一種用於製備siRNA的氟代寡核苷酸的合成方法
2023-05-18 06:05:41 1
專利名稱：一種用於製備siRNA的氟代寡核苷酸的合成方法
技術領域：
本發明屬於生物有機合成技術領域，涉及用於製備siRNA的氟代寡核 苷酸(FANA)的生物有機合成方法。
背景技術：
腫瘤是威脅人類健康的重大疾病。它的形成是由多基因突變累積與相互作用形成
導致的。從1998年發展起來的RNA幹擾技術，是由siRNA介導的高度特異的轉錄後基
因沉默效應，具有高效性，特異性的特點(Andrew Fire， et al. Nature, 1998,391:
806-811)。現己發展成為一種成熟的抑制靶基因表達的有力工具，尤其是對於由基因轉
錄水平增加而導致的基因過度表達是一種強有力的抑制手段(Xia Haibin， et al.
Nature, 2002， 20:1006-1010)。 RNA千擾應用於腫瘤治療目前主要的障礙是轉運途徑
的問題，目前解決這個問題的最有效的途徑有兩個1、化學修飾siRNA，使其具備更
好的核糖核酸酶抗性，從而提高其生物穩定性，增加其生物利用度；2、應用病毒載體
表達shRNA，從而使被感染細胞內能夠較為容易的表達shRNA。其它的如脂質體等轉染
試劑幫助siRNA或shRNA表達載體轉運也是很有希望的途徑(Arndt B. Cancer cell,
2002, 2(3): 167-168)。 siRNA在體內環境的生物穩定性很差。實驗表明，沒有經過修
飾的siRNA在血清中的半衰期小於15分鐘，這極大的限制了 si脂A在臨床治療中的應
用。為解決該項技術的缺陷，目前研究已經證實，經過化學修飾後的siRNA能在保留原
有生物活性的基礎之上，進一歩提高體內的穩定性，其在血清中的半衰期可以增加數十
倍，具備了臨床治療應用的潛力(ElbashirSM, et al.Nature. 2001; 411: 494-498)。
文獻報導的化學修飾副A方法較多，主要分為核糖核酸的末端和化學基團修飾、核苷酸
的骨架修飾或2' -、 4'-位修飾、鹼基修飾、組合修飾等等。硫代磷酸的修飾是第一
代的核酸修飾方法，其產物抗核酸酶解能力較強，但是有較大的非特異毒性。核糖的2
位羥基的烷基修飾是第二代的核酸修飾法，其重要代表是2' -0-methyl (OMe)和
2， -0-methoxy-ethyl (MOE) RNA。其產物在性能上雖有一定改善，但非特異毒性依然
存在。在這個基礎上，發展了許多各式各樣的修飾方法，主要有P印tide nucleic acids
(PNAs)、 N3， -P5， phosphoroamidates (NPs)、 ' -Deoxy-2， -fluaro-b-D-arabino nucleic acid (FANA)、 Locked nucleic acid (LNA)、 Morpholinooligonucleotides (MF)、 Cyclohexene nucleic acids (CeNA)、 Tricyclo-DNA (tcDNA)等方法，稱之為第三代的核酸修飾法(Xiaolan Chen, et al .Drug discovery todaytargets, 2005,10 (8): 587-593)。
FANA(2' -Deoxy-2， -fluoro-b-D-arabino nucleic acid， 2'-脫氧-2，-氟-b-D-
阿拉伯糖核苷酸)修飾的RNA是指由FANA替代核糖組成寡核苷酸的骨架形成的RNA類似物。
