一種新的馬爾尼菲青黴菌PPIaseI、其編碼序列及其應用的製作方法

2023-05-18 09:00:21 2

專利名稱：一種新的馬爾尼菲青黴菌PPIase I、其編碼序列及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子免疫學、分子生物學、生物信息學和基因工程等領域，具體地，本發明涉及一種馬爾尼菲青黴菌(Penicillium marneffei)肽脯氨醯順反異構酶I(peptidyl prolyl cis-trans isomerase，PPIase I)及其編碼序列。本發明還提供了該肽脯氨醯順反異構酶I及其核酸序列的製備方法和應用。
背景技術：
真菌基因組研究始於二十世紀九十年代，第一個完成全基因組測序的真菌是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，Goffeau et al.1996)。在過去的幾年裡，FGI(Fungal Genome Initiative)委員會從150多萬種真菌中，選取了15個在醫藥和工農業中具有重要價值的物種進行了基因組學的研究。2003年6月，FGI委員會新增了44個物種，其中包括了馬爾尼菲青黴菌。
馬爾尼菲青黴菌(Penicillium marneffei，PM)是Capponi等首先於1956年在越南從一隻中華竹鼠的肝臟分離出來的一種青黴，以其研究所主任Marneffei的名字命名。但此後並沒有引起人們的注意。1973年Disalvo在美國南卡首次發現人自然感染的病例，患者是一位曾在東南亞旅行過的傳教士。
1964年鄧卓霖在廣西一土生農民身上發現此菌，但當時全世界都還沒有此病報導，故將其認定為莢膜組織胞漿菌。1984年鄧卓霖在國內首例報導了一例馬爾尼菲青黴病。
從1984年到1987年，廣西醫科大學病理科收集的19全身播散型病例中，有4例發現有導致免疫缺陷的疾病，如淋巴瘤，白血病，先天性胸腺發育不良，SLE(系統性紅斑斕創)，TB(結核)等。1999年，鄧卓霖首先發現了國內第一例合併AIDS的患者。近幾年國內新發現的病例中，合併AIDS的患者越來越多。泰國至1998年已有1300例合併AIDS的患者。近年來發現70-80％的AIDS的患者後期感染上馬爾尼菲青黴菌。
馬爾尼菲青黴菌多呈條件致病菌，25℃呈絲狀真菌，為非致病菌；37℃呈酵母形態，為致病菌。它是一種深部致病真菌。它侵犯人體的單核巨噬系統，破壞人的免疫系統，使人體的免疫力下降。由於它在局部的機械破壞作用，以及代謝產物，毒素等作用，產生炎症反應，導致濃腫，肉芽腫等改變。並容易破壞血管進入血液循環，導致敗血症。進入人體的途徑一般是呼吸道或皮膚。
肽脯氨醯順反異構酶(PPIase I)廣泛分布於各種生物體及各種組織中，多數定位於胞漿，但也存在於大腸桿菌的外周質、紅色麵包黴的線粒體基質、酵母與果蠅和哺乳動物的內質網。PPIase I在蛋白質摺疊、輸送和相互作用過程中起著關鍵作用。PPIase I在細胞中的基本作用是通過非共價鍵方式，穩定扭曲的醯胺過度態，而催化肽基脯氨醯的順式與反式旋轉體的相互轉變。免疫抑制劑環孢黴素A(cyclosporin A，CsA)與FK506及那巴黴素(rapamycin)可與它們結合併抑制其催化活性。根據底物特異性分為兩類環孢黴素親和蛋白(Cyclosporin)和FK結合蛋白(FKBP)。結構研究表明，FKBP的催化活性位點與藥物結合位點是由芳香族胺基酸殘基構成的一個大空腔。在T細胞中，PPIase I還起抑制T淋巴細胞功能的生理作用。PPIase I不僅可以起到摺疊酶的催化作用，而且具有防止摺疊中間體聚集的類似分子伴侶的功能。在碳酸酐酶的摺疊中，PPIase I一方面在其早期中間體的形成過程中起分子伴侶的作用，防止不正確的聚集，另一方面在摺疊的較晚時期發揮摺疊酶的催化活性(Freskgard，1989)。

發明內容
本發明的目的在於提供一種新的馬爾尼菲青黴菌PPIase I、其編碼序列及該蛋白的應用。
本發明的上述目的是通過如下技術方案來實現的在本發明的一個方面，提供了一種來自馬爾尼菲青黴菌(Penicilliummarneffei)的分離的多核苷酸，其含有編碼馬爾尼菲青黴菌PPIase I的多核苷酸序列，所述多核苷酸選自a)與編碼含有SEQ ID NO.2的胺基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO.2的胺基酸序列至少70％同源性的胺基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續鹼基的多核苷酸。
較佳的，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
或者較佳的，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸42-530位的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡併範圍內相應於(i)序列的至少一個序列，或(iii)與互補於(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地(iv)(i)中中性功能的有義突變。
更佳的，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸42-530位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的多肽，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示胺基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。較佳的，所述多肽是含有SEQID NO.2所示胺基酸序列的多肽。
在本發明的再一方面，提供了一種載體，所述載體含上述分離出的多核苷酸。
在本發明的再一方面，提供了一種遺傳工程宿主細胞，所述宿主細胞是用上述載體轉化的宿主細胞。
