運用複合螢光pcr技術檢測食源性致病腸桿菌的方法

2023-05-18 10:30:41

專利名稱：：運用複合螢光pcr技術檢測食源性致病腸桿菌的方法
技術領域：
：本發明涉及細菌檢驗技術，具體地說是運用螢光PCR反應來檢測致病細菌，特別是食源性致病腸桿菌的技術，
背景技術：
：食品中常見的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，可導致多種疾病發生，嚴重威脅著人們的健康，食品中常見的致病菌主要是腸桿菌.快速、準確的檢測食品中的致病菌是有效預防和控制病原菌感染的前提條件，隨著分子生物學的發展，食品檢驗檢疫工作中的細菌鑑定方法已經從傳統的簡單生化實驗水平上向分子生物學的方法如PCR、探針雜交等技術發展，但是分子生物學的檢測方法在短期內仍然難以代替傳統的生化鑑定，目前分子生物學方法主要用於大量樣品的初篩，需要檢測的食源性腸桿菌主要包括以下幾種志賀氏菌、沙門氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、出血性大腸桿菌和大腸桿菌0157:H7等.
發明內容針對上述目標菌，本發明克服了現有技術中的缺點，提供一種運用複合螢光PCR技術快速低成本的檢測志賀氏菌、沙門氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、出血性大腸桿菌和大腸桿菌0157:H7方法，該方法包括應用該方法檢測食源性病原微生物的所使用的引物組和與之配套的PCR反應條件.其中引物、探針的全部序列如下引物t引物序列一5'CCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTC引物序列二5'TCTTTAAGAATCTGGATCAAGCTGAAA引物序列三5,CGAATGTGTCACCACATTCTCACCT引物序列四5'GGTAAAGAGGTTCTGACTACACGATG引物序列五5,CCCCATCGTGTAGTCAGAACCTCT引物序列六5'ATTTGAAGAGGT1T1AACTACATGTTAT引物序列七5，ATAACATGTAGTTAAAACCTCTTCAAAT引物序列八5,TGAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG引物序列九5，ATATGTCAACCTCTGACTGATAGTCTGA引物序列十5,CTTTATGAAAGCCTGCGAGTAAAG引物序列十-一5，CTGTTATGCTGGCTATCAGTCCTCT本發明提供了更加快速和低成本通過螢光PCR方法檢測食源性致病腸桿菌的方法,本發明是通過以下技術方案實現的(1)設計特異性寡核苷酸引物用於螢光染料嵌合螢光PCR技術檢測(2〉整合各引物使之不相互幹擾*(3〉以引物序列組，擴增待測樣品模板，進行目的基因的特異性擴增豕(4)擴增過程中使用螢光PCR儀進行實時螢光光強度淵i並在PCR反應結束後進行所合成DNA片段的熔解曲線的測定，並將數據傳輸至電腦通過配套軟體進行分析可以觀察到各種病原微生物的特異性熔解曲線的峰值.本發明的體系l用特異性的引物組擴增沙門氏菌、志賀氏菌、小腸耶爾森氏菌的基因組均產生螢光信號，並生成相應的熔解曲線峰值，均未發現假陽性和假陰性的結果.本發明中螢光PCR反應體系中各組分構成比例如下tableseeoriginaldocumentpage5螢光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)95"IO分鐘；(2)95"15秒；(3)60"C30秒；(4)回到第(2)步，重複40次(5)95"C2分(6)梯度升溫60"C至95*C每秒上升0,2"C。螢光PCR結果在擴增過程中使用螢光PCR儀進行實時螢光光強度淵量，並在PCR擴增程序結束後進行梯度升溫淵定擴增片段的熔解溫度.將數據傳輸至電腦通過配套軟體進行分析可以觀察到進行特異性擴增產生的螢光，可得到對志賀氏菌屬的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(771C±0.31C):小腸耶爾森氏菌的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(74"C土0,31C):沙門氏菌屬的特異性片段所特有的培解曲線雙峰值(81匸土0.31C和84.51C±0.3*C),如果得到對志賀氏菌屬的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(771C±0.31C),則證明待測樣品中存在志賀氏菌如果得到對小腸耶爾森氏菌的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(74"C土0.310),則證明待測樣品中含有小腸耶爾森氏菌沙門氏菌屬的特異性片段所特有的熔解曲線雙峰值(81"士0.3TC和84.5"C士0.3X:)則證明待測樣品中含有沙門氏菌。如出現其他結果則表明此次檢驗失敗不能確定是否存在志賀氏菌，沙門氏菌以及小腸耶爾森氏菌，霈重新檢驗.本發明的體系2用特異性的引物組擴增大腸桿菌0"7:H7株和出血性大腸桿菌的基因組均產生螢光信號，並生成相應的熔解曲線峰值，均未發現假陽性和假陰性的結果.本發明中螢光PCR反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍12.5jiL螢光嵌合法所用引物序列八0早螢光嵌合法所用引物序列九螢光嵌合法所用引物序列十10pmol/L0舉螢光嵌合法所用引物序列十一10pmol/LDNA樣品叫雙蒸水IO早總體積25nL螢光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)95*0IO分鐘(2)95"C15秒；(3)60r30秒(4)回到第(2)步，重複40次；(5〉951C2分(6)梯度升溫601C至951C每秒上升0.210.