近幾年的文獻已證實，FANA修飾是極少數的能夠增強siRNA血清中半衰期的同時還能增強siRNA的活性的方法之一 (Chiu YL , et al . RNA, 2003， 9 (9) : 1034 1048)。但目前尚未見到該方法修飾的siRNA應用於腫瘤治療的報導。採用FANA修飾法對siRNA進行恰當的修飾，既能保留甚至增強其生物學活性，又能顯著增加其生物學穩定性，是一種很有前景的siRNA修飾方案。本發明提供了一種用於製備siRNA的氟代寡核苷酸的合成方法。
發明內容
本發明通過下述方法實現的本發明涉及用於製備si脂A的氟代寡核苷酸(FANA)的合成方法如下
① 以1-乙醯基-2， 3， 5-三-0-苯甲醯基-{3-D-呋喃核糖為原料，二氯甲烷為溶劑，在酸性條件下，經重排反應，製備獲得，以l， 3， 5-三-0-苯甲醯基-2-羥基-13-D-呋喃核糖，收率約70%。
② 經三氟甲基磺酸酯取代活化，通過親核取代(SN2)反應，利用氟化試劑進行氟代反應，獲得關鍵中間體2-脫氧-2-氟-1， 3， 5-三-0-苯甲醯-e-D-阿拉伯糖。
③ 在氫溴酸乙酸的條件下，溴代反應製備1-溴-2-脫氧-2-氟-3， 5-二-0-苯甲醯-e-D-阿拉伯糖。
採用修飾好的鹼基或未經修飾的鹼基與1-溴-2-脫氧-2-氟-3，5-二-0-苯甲醯-e-D-阿拉伯糖進行氮垸基取代反應，通過水解製備獲得系列FANA核苷酸單體。
具體實施例方式
下面結合具體的實施例'對本發明作進一歩的闡述，但不限於這些具體的實施例，兩所有的實施例均按上述的操作歩驟操作。
(1) 〗，3， 5-三-0-苯甲醯基-2--羥基-f)-呋喃核糖的製備
將20g的卜乙醯基 2， 3， 5-三-0-苯甲醯基--e-!)-呋喃核糖(40卿o1)溶於二氯甲烷8(ki，加入乙醯氯3rai， 0-5"通入千燥氯化氫攪拌2 h，冰箱靜賈i2h。減壓濃縮至幹，剩餘油狀物溶於乙腈30ml，滴加水5m]，冰水浴條件下攪拌，0匸放置2h後，抽濾，濾餅用冰乙醚20rol洗滌，乾燥，得到的白色固體16g，溶於乙酸乙酯iOOnd，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌2次，無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液濃縮至幹，得白色固體i2 g，卿140-142°C。W,R (DMS， 400,z) : 6 7,4-8. 1 (m， 15H), 6.3 (s,lH), 5.8(m, 1H)， 5.7(d,4, 8(m, iH), 4. 6-4. 7 (dd, 1H), 4. 4-'4. 5 (dd, 1H)
(2) i， 3， 5-三-0~苯甲醯基-2-氟H-呋喃核糖的製備
將12 g的1， 3， 5-三-0-苯甲醯基-2-羥基-D-呋喃核糖溶於二氯甲垸200ml中，-2(TC滴加7 g硫醯氯，(HTC加入10m]的D,，反應3 h，分批加入咪咪^g，攪拌4 h 。反應液傾入冰水中，i00ml的二氯甲垸提取3次，合併有機相'飽和鹽水洗2次'無水硫酸鎂千燥，過濾，濾液蒸除溶劑，剩餘油狀物加至異丙醇25ml中，加入石油醚50ml，靜置析晶，濾餅用異丙醇與石油醚混合液洗滌'烘千，得白色粉末狀固體iO. 5g， mpl29-13rC。將10. 5g的1， 3， 5-三-0-苯甲醯基-2-咪唑磺醯基-D-呋喃核糖溶於100ml的乙酸乙酯，加入13. 5g的37%的氫氟酸三乙胺溶液，8(TC攪拌3 h， TLC[展丌劑丙酮石油醚(1:5)]顯示原料全部轉化完全，加入10ml三乙胺，繼續反應3h。停止加熱，自然冷卻至室溫，反應液倒入冰水(200ml )中，加入碳酸氫鈉調至中性，乙酸乙酯40m]ml提取3次，合併有機相，飽和鹽水洗滌2次，無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液濃縮，得7.2g油狀物，加入乙醇與水的混合液中重結品，得3.7g的白色固體物。(注油狀物也可以直接投入下歩反應)。'HNMR (DMSO' 400MHz) : S 7.4-8.2 (m， 15 H)， 6.5(d， 1 H) ， 5.7 (d， 1H), 5.5 (d， 1H)，4. 7 (m, 1H) ， 4.6-4. 5 (m, 2H)
