一種異硫鏈黴菌及其應用的製作方法
2023-05-18 12:04:16 2
一種異硫鏈黴菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種異硫鏈黴菌及其應用，該菌株為異硫鏈黴菌（ Streptomyces althioticus ）LMZY，已於2014年3月28日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCCM2014110。本發明所選育的菌株可利用農業廢棄物後高產木聚糖酶，有效解決農業廢棄物的再生利用，降低生產成本，減少環境汙染，提高產品附加價值。CCTCC NO: M 20141102014.03.28
【專利說明】一種異硫鏈黴菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物【技術領域】，具體而言，涉及一株利用玉米芯粉產木聚糖酶能力較強的異硫鏈黴菌lstreptomyces alth1ticus)及其應用。
[0002]
【背景技術】
[0003]半纖維素是繼纖維素以外第二大再生資源，廣泛地存在於木材、禾本科植物、農作物廢棄物之中。木聚糖作為植物半纖維素的重要組分，約佔植物總糖的三分之一，其主要成分為D-2木糖(是一種能夠被微生物細胞轉化成為單細胞蛋白質和能量來源的五碳糖)。
[0004]木聚糖酶是指可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括內切β-1，4-木聚糖酶、外切β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶等，其中內切β-1，4-木聚糖酶為關鍵酶。作為新型的紙漿漂白助劑，木聚糖酶能降低漂白氯的用量，降低了造紙工業中的環境汙染問題；在食品工業，木聚糖酶處在小麥麵粉的改良和提高果蔬汁有效成分浸出率外，其降解形成的功能性低木聚糖有顯著的雙歧桿菌增殖能力，不被消化特性，無齲齒性，促進人體對鈣的吸收等多種良好的生理學特性作為飼用酶製劑，木聚糖酶可以有效解除木聚糖的抗營養性，促進畜禽對粗飼料的消化吸收，同時添加木聚糖酶還可以減少畜禽腸道疾病，增進畜禽健康，使畜禽體重均勻，減少粘糞，降低空氣中氨氣和硫化物濃度；木聚糖酶能水解植物中的半纖維素，所形成的戊糖可以進一步用於生產木糖醇、酒精、有機酸等產品，在可再生資源生物轉化利用中具有重要作用。因此，木聚糖酶在造紙、食品、飼料、紡織、醫藥及能源等領域有著廣泛的應用。
[0005]木聚糖酶的種類繁多且廣泛存在於海洋及陸地，但因為獲得難易程度及純度的原因，當前商用木聚糖酶仍主要依靠微生物發酵製得。已報導產木聚糖酶的微生物主要有細菌、放線菌、真菌、麴黴、木黴等。而國內外研究和應用最多的是細菌、麴黴、木黴所產的木聚糖酶，如:朱啟忠等報導用麥草提取的半纖維素誘導鏈黴菌Strs-2，產酶活力小於50U/ml ;也有研究者直接用農業廢棄物誘導菌株產生木聚糖酶，但產酶水平普遍較低。如Charin Techapun等報導菌株鏈黴菌Abl06利用農業廢棄物產酶活力僅15 U/ml ;李家群等用稻草粉在最佳條件下發酵培養鏈黴菌LH-3，木聚糖酶活力最高為120.3 U/ml)略低於麴黴和木黴，但通常並不分泌纖維素酶，因此其具有較高的工業應用價值。
[0006]
【發明內容】
[0007]由於放線菌產木聚糖酶的報導較少，因此本發明人通過實驗室利用農業廢棄物對產木聚糖酶的放線菌進行發酵條件優化篩選，篩得的放線菌做進一步選育，獲得了一株可利用玉米芯粉高產木聚糖酶的菌株異硫鏈黴菌{Str印tomyces。本發明所獲得的菌株不僅僅能高產木聚糖酶，更重要的是有效解決了農業廢棄物的再生利用，降低生產成本，減少環境汙染，提高產品附加價值。
[0008]為了實現本發明的目的，發明人通過大量試驗反覆進行菌種誘變選育研究，並最終獲得了一株利用玉米芯粉產木聚糖酶能力較強的異硫鏈黴菌C?trep tomycesalth1ticus)\MTi,已於2014年3月28日保藏於中國.武漢.武漢大學.中國典型培養物保藏中心，保藏編號為:CCTCC Μ 2014110。