本發明還提供了一種生產具有馬爾尼菲青黴菌PPIase I活性的多肽的方法，該方法包括如下步驟(I)將編碼具有PPIase I活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成抗原表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸42-530位的核苷酸序列有至少70％同源性；(II)將步驟(I)中的表達載體轉入宿主細胞，形成馬爾尼菲青黴菌PPIase I重組細胞；(III)在適合表達馬爾尼菲青黴菌PPIase I多肽的條件下，培養步驟(II)中的重組細胞；(IV)分離出具有PPIase I活性的多肽。
較佳的，上述生產具有馬爾尼菲青黴菌PPIase I活性的多肽的方法中，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸42-530位的核苷酸序列。
本發明還提供了一種抗體，所述抗體是能與上述馬爾尼菲青黴菌PPIase I特異性結合的抗體。
本發明還包括一種探針分子，該探針分子通常含有馬爾尼菲青黴菌PPIase I的核苷酸序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針分子可用於檢測樣品中是否存在編碼馬爾尼菲青黴菌PPIase I的核酸分子。
本發明還提供了含所述的多肽或其連續片段的藥物組合物。
本發明還提供了所述的多核苷酸、多肽及抗體在製備診斷和治療針對馬爾尼菲青黴菌引起的疾病的藥物及試劑盒中的應用。
本發明還提供了包含所述的多核苷酸、多肽或抗體或它們的連續片斷的試劑盒及生物晶片。
本發明還包括檢測馬爾尼菲青黴菌PPIase I的核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於馬爾尼菲青黴菌PPIase I的編碼序列，可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
根據本發明公開的馬爾尼菲青黴菌PPIase I及其基因，可以製備相關免疫抑制劑，並可為進一步開發針對該病菌引起的疾病的藥物提供重要的參考價值，同時，它們也可以作為這類疾病診治的潛在藥物靶點。
具體實施例方式
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA，或人工化學合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。單鏈的DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
在本發明中，「分離的」多核苷酸是指，該多核苷酸或片斷已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該多核苷酸或片斷已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
本發明中，術語「馬爾尼菲青黴菌PPIase I的編碼序列」是指編碼具有馬爾尼菲青黴菌PPIase I活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中42-530位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO.1序列的編碼框42-530位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.1中42-530位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術語還包括在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.1中從核苷酸42-530位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸42-530位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與馬爾尼菲青黴菌PPIase I相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，術語「馬爾尼菲青黴菌PPIase I」是指具有馬爾尼菲青黴菌PPIase I蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與馬爾尼菲青黴菌PPIase I相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括馬爾尼菲青黴菌PPIase I的活性片斷和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與馬爾尼菲青黴菌PPIase I的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗馬爾尼菲青黴菌PPIase I的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含馬爾尼菲青黴菌PPIase I或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還提供了馬爾尼菲青黴菌PPIase I的可溶性片段。通常，該片段具有馬爾尼菲青黴菌PPIase I多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸。
發明還提供馬爾尼菲青黴菌PPIase I的類似物。這些類似物與天然多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還可以包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞。