(3) 1-溴-2-脫氧-2-氟-3， 5-二--0-苯甲醯基-e-D-呋喃核糖的製備
5g的1，3，5-三-0-苯甲醯基-2-氟-13 -D-呋喃核糖溶於50ml的二氯甲垸中，加入40%朋r的乙酸溶液10ml，室溫攪拌8h，迅速加入飽和碳酸氫鈉溶液，調至中性，二氯甲烷提取2次，合併有機相，飽和碳酸氫鈉溶液洗滌1次，無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液濃縮至幹，得油狀約4.7 g，可直接用於下歩反應。
(4) 1- (3， 5-二一0-苯甲醯基-2-脫氧-2-氟-f5-D-呋喃核糖基)尿嘧啶
將2g的尿嘧咬，4mg的硫酸銨，以及10ml的六甲基二氮矽垸，加入100ml的反應瓶中，通氮氣保護，加熱回流2h，減壓蒸出過量的六甲基二氮矽烷，得白色固體物，加入50ml氯仿，加入8. lg的1-溴-2-脫氧-2-氟-3， 5-二--0-苯甲醯基-0-D-呋喃核糖與25ml的氯仿溶液，回流反應8h，冷卻，加入飽和的碳酸鈉水溶液，硅藻土過濾，濾餅用氯仿洗3次，減壓濃縮至盡得白色固體，加入10ml的甲醇回流1 h ，冷卻，過濾，得白色固體2. 5g。'HNMR (DMSO, 400MHz): S 8.1 (d， 2H) ， 7. 9(d， 2H), 7. 5-7. 7 (m， 8H, Ar H) ， 6.4 (dd，1H), 5.4—5.7 (m， 3H) ， 4. 7(m, 1H)， 4.6 (m， 1H)
(5) 2'-脫氧-2， -氟-e-D-阿拉伯糖尿嘧咬
將2. 5g的1-(3， 5-二一0-苯甲醯基-2-脫氧-2-氟-P -D-呋喃核糖基)尿嘧啶加入30ml的甲醇中，通入氨氣，攪拌48h，減壓濃縮至盡，矽膠柱分離(展丌劑乙酸乙酯乙醇=1:2)，得白色固體1.3g。
'HNMR (DMSO， 400MHz) : S 7. 4--7. 5 (dd, 2H)， 6. 3(dd，lH)' 5. 2(m，lH), 4.4 (m, 1 H),4. 0-3. 8 (m， 3 H)
(6) 2' _脫氧-2，-氟-5- 0- (4-甲氧基三苯基甲基)-e-D-阿拉伯糖尿嘧啶
將lg的2'-脫氧-2'-氟-P-D-阿拉伯糖尿嘧啶加入20ml乾燥的吡啶中，加入1.5g的三苯基甲基氯，室溫攪拌10h， TLC跟蹤，再加入0.5g的三苯基甲基氯，室溫攪拌5h，減壓濃縮至盡，矽膠柱分離得白色膠狀固體1.3g。
'HNMR (DMSO， 400MHz): S 7.6 (d， 2H) ， 6.9-7.5 (m， 14H)， 6.1 (dd，lH)， 5.9 (d， 1H)，5. 4(d, 1H), 4.9—5.1 (m, 1H) ， 4. 0—4. 2 (m， 2H)' 3. 7 (s， 6H) ， 2.9 (m， 2H)
(7) l-(3-0-(e-氰基乙基-N，N-二異丙基磷醯基)-2'-脫氧-2'-氟-5- 0- (4-甲氧基三苯基甲基)-e-D-阿拉伯糖尿嘧啶
將1.3g的2'-脫氧-2' _氟-5- 0- (4-甲氧基三苯基甲基)-0-D-阿拉伯糖尿嘧啶粗品溶解於10ml的二氯甲烷中，加入0.5g的無水二異丙氨基咪唑鹽，室溫攪拌1h，通氮氣的條件下，加入2ml的2-氰基乙基-N,N,N' , N'-四異丙亞磷醯胺試劑，室溫攪拌24h，矽膠柱分離得白色膠狀固體1. lg。