[0009]本發明的涉及的高產木聚糖酶的異硫鏈黴菌{Streptomyces alth1ticus) LMZY具有如下生物學特徵:
形態學特徵:孢子絲螺旋形，氣生菌絲粉狀，白色，背面淺褐色。
[0010]生理特性:利用葡萄糖、果糖、鼠李糖、甘露醇以及半乳糖；在阿拉伯糖、木糖、肌醇以及麥芽糖等作為碳源；產生抑制革蘭氏陽性和陰性細菌的異硫黴素(alth1mycin)。
[0011]代謝特性:代謝過程能產木聚糖酶。
[0012]與已有的異硫鏈黴菌相比，本發明通過誘變篩選獲得的異硫鏈黴菌(S trep tomyces alth1ticus) LMZY具有如下優點和顯著進步:
(1)本發明所選育的菌株可利用農業廢棄物後高產木聚糖酶，發酵後所得發酵液中木聚糖酶活高達38.86U/ml。
[0013](2)本發明有效解決農業廢棄物的再生利用，降低了生產成本，減少環境汙染，提高了產品附加價值。
[0014]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為發酵周期對酶活的影響曲線圖。
[0016]圖2為發酵溫度對酶活的影響柱形圖。
[0017]圖3為接種量對酶活的影響柱形圖。
[0018]圖4為初始pH對酶活的影響柱形圖。
[0019]圖5為裝液量對酶活的影響柱形圖。
[0020]
【具體實施方式】
[0021]以下通過實施例形式對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實施例，凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
[0022]實施例一:菌種的選育
(1)菌株
異硫鏈黴菌(Streptomyces alth1ticus)
(2)培養基
每1 L所述富集培養基含有:自製玉米芯木聚糖10g、蛋白腖10 g、NaCl 5 g、Κ2ΗΡ041.5 g、MgS04.7H20 1 g，所述液體培養基pH自然；
每1 L所述選擇性分離培養基含有:自製玉米芯木聚糖8g、KN03 lg、NaCl 0.5g、MgS04
?7H20 0.5g、K2HP04lg、瓊脂20g，所述平板固體培養基pH自然；
每1 L所述搖瓶上種子培養基含有:可溶性澱粉20g、KN03 lg、K2HP04 0.5g、MgS04.7H20 0.5g、NaCl 0.5 g、FeS04.7H20 0.0lg，所述液體培養基 pH 自然；
每1 L所述固體斜面培養基含有:可溶性澱粉20g/L、KN03 lg/L、K2HP04 0.5g/L、MgS04
?7H20 0.5g/L、NaCl0.5 g/L、FeS04.7H20 0.01 g/L、瓊脂 20 g/L 0.1MPa 滅菌20min,所述斜面固體培養基pH自然；
每1 L所述搖瓶上復篩發酵培養基含有:玉米芯粉20g、酵母粉10 g、K2HP04 0.5g、Na2HP04 0.5g、MgS04.7H20 1.0g，所述發酵培養基 pH5.5。
[0023](3)實驗中所用溶液
無菌生理鹽水:取8.5g氯化鈉溶於1L的蒸餾水中溶解，0.1MPa滅菌20min。
[0024]⑷實驗步驟
從造紙廠採集土樣10份，水樣6分。首先從每份樣品中取一定樣品，用無菌生理鹽水將樣品打散；再用富集培養基(自製玉米芯木聚糖10g/L、蛋白腖10 g/L、NaCl 5 g/L、K2HP04 1.5 g/L、MgS04.7H20 1 g/L 0.1MPa 滅菌 20min) 30°C培養 Id ;接著用生理鹽水梯度稀釋成不同的土壤懸液，取0.1ml塗布於選擇性分離平板置37°C條件下，培養2-4d，挑取透明圈大且明顯的放線菌形態的菌株作為初篩菌株；挑出平板上的單菌落，接入斜面固體培養基保藏備用。
[0025]通過搖瓶發酵試驗驗證，獲得了一株利用玉米芯粉產木聚糖酶能力較強的異硫鏈黴菌{Streptomyces alth1ticus) LMZY，於2014年3月28日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為:CCTCC Μ 2014110。