另一方面，本發明還包括對馬爾尼菲青黴菌PPIase I具有特異性的抗體，尤其是單克隆抗體。這裡「特異性」是指抗體能結合於馬爾尼菲青黴菌PPIase I或片段。較佳地，指那些能與馬爾尼菲青黴菌PPIase I或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制馬爾尼菲青黴菌PPIase I的分子，也包括那些並不影響PPIase I蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的PPIase I結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利NO.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的馬爾尼菲青黴菌PPIase I或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達馬爾尼菲青黴菌PPIase I或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hvbridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷馬爾尼菲青黴菌PPIase I的抗體以及不影響其功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用馬爾尼菲青黴菌PPIase I的片段或功能區，通過免疫技術獲得，這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與馬爾尼菲青黴菌PPIase I的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的馬爾尼菲青黴菌PPIase I核苷酸序列全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按己知方法製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列，這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。當然，也可通過先合成多個小片段，然後再進行連接而獲得序列很長的片段。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1馬爾尼菲青黴菌PPIase I基因的克隆1.總RNA分離(Totle RNA isolation)將馬爾尼菲青黴菌，在37℃或25℃培養後，離心棄上清取菌體，加入TRIzolReagents抽提其總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)，定量。
3.cDNA文庫的構建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，反轉錄酶作用下合成雙鏈cDNA。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉澱，無菌水溶解，連接至pDONRTM222(Invitrogen，Carlsbad，CA)載體，以CloneMinerTMcDNA Library Construction Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA)進行包裝，電擊轉化，宿主菌使用DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)細菌。塗板並測定滴度。
4.測序及資料庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴增後抽提質粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3』端和5』端的通用引物，採用終止物螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行EST大規模測序。測序結果用FACTURA軟體去除載體序列，傳輸到SUN Ultra 450Server上進行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟體包(Wisconsingroup，USA)中的BLAST和FASTA軟體搜索已有的資料庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低於95％的序列視為新基因建立資料庫。
5.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎上，進行cDNA全長克隆，分兩階段進行(1)「電子克隆」(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針搜尋dbEST資料庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達序列標籤(Expressed Sequence Tag，簡稱「EST」)序列認為同一序列(consensus sequence)，取出並用AUTOASSEMBLER軟體進行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟體分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和胺基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通常可獲取馬爾尼菲青黴菌PPIase I基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過「電子克隆」方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5』或3』端設計引物，在馬爾尼菲青黴菌cDNA文庫中進行長距離PCR反應。然後對PCR產物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟體分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重複上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對於5』和3』端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共資料庫或自身資料庫獲得，可考慮採用RT-PCR的方法。在序列5』端設計引物，3』端引物採用Oligo-dT，在馬爾尼菲青黴總RNA庫中進行擴增。然後對產物進行克隆、測序。最後拼接並獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的馬爾尼菲青黴菌PPIase I的全長編碼序列，即獲得SEQ ID NO.1所示的序列。