'HNMR (DMS0， 400MHz): 5 11.5 (s， 1H) ， 7.6 (d， 1H)， 6.9-7.5 (m， 14H)， 6.2 (dd，lH)，5,5 (d' 1H)， 5. 2-5. 4(dd， 1H), 4.4 (m， 1H)，4. 0 (m， 1H) ， 3. 7 (s， 6H) ， 3.6(m， 2H) ，3. 5(m,2H), 2.8(t, 2H) ，l.l(d, 6H), 0.9 (d, 6H)FAB-MS: C39H46FN408P:767. 5
(8) 2'-脫氧-2'-氟-e-D-阿拉伯糖腺嘌呤
將lg的腺嘌呤，1. 5mg的硫酸銨，以及10ml的六甲基二氮矽烷，加入100ml的反應瓶中，通氮氣保護，加熱回流2h，減壓蒸出過量的六甲基二氮矽烷，得白色固體物，加入50ml氯仿，加入2.2g的1-溴-2-脫氧-2-氟-3， 5-二一0-苯甲醯基-P-D-呋喃核糖與25ra丄的氯仿溶液，回流反應8 h，冷卻，加入飽和的碳酸鈉水溶液，硅藻土過濾，濾餅用氯仿洗3次，減壓濃縮至盡得油壯物，矽膠柱分離得白色固體0.5g。加入甲醇20ml中，加入甲醇鈉0. 5g， 3CTC反應2h。冷卻至室溫，用稀鹽酸調至p服-7，減壓濃縮至盡，加入甲醇20ral，過濾，濾餅用冰甲醇洗滌，減壓濃縮至盡，矽膠柱分離得白色固體0.3g。'麗MR (DMS0， 400MHz) : S 8. 1 (d， 1H) ， 7. 9 (s， 1H) ， 7. 8 (2H), 6. 2 (dd， 1H), 5. 1 (m, 1H) ， 4.5(m， 1 H), 4.0 (m， 1 H), 3. 9 (m, 1H) ， 3. 6—3. 7 (m， 2H)。
(9) 2，-脫氧-2' _氟-5- 0- (4-甲氧基三苯基甲基)-e-D-阿拉伯糖腺嘌呤
將0. 25g的2'-脫氧-2'-氟-0 -D-阿拉伯糖腺嘌呤加入20ml乾燥的吡啶中，加入1. g的三苯基甲基氯，室溫攪拌4h， TLC跟蹤，再加入0.2g的三苯基甲基氯，室溫攪拌5h，減壓濃縮至盡，矽膠柱分離得白色固體約0.2g。
'HNMR (DMSO, 400MHz): S 8.2 (ra， 2H), 7.6-6.9 (m, 14H)， 6.3(dd，lH)， 5.4 (d， 1H)，5.2 (m， 1H)， 5.0 (m, 1H), 4.4 (m， 1H) ， 3.8 (s， 6H) ， 3.0 (m， 2H)。
(10) 1-(3-0-(0-氰基乙基-N，N-二異丙基磷醯基)-2'-脫氧-2，-氟-5-O- (4-甲氧基三苯基甲基)-{3-D-阿拉伯糖腺嘌呤
將0.2g的2'-脫氧-2，-氟-5- 0- (4-甲氧基三苯基甲基)-e-D-阿拉伯糖腺嘌呤粗品溶解於10ml的二氯甲烷中，加入O. 15g的無水二異丙氨基咪唑鹽，室溫攪拌lh，通氮氣的條件下，加入O. 5ml的2-氰基乙基-N，N,N' ,N'-四異丙亞磷醯胺試劑，室溫攪拌24h，矽膠柱分離得白色膠狀固體0. lg。
'H畫R (DMS0， 400MHz): S 11.4(s，lH)， 8.2 (m, 2H), 7.0-7.5 (m, 14H)， 6.2 (dd, 1H),5.5 (d， 1H)， 5. 2-5. 4(dd， 1H), 4.4 (m， 1H),4, 0 (m， 1H)，3. 7 (s, 6H) ， 3, 6(m， 2H) ，3.5(m，2H)， 2.8(t， 2H) ，1. l(d， 6H)， 0.9(d, 6H).