[0026]實例二:異硫鏈黴菌LMZY的培養條件優化
(1)菌株:實例一篩選出的菌種異硫鏈黴菌LMZY
(2)方法步驟:
發酵培養基為初始培養基(玉米芯粉20g/L、酵母粉10 g/L、K2HP04 0.5g/L、Na2HP040.5g/L、MgS04.7H20 l.0g/L)。初始發酵條件為:自然pH，接種量10%，裝液量50 ml/250ml, 37 °C，180r/min 搖瓶發酵 72h。
[0027]採用單因素試驗考察異硫鏈黴菌LMZY的發酵溫度、初始pH、發酵周期、接種量、裝液量對木聚糖酶產量的影響。
[0028]a.發酵周期的優選試驗
其它發酵條件為初始發酵條件，每隔12h取樣測量木聚糖酶酶活，確定異硫鏈黴菌LMZY產木聚糖酶的最優發酵周期。
[0029]由圖1可知，當發酵到120h時酶活最高，為3.546U/ml。故選擇發酵周期為120h。
[0030]b.發酵溫度的優選試驗
發酵時間取上述試驗確定的最優結果，其它發酵條件為初始發酵條件，分別在25 °C、28 °C、31 °C、34 °C、37 °C、40 1:和43 °C搖床中進行發酵培養後測定木聚糖酶酶活，考察溫度對異硫鏈黴菌LMZY產木聚糖酶的影響。
[0031]由圖2可知，當發酵溫度為40°C時，酶活最高，為4.129 U/ml。故選擇發酵溫度為40。。。
[0032]c.接種量的優選試驗
發酵時間和發酵溫度取上述試驗確定的最優結果，其它發酵條件為初始發酵條件，接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%和12%時，考察接種量對異硫鏈黴菌LMZY產木聚糖酶的影響。
[0033]由圖3知，當接種量為6%時，酶活最高，為4.589U/ml。故選擇接種量為6%。
[0034]d.初始pH的優選試驗
發酵時間、溫度、和接種量取上述試驗確定的最優結果，其它發酵條件為初始發酵條件，調整初始pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，搖瓶發酵培養後測定木聚糖酶酶活，考察PH對異硫鏈黴菌LMZY產木聚糖酶的影響。
[0035]由圖4可知，當發酵初始pH為5.0時，酶活最高4.876U/ml。故選擇初始pH為5.0。
[0036]e.發酵搖瓶裝液量的優選試驗
發酵時間、溫度、和接種量和初始PH取上述試驗確定的最優結果，其它發酵條件為初始發酵條件，採用250 ml搖瓶裝液，搖瓶裝液量分別為30ml、50ml、70ml、90ml時，考察裝液量對異硫鏈黴菌LMZY產木聚糖酶的影響。
[0037]由圖5可知，當搖瓶裝液量為50ml (搖瓶體積250ml)時，酶活為4.887U/ml。故選擇裝液量為50ml (搖瓶體積250ml)。
[0038]實例三:發酵驗證試驗
以異硫鏈黴菌LMZY為發酵菌株；培養條件為發酵時間120h，溫度40°C，接種量6%，初始ρΗ5.0，裝液量50ml (搖瓶為250ml);培養基成分為:玉米芯粉31.45g/L、大豆粉16 g/L、硝酸鉀 8g/L、K2HPO4 0.4g/L、Na2HPO4 0.528g、MgSO4.7H20 0.4g/L，進行發酵驗證試驗。發酵後所得發酵液中木聚糖酶活為38.86U/ml。
【權利要求】
1.異硫鏈黴菌(5.^Γ<9/7?ο?_7--(95.LMZY,它的專利保藏編號為 CCTCC Μ2014110。
2.權利要求1所述的異硫鏈黴菌LMZY發酵產木聚糖酶的工藝。
3.權利要求1所述的異硫鏈黴菌LMZY在利用農業廢棄物玉米芯粉生產木聚糖酶的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK104263667SQ201410260651
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年6月13日 優先權日:2014年6月13日
【發明者】蔡俊, 羅玲, 王常高, 杜馨, 周安盛, 向夢雄 申請人:湖北工業大學