螢光PCR結果在擴增過程中使用螢光PCR儀進行實時螢光光強度測量，並在PCR擴增程序結束後進行梯度升溫測定擴增片段的港解溫度.將數據傳輸至電腦通過配套軟體進行分析可以觀察到進行特異性擴增產生的螢光，可得到對大腸桿菌0"7:H7株的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(77.51C±0.31C)和出血性大腸桿菌的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(74*C±0.31C),如果得到對大腸桿菌0157:117株的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(77.51C±0.3*C),則證明待測樣品中存在大腸桿菌0"7:H7株如果得到對出血性大腸桿菌的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(741C±0.3'C)則證明待測樣品中含有出血性大腸桿菌。如出現其他結果則表明此次檢驗失敗不能確定是否存在大腸桿菌0"7:H7株和出血性大腸桿菌。與現有技術相比，本發明的有益效果是基於螢光PCR的鑑定方法適用於直接從患者含菌體液、食品和體液培養物等臨床樣品中擴增靶基因，從而細菌，而且使用本方法只需要一次兩管螢光PCR反應就能夠檢測出志賀氏菌、沙門氏菌、小腸耶爾森氏菌、大腸桿菌0"7:H7株和出血性大腸桿菌，能夠節約檢溯成本和時間.螢光PCR方法具有檢測準確、特異性強、靈敏度高的特點，可以快速、準確地鑑定特異的目標細菌，它用PCR的方法擴增細菌靶基因，避免了反覆培養，節約時間PCR鑑定方法不受培養條件和細菌生理狀態的影響，較生理生化鑑定方法更為準確。圖1某待測鮮肉樣品中複合螢光PCR技術檢測待測樣品DNA,SYBRGreen螢光信號強度.圖2某待測鮮肉樣品中複合螢光PCR技術檢測待測樣品DNA,擴增產物熔解溫度峰值。圖3某待測餅乾樣品中複合螢光PCR技術檢測待淵樣品DNA,SYBRGreen螢光信號強度，圖4某待測餅乾樣品中複合螢光PCR技術檢測待測樣品DNA,擴增產物熔解溫度峰值。圖5某待測原料奶樣品中複合螢光PCR技術檢測待測樣品DNA,SYBRGreen螢光信號強度，圖6某待測原料奶樣品中複合螢光PCR技術檢測待測樣品DNA，擴增產物熔解溫度峰值。圖7某待測牛肉瞎頭樣品中複合螢光PCR技術檢測待測樣品DNA,SYBRGreen螢光信號強度*圖8某待測牛肉瞎頭樣品中複合螢光PCR技術檢測待測樣品DNA,擴增產物熔解溫度峰值.圖9某待測豆腐乾樣品中複合螢光PCR技術檢測待測樣品DNA,SYBRGreen螢光信號強度，圖10某待淵豆腐乾樣品中複合螢光PCR技術檢測待測樣品DNA,擴增產物熔解溫度峰值。具體實旌方式下面結合附圖與具體實施方式對本發明作進一步詳細描述.實施例l樣本某處出口鮮肉.用常規生理、生化方法檢測出志賀氏菌疑似菌落，然後進行如下複合螢光PCR技術檢測食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎.(2)溶解於1升營養肉湯中37TC培養8小時，2.DNA抽提取營養肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然後在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入1(KVL溶菌瞎溶液，37"保溫10分鐘，補加TE緩衝液500jiL,振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0),強烈振蕩，12000轉/分鐘離心3分鐘，取上清液，重複酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醉，混勻後低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清,加入50nLTE溶液，置-20*0保存，3.PCR擴增PCR反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍螢光嵌合法所用引物序列一10拜ol/L0.3)iL螢光嵌合法所用引物序列二10拜1/L0.3fiL螢光嵌合法所用引物序列三1O拜ol/L0.6)iL螢光嵌合法所用引物序列四1(HunoI/L0.3|iL螢光嵌合法所用引物序列五10拜1/L0.3)iL螢光嵌合法所用引物序列六10,ol/L0.6)iL螢光嵌合法所用引物序列七10拜ol/L0單DNA樣品雙蒸水總體積25iL螢光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為《(1)951CIO分鐘(2)95"15秒；(3)30秒(4)回到第(2)步，重複40次(5)95^C2分(6)梯度升溫60X:至951C每秒上升0.210,PCR共進行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA:無樣品的陰性對照.4.被檢測樣品螢光PCR圖譜觀察螢光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產生了明顯的SYBRGreen螢光，結果如圖1.陰性對照在PCR過程中沒有產生SYBRGreen螢光結果，在通過觀測擴增產物熔解溫度的螢光曲線，可以發現志賀氏菌屬的特徵峰值如圖2，圖1中的曲線所代表的SYBRGreen螢光強度信號是樣品中DNA擴增結果。