根據得到的全長cDNA序列推導出PPIase I的胺基酸序列，共162個胺基酸，其胺基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
實施例2馬爾尼菲青黴菌基因的序列信息與同源性分析
本發明新的馬爾尼菲青黴菌PPIase I基因的全長cDNA為588bp，詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位於42-530位核苷酸。根據全長cDNA推導出馬爾尼菲青黴菌PPIase I的胺基酸序列，共162個胺基酸殘基。詳細序列見SEQID NO.2。
將馬爾尼菲青黴菌PPIase I的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR資料庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現在胺基酸水平上，它與黑麴黴肽醯脯氨醯順反異構酶(PPIase I，SwissProt Accession No.Q8X191)的第1-158位胺基酸殘基有79％的相同性和86％的相似性。由上可見，馬爾尼菲青黴菌PPIase I基因與黑麴黴PPIase I基因在蛋白水平上存在較高的同源性，屬於同一家族並且兩者在功能上也有很高相似性。
本發明的馬爾尼菲青黴菌PPIase I除了可作為該家族一員用於進一步的功能研究，還可用於與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明的馬爾尼菲青黴菌PPIase I還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明的馬爾尼菲青黴菌PPIase I蛋白的N端與MP1蛋白的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明馬爾尼菲青黴菌PPIase I的抗體，用於篩選該家族的其他成員，或者用於親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
實施例3馬爾尼菲青黴菌PPIase I的結構和功能研究將馬爾尼菲青黴菌PPIase I的胺基酸序列在PROSITE資料庫(網址為http//expasy.hcuge.ch/sprot/scnpsitl.html)中檢索基序(motif)，得到以下結果在胺基酸序列中，存在以下功能基序(i)蛋白激酶C磷酸化位點(Protein kinase C phosphorylation site)26-28，80-82(ii)酪蛋白激酶II磷酸化位點(Casein kinase II phosphorylationsite)138-141(iii)N-豆蔻醯化位點(N-myristoylation site)134-139(iv)N糖基化位點(N-glycosylation site)99-102(v)肽脯氨醯順反異構酶位點1(CSA_PPIASE_1 Cyclophilin-typepeptidyl-prolyl cis-trans isomerase signature)39-56(vi)肽脯氨醯順反異構酶位點2(CSA_PPIASE_2 Cyclophilin-typepeptidyl-prolyl cis-trans isomerase domain)8-155而蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶II磷酸化位點、N-豆蔻醯化位點和N糖基化位點均與翻譯後修飾(post-translational modifications)有關，並且這些位點和肽脯氨醯順反異構酶位點1、2在藥物開發過程中起著關鍵作用，可作為治療由馬爾尼菲青黴菌引起的疾病的藥物的作用靶點。
實施例4馬爾尼菲青黴菌PPIase I基因的生長發育表達譜電子Northern表達譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation1997 Dec 16；96(12)4146-4203)，將馬爾尼菲青黴菌PPIase I cDNA序列在GCG軟體包中的dbEST資料庫中做BLAST檢索，在得到的EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST，可視為該基因在不同生長發育過程中的轉錄表達本，由此得出表達該基因的生長發育譜，揭示它在馬爾尼菲青黴菌不同發育階段中都發揮著重要作用。
實施例5馬爾尼菲青黴菌PPIase I的製備和提純在該實施例中，將全長的馬爾尼菲青黴菌PPIase I編碼序列或片斷構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
(1)原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據馬爾尼菲青黴菌PPIase I的全長編碼序列(SEQ ID NO.1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應於編碼序列5』和3』端的約20個以上核苷酸)，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pDESTTM17載體而定)，以便構建表達載體。將馬爾尼菲青黴菌PPIase I基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pDESTTM17載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑑定好的表達載體利用電擊轉化方法轉入大腸桿菌BL21，篩選鑑定得到含有pDESTTM17-PPIase I表達載體的工程菌BL21-pDESTTM17-PPIase I。