權利要求
1、本發明涉及用於製備siRNA的氟代寡核苷酸(FANA)的合成，其特徵在於以1-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基β-D-呋喃核糖為原料，經氟代和溴化反應合成1-溴-2-脫氧-2-氟-3，5-二O-苯甲醯-α-D-阿拉伯糖，用鹼基或特定修飾的鹼基與1-溴-2-脫氧-2-氟-3，5-二-O-苯甲醯-α-D-阿拉伯糖通過親核取代(SN2)反應，再水解製備得到系列2′-FANA類核苷酸。
2、 按照權利要求1所述，其特徵在於以1-乙醯基-2， 3， 5-三-O-苯甲醯基-{3-D-呋喃核糖為原料， 二氯甲垸為溶劑，在酸性條件下，經重排反應，獲得，以l， 3， 5-三-0-苯甲醯基-2-羥基-13-D-呋喃核糖。
3、 按照權利要求1所述，其特徵在於經三氟甲基磺酸酯取代活化，通過親核取代(SN2)反應， 利用氟化試劑進行氟代反應，獲得2-脫氧-2-氟-1， 3， 5-三-0-苯甲醯-D-阿拉伯糖。
4、 按照權利要求l所述，其特徵在於在氫溴酸的乙酸溶液條件下，溴代反應製備-溴-2-脫氧-2-氟-3， 5-二-O-苯甲醯-e-D-阿拉伯糖。
5、 按照權利要求1所述，其特徵在於採用修飾好的鹼基或未經修飾的鹼基與1-溴-2-脫氧-2-氟-3， 5-二-0-苯甲醯-e -D-阿拉伯糖進行氮烷基取代反應，再通過水解製備獲得2' -FANA類核苷酸。
全文摘要
本發明涉及用於製備siRNA的氟代寡核苷酸(FANA)的合成，其特徵在於以1-乙醯基2，3，5-三O-苯甲醯基-β-D-呋喃核糖為原料，經氟代和溴化反應得到1-溴-2-脫氧-2氟-3，5-二-O-苯甲醯-α-D-阿拉伯糖，用鹼基或特定修飾的鹼基與1-溴-2-脫氧2-氟-3，5-二-O-苯甲醯-α-D-阿拉伯糖通過親核取代(SN2)反應，再水解製備得到系列2′-FANA類核苷酸衍生物。該合成工藝路線具有原料易得和產率較高的特點，利用2′-FANA類核苷酸，可以用於製備系列siRNA。
文檔編號C07H1/02GK101531695SQ200910024898
公開日2009年9月16日 申請日期2009年3月2日 優先權日2009年3月2日
發明者丁慶燚, 飛 周, 曼 徐, 方傳玲, 海 楊, 王友志, 王聖良, 王玉成, 王理想, 瞿志榮, 曉 胡, 玲 胡, 胡丹紅, 胡曼曼, 紅 趙 申請人:徐州瑞賽科技實業有限公司