圖2中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中志賀氏菌屬的特徵峰值。實驗表明樣品中含有志賀氏菌.3天後，通過常規微生物培養和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為福氏志賀氏菌，將其中一個菌株命名為CIQ810*螢光PCR檢驗結果與生化檢淵結果一致*實施例2樣本某處出口餅乾*用常規生理、生化方法檢測出沙門氏菌疑似菌落，然後進行如下複合螢光PCR技術檢測食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎，(2)溶解於1升營養肉湯中371C培養8小時，2.DNA抽提取營養肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然後在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100^L溶菌酶溶液，371C保溫10分鐘，補加TE緩衝液500fiL，振蕩混勻，加同體積Tris飽和盼(pH8.0),強烈振蕩，12000轉/分鐘離心3分鐘，取上淸液，重複酚抽提*取上淸液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2moi/L),混勻，再加等體積的冰乙醉，混勻後低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘,棄上淸，加70%冷乙醉洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上淸,加入50iiLTE溶液，置-20C保存，3.PCR擴增PCR反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍12單螢光嵌合法所用引物序列一1O萍ol/L螢光嵌合法所用引物序列二1(Hunol/L0.3^L螢光嵌合法所用引物序列三10拜ol/L0單螢光嵌合法所用引物序列四10拜ol/L0.3iL螢光嵌合法所用引物序列五10拜ol/L0.3fiL螢光嵌合法所用引物序列六10萍ol/L0單螢光嵌合法所用引物序列七10拜ol/L0.6(iLDNA樣品雙蒸水8單總體積25nL螢光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)951CIO分鐘,(2)951C15秒(3)651C30秒(4)回到第(2)步，重複40次(5)951C2分(6)梯度升溫601C至951C每秒上升0.2"0.PCR共進行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為《本待測樣品DNA:無樣品的陰性對照.4.被檢測樣品螢光PCR圖譜觀察螢光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產生了明顯的SYBRGreen螢光，結果如圖3。陰性對照在PCR過程中沒有產生SYBRGreen螢光結果，在通過觀測擴增產物熔解溫度的螢光曲線，可以發現沙門氏菌屬的特徵峰值如圖4.圖3中的曲線所代表的SYBRGreen螢光強度信號是樣品中DNA擴增結果，圖4中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中沙門氏菌屬的特徵峰值.實驗表明樣品中含有沙門氏菌.3天後，通過常規微生物培養和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為腸炎沙門氏菌，將其中一個菌株命名為CIQ815,螢光PCR檢驗結果與生化檢渕結果一致.實施例3樣本某處送檢的原料奶.用常規生理、生化方法檢測出小腸耶爾森氏菌疑似菌落，然後進行如下複合螢光PCR技術檢淵食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克離心*(2)沉澱物重新溶解於1升營養肉湯中371C培養8小時.2.DNA抽提取營養肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然後在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100nL溶菌醉溶液，371C保溫10分鐘，補加TE緩衝液500jiL，振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0),強烈振蕩，12000轉/分鐘離心3分鐘，取上淸液，重複酚抽提，取上清液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2moI/L),混勻，再加等體積的冰乙醉，混勻後低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清,加入5(HiLTE溶液，置-201C保存.3.PCR擴增PCR反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍12.5jiL螢光嵌合法所用引物序列一10pmol/L0.3^L螢光嵌合法所用引物序列二10拜ol/L0早螢光嵌合法所用引物序列三0.6fiL螢光嵌合法所用引物序列四10,1/L0.3jiL螢光嵌合法所用引物序列五10,1/L0.3}iL螢光嵌合法所用引物序列六10拜ol/L0.64螢光嵌合法所用引物序列七10,1/L0.6&DNA樣品雙蒸水8.5&總體積25螢光PCR擴增程序及測定擴増片段的熔解溫度程序為(1)95*CIO分鐘(2)951C15秒；(3)651C30秒(4)回到第(2)步，重複40次(5)2分(6)梯度升溫60TC至每秒上升0.2*0,PCR共進行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA;無樣品的陰性對照.4.