(2)表達GST-PPIase I重組蛋白的工程菌的分離鑑定挑取單菌落的BL21-pDESTTM17-PPIase I工程菌於3ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液於新的LB培養基(含100μg/ml氨苄青黴素)中培養約3小時，至OD600達0.5後，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續於37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉澱物中加入裂解液(2×SDS上樣緩衝液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉澱，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色後觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-PPIase I融合蛋白的工程菌。
(3)GST-PPIase I融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-PPIase I融合表達蛋白的工程菌BL21-pDESTTM17-PPIase I。誘導後的細菌離心沉澱，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％穀胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉澱結合了GST-PPIase I的穀胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉澱加入100μl PBS的量清洗兩次，而後按每毫升超聲液所得沉澱加入10μl還原型穀胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重複洗脫兩次。洗脫的上清保存於-80℃，並進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在18kDa處的蛋白質條帶即為馬爾尼菲青黴菌PPIase I蛋白。
實施例6馬爾尼菲青黴菌PPIase I在酵母中進行真核細胞表達1.馬爾尼菲青黴菌PPIase I酵母表達載體的構建及轉化根據馬爾尼菲青黴菌PPIase I的全長編碼序列(SEQ ID NO.1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。將馬爾尼菲青黴菌PPIase I的cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pYES2-DEST52載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑑定好的表達載體利用電擊轉化方法轉入酵母細胞DB3.1中，利用氨苄青黴素篩選鑑定得到含有pYES2-DEST52-PPIase I表達載體的工程菌DB3.1-pYES2-DEST52-PPIase I。
2.表達PPIase I重組蛋白的工程菌的分離鑑定挑取單菌落的DB3.1-pYES2-DEST52-PPIase I工程菌於3ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液於新的YPD培養基(含100μg/ml氨苄青黴素)中培養至OD600達0.5。取1ml菌液離心，在菌體沉澱物中加入裂解液(2×SDS上樣緩衝液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸菌體沉澱，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色後觀察預期分子量大小的蛋白量的菌株即為表達馬爾尼菲青黴菌PPIase I融合蛋白的工程菌。
收集轉化的細胞進行Western鑑定。將菌體裂解後進行SDS-PAGE電泳，電泳後的膠於Pharmacia的Multiphor II半乾電轉移儀中將蛋白質轉印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置於封閉液中封閉1小時，而後於抗馬爾尼菲青黴菌PPIase I的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而後將膜置於生物素標記的抗馬爾尼菲青黴菌PPIase I一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-鹼性磷酸酶複合物反應30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配製的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達馬爾尼菲青黴菌PPIase I的克隆。
3.馬爾尼菲青黴菌PPIase I的提取純化按上述方法誘導表達PPIase I的工程菌DB3.1-pYES2-DEST52-PPIase I。收集菌體沉澱，菌體沉澱加入PBS重懸菌體，超聲破碎菌體，離心，清洗幾次，進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在18kDa處的蛋白質條帶即為馬爾尼菲青黴菌PPIase I。
