氫醌/30mlH20，30^10.5gAgNO32mlH20;1.2^1。8、按權利要求1所述的基於納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基變突變的方法，其特徵在於步驟B中①所述的抽提基因組DNA降解成500—1000bp是通過超聲波或限制性內切酶切斷DNA的方法實施的。全文摘要本發明涉及的是一種基於納米探針直接檢測肺癌樣品中p53基因突變的方法，其特徵在於未標記的靶核酸序列以及納米金標記的信號探針與固相支持物連接的捕獲探針進行的夾心雜交，並通過銀染增強的納米金信號放大效應產生高靈敏的識別信號。該方法能夠檢測未擴增的基因組DNA樣品中的單鹼基突變。與傳統的基於螢光信號檢測的方法相比，本發明提供的納米晶片檢測方法大大提高了檢測的靈敏度和特異性，並可通過普通的光學掃描儀或者普通的電荷藕合器件(CCD)數位照相機就可以對雜交信號進行採集和分析，也可通過相關軟體進行分析，得出檢驗報告。文檔編號C12Q1/68GK101392286SQ20071017061公開日2009年3月25日申請日期2007年11月19日優先權日2007年11月19日發明者毛紅菊,賈春平,趙建龍,金慶輝申請人:中國科學院上海微系統與信息技術研究所