被檢擁樣品螢光PCR圖譜觀察螢光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產生了明顯的SYBRGreen螢光，結果如圖5*陰性對照在PCR過程中沒有產生SYBRGreen螢光結果，在通過觀測擴增產物熔解溫度的螢光曲線，可以發現小腸耶爾森氏菌的特徵峰值如圖6.圖5中的曲線所代表的SYBRGreen螢光強度信號是樣品中DNA擴增結果，圖6中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中小腸耶爾森氏菌的特徵峰值。實驗表明樣品中含有小腸耶爾森氏菌，3天後，通過常規微生物培養和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為小腸耶爾森氏菌，將其中一個菌株命名為CIQ919.螢光PCR檢驗結果與生化檢測結果一致.實施例4樣本某處送檢的肉瞎頭.用常規生理、生化方法檢測出大腸桿菌Om7:H7疑似菌落，然後進行如下複合螢光PCR技術檢測食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎，(2)處理後的樣品溶解於1升營養肉湯中37C培養8小時，2.DNA抽提取營養肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然後在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100jiL溶菌雜溶液，37"C保溫10分鐘，補加TE緩衝液500jiL,振蕩混勻.加同體積Tris飽和酚(pH8.0),強烈振蕩，12000轉/分鐘離心3分鐘，取上清液，重複酚抽提。取上淸液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2邁ol/L),混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻後低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醉洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上淸,加入5(HiLTE溶液，置-20X:保存.3.PCR擴增PCR反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預泡合物2倍12早螢光嵌合法所用引物序列八1Ofunol/L0.3jiL螢光嵌合法所用引物序列九0.3jiL螢光嵌合法所用引物序列十10拜ol/L0.3^L螢光嵌合法所用引物序列十一10拜ol/L0舉DNA樣品1&雙蒸水10.3nL總體積25jiL螢光PCR擴增程序及潿定擴增片段的熔解溫度程序為《(1)95"CIO分鐘(2)951C15秒(3)601C30秒(4)回到第(2)步，重複40次(5)95匸2分(6)梯度升溫60*0至95"C每秒上升0.210。PCR共進行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA:無樣品的陰性對照.4.被檢測樣品螢光PCR圖譜觀察螢光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產生了明顯的SYBRGreen螢光，結果如圖7，陰性對照在PCR過程中沒有產生SYBRGreen螢光結果，在通過觀測擴增產物熔解溫度的螢光曲線，可以發現大腸桿菌0W:H7的特徵峰值如圖8,圖7中的曲線所代表的SYBRGreen螢光強度信號是樣品中DNA擴增結果，圖8中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中大腸桿菌OIS7:H7的特徵蜂值*實驗表明樣品中含有大腸桿菌01S7:H7.3天後，通過常規微生物培養和生化檢溯證明，所檢驗的目的菌落為大腸桿菌0w:H7，將其中一個菌株命名為CIQ869.螢光PCR檢驗結果與生化檢測結果一致.實施例5樣本某處送檢的豆腐乾。用常規生理、生化方法檢測出出血性大腸桿菌疑似菌落，然後進行如下複合螢光PCR技術檢淵食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎.(2)處理後的樣品溶解於1升營養肉湯中371C培養8小時.2.DNA抽提取營養肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然後在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100jiL溶菌酶溶液，37"C保溫10分鐘，補加TE緩衝液500jiL,振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強烈振蕩，12000轉/分鐘離心3分鐘，取上淸液，重複酚抽提.