實施例7抗馬爾尼菲青黴菌PPIase I抗體的製備將實施例5和實施例6中獲得的馬爾尼菲青黴菌PPIase I用層析法進行分離後備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強免疫一次，3-5天後用於融合。然後製備飼養細胞，再進行細胞融合。
在細胞融合10-15天後，需逐孔進行檢查，一旦發現旺盛的雜交細胞集落生長，就應用馬爾尼菲青黴菌PPIase I做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫螢光試驗、發射免疫試驗(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔後，立刻進行克隆培養，並分離出抗體。
實施例8馬爾尼菲青黴菌PPIase I基因用於製備生物晶片用獲取的馬爾尼菲青黴菌PPIase I基因的核苷酸序列設計引物，擴增出全長的馬爾尼菲青黴菌PPIase I基因或該基因的部分片斷，用作生物晶片點樣的樣品。
用英國的BioRobotics自動點膜儀將樣品點在8×12cm尼龍膜上，每一標本點4個點，每點的DNA量約為10ng。陽性對照是重複4次點樣的人β-actin基因，陰性對照是重複4次點樣的λ噬菌體DNA。
含有馬爾尼菲青黴菌PPIase I基因的晶片可用於感染馬爾尼菲青黴菌疾病的診斷和藥物篩選。
序列表110上海人類基因組研究中心120一種新的馬爾尼菲青黴菌PPIase I、其編碼序列及其應用130NP-12521602170PatentIn version 3.22101211588212DNA213馬爾尼菲青黴菌(Penicillium marneffei)220
221CDS222(42)..(530)4001aagctataca acaccatttg aatatttaaa acgacgtaac c atg gct act gaa atc 56Met Ala Thr Glu Ile1 5gca att gac acg act atg ggt tct ttc gtg gtg gaa ctc tac aac gac 104Ala Ile Asp Thr Thr Met Gly Ser Phe Val Val Glu Leu Tyr Asn Asp10 15 20cac gcg cca aag act tgc aaa aac ttc gcg act ctc gcc cag aga gga 152His Ala Pro Lys Thr Cys Lys Asn Phe Ala Thr Leu Ala Gln Arg Gly25 30 35tac tac aat ggc gtc atc ttc cac cgc atc att ccc aat ttc atg atc 200Tyr Tyr Asn Gly Val Ile Phe His Arg Ile Ile Pro Asn Phe Met Ile40 45 50caa gga ggc gat cct act ggc acc gga cgt gga ggc agt tcg ata tac 248Gln Gly Gly Asp Pro Thr Gly Thr Gly Arg Gly Gly Ser Ser Ile Tyr55 60 65ggc gag aaa ttc gag gac gaa ata cac tct tca tta aaa cat act gga 296
Gly Glu Lys Phe Glu Asp Glu Ile His Ser Ser Leu Lys His Thr Gly70 75 80 85gct gga ata ttg agc atg gcc aac agc gga ccg aat acg aac gga agt344Ala Gly Ile Leu Ser Met Ala Asn Ser Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser90 95 100caa ttc ttc att act ctc gct cca acg cct tgg ctc gat ggg aaa cat392Gln Phe Phe Ile Thr Leu Ala Pro Thr Pro Trp Leu Asp Gly Lys His105 110 115acg ata ttc gga cgg ata aaa agc gga atg aga gtt att caa cgt atg440Thr Ile Phe Gly Arg Ile Lys Ser Gly Met Arg Val Ile Gln Arg Met120 125 130gga tta gtc aaa act gat gct gaa gat cga ccc cag gat ccg gtc aag488Gly Leu Val Lys Thr Asp Ala Glu Asp Arg Pro Gln Asp Pro Val Lys135 140 145att gtc aag gcg cga tta gtg gag gaa gcc gag gag aat tga530Ile Val Lys Ala Arg Leu Val Glu Glu Ala Glu Glu Asn150 155 160aaggatgctt ttgaagactg aaaaagatag aacaacgggg ggtaatgagc tctggcac5882102211162212PRT213馬爾尼菲青黴菌(Penicillium marneffei)4002Met Ala Thr Glu Ile Ala Ile Asp Thr Thr Met Gly Ser Phe Val Val1 5 10 15Glu Leu Tyr Asn Asp His Ala Pro Lys Thr Cys Lys Asn Phe Ala Thr20 25 30Leu Ala Gln Arg Gly Tyr Tyr Asn Gly Val Ile Phe His Arg Ile Ile35 40 45
Pro Asn Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Pro Thr Gly Thr Gly Arg Gly50 55 60Gly Ser Ser Ile Tyr Gly Glu Lys Phe Glu Asp Glu Ile His Ser Ser65 70 75 80Leu Lys His Thr Gly Ala Gly Ile Leu Ser Met Ala Asn Ser Gly Pro85 90 95Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile Thr Leu Ala Pro Thr Pro Trp100 105 110Leu Asp Gly Lys His Thr Ile Phe Gly Arg Ile Lys Ser Gly Met Arg115 120 125Val Ile Gln Arg Met Gly Leu Val Lys Thr Asp Ala Glu Asp Arg Pro130 135 140Gln Asp Pro Val Lys Ile Val Lys Ala Arg Leu Val Glu Glu Ala Glu145 150 155 160Glu Asn
權利要求
1.一種來自馬爾尼菲青黴菌(Penicillium marneffei)的分離的多核苷酸，其含有編碼肽脯氨醯順反異構酶I的多核苷酸序列，所述多核苷酸選自a)與編碼含有SEQ ID NO.2的胺基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO.2的胺基酸序列至少70％同源性的胺基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續鹼基的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的一種分離的多核苷酸，其特徵在於，所述的多核苷酸編碼—多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權利要求1所述的一種分離的多核苷酸，其特徵在於，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸42-530位的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡併範圍內相應於(i)序列的至少一個序列，或(iii)與互補於(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地(iv)(i)中中性功能的有義突變。
4.如權利要求3所述的一種分離的多核苷酸，其特徵在於，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸42-530位的核苷酸序列。
5.一種分離的多肽，其特徵在於，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示胺基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。
6.如權利要求5所述的一種分離的多肽，其特徵在於，所述多肽是含有SEQID NO.2所示胺基酸序列的多肽。
7.一種載體，其特徵在於，所述載體含有權利要求1所述的分離的多核苷酸。
8.一種遺傳工程宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞是用權利要求7所述載體轉化的宿主細胞。
9.一種生產具有肽脯氨醯順反異構酶I活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟(I)將編碼具有肽脯氨醯順反異構酶I活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸42-530位的核苷酸序列有至少70％同源性；(II)將步驟(I)中的表達載體轉入宿主細胞，形成肽脯氨醯順反異構酶I重組細胞；(III)在適合表達肽脯氨醯順反異構酶I多肽的條件下，培養步驟(II)中的重組細胞；(IV)分離出具有肽脯氨醯順反異構酶I活性的多肽。
10.如權利要求9所述的一種生產具有肽脯氨醯順反異構酶I活性的多肽的方法，其特徵在於，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸42-530位的核苷酸序列。
11.一種抗體，其特徵在於，所述抗體是能與權利要求5或6所述的多肽特異性結合的抗體。
12.一種探針分子，其特徵在於，所述的探針分子含有權利要求1所述的多核苷酸中8-100個連續的核苷酸。
13.權利要求5或6的多肽在製備治療針對馬爾尼菲青黴菌引起的疾病的藥物中的應用。
14.含有權利要求5或6的多肽的藥物組合物。
15.一種用於診斷和治療針對馬爾尼菲青黴菌引起的疾病的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包含權利要求1～4中任一種多核苷酸序列或其連續片段，或者所述試劑盒包含權利要求5或6的多肽或其連續片段，或者所述試劑盒包含權利要求11的抗體。
16.一種生物晶片，其特徵在於所述生物晶片的載體上含有權利要求1～4中任一種多核苷酸序列或其連續片段，或者所述生物晶片的載體上含有權利要求5或6的多肽或其連續片段，或者所述生物晶片的載體上包含權利要求11的抗體。
全文摘要
本發明提供了一種在馬爾尼菲青黴菌(Penicillium marneffei)胞漿中表達的新的馬爾尼菲青黴菌肽脯氨醯順反異構酶I(PPIase I)及其編碼序列，本發明還提供了該肽脯氨醯順反異構酶I(PPIase I)及其核酸的製備方法及其應用。根據本發明公開的馬爾尼菲青黴菌PPIase I及其基因，可以製備相關免疫抑制劑，並可為進一步開發針對該病菌引起的疾病的藥物提供重要的參考價值，同時，它們也可以作為這類疾病診治的潛在藥物靶點。
文檔編號C12N15/61GK1676610SQ200410017299
公開日2005年10月5日 申請日期2004年3月30日 優先權日2004年3月30日
發明者任雙喜, 湯生榮, 卜雲萍, 殷世亮, 嚴中華, 施煒亮, 李運千, 武金煒, 盧凌峰, 張丕燕, 錢震 申請人:上海人類基因組研究中心