取上清液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醉，混勻後低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入50nLTE溶液，置-20"C保存.3.PCR擴增PCR反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍12單螢光嵌合法所用引物序列八0.3^L螢光嵌合法所用引物序列九{IO,oIZL0.3|iL螢光嵌合法所用引物序列十10拜1/L0.3&螢光嵌合法所用引物序列十一0.3^LDNA樣品1&雙蒸水10.3nL總體積25jiL螢光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為:(1)95X:IO分鐘(2)95"C15秒(3)60"30秒；(4)回到第(2)步，重複40次；(5)95"2分；(6)梯度升溫至95*0每秒上升0.210,PCR共進行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為，本待測樣品DNA:無樣品的陰性對照，4.被檢淵樣品螢光PCR圖譜觀察螢光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產生了明顯的SYBRGreen螢光，結果如圖9,陰性對照在PCR過程中沒有產生SYBRGreen螢光結果，在通過觀淵擴增產物熔解溫度的螢光曲線，可以發現出血性大腸桿菌的特徵峰值如圖10.圖9中的曲線所代表的SYBRGreen螢光強度信號是樣品中DNA擴增結果.圖10中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中出血性大腸桿菌的特徵峰值*實驗表明樣品中含有出血性大腸桿菌.3天後，通過常規微生物培養和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為出血性大腸桿菌，將其中一個菌株命名為CIQ639.螢光PCR檢驗結果與生化檢淵結果一致.序列列表SEQUENCELISTING中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局運用複合螢光PCR技術檢測食源性致病腸桿菌的方法200711811Patentlnversion3.3126DNA人工合成prima一bind(1)..(26)1ccgtgtacgcttagtcgcttaacctc26227DNA人工合成15tgttaataagagcacaactagtaagccttgcctcactgacagtggaatatg51〈210〉1651DNA〈213>Homosapiens16tgttaataagagcacaactagtaagacttgcctcactgacagtggaatatg511751〈212〉DNAHoraosapiens17tggtggtaggaattgtatttttttttattttacttttaactgacacataat￡51<210〉<211〉〈213〉1850DNAHomosapiens〈400>18t.Rgtgg'aggafittgtatttttttl:att.ttartt-ttnactgacacat朋t<211〉〈213>1951DNAHomosapiens19ttcaggaggcgctatcacacttggtgtgacatcaagataaagagcggaggt512051DNA〈213>Homosapiens20ttcaggaggcgctatcacacttggtatgacatcaagataaagagcggaggt512151〈212〉醒Homosapiens21ggcatagagcttgaaattcatttatatatactaa鄉aaaaactcataact51ccccatcgtgtagtcagaacctct628DNA人工合成primer_bind(1)"(28)6atttgaagaggttttaactacatgttat728DNA人工合成primer一bind(1)..(28)7ataacatgtagttaaaacctcttcaaat823DNA人工合成primer一bind(1)"(23)8tgaacaggaggtttctgcgttag927DNA24282823人工合成primer一bind(1)..(27)9atatgtcaacctctgactgatagtctg271024DNA人工合成primer一bind(1)"(24)10ctttatgaaagcctgcgagtaaag21125DNA人工合成primer一bind(1)"(25)11ctgttatgctggctatcagtcctct2權利要求1.一種運用複合螢光PCR技術檢測食源性致病腸桿菌的方法，其特徵在於，所使用的引物組序列如下引物引物序列一5』CCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTC引物序列二5』TCTTTAAGAATCTGGATCAAGCTGAAA引物序列三5』CGAATGTGTCACCACATTCTCACCT引物序列四5』GGTAAAGAGGTTCTGACTACACGATG引物序列五5』CCCCATCGTGTAGTCAGAACCTCT引物序列六5』ATTTGAAGAGGTTTTAACTACATGTTAT引物序列七5』ATAACATGTAGTTAAAACCTCTTCAAAT引物序列八5』TGAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG引物序列九5』ATATGTCAACCTCTGACTGATAGTCTGA引物序列十5』CTTTATGAAAGCCTGCGAGTAAAG引物序列十一5』CTGTTATGCTGGCTATCAGTCCTCT。2.根據權利要求1所述的一種運用複合螢光PCR技術檢測食源性致病腸桿菌的方法，其特徵在於，PCR反應體系1中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍12.5jiL引物序列一10|imol/L0.3jiL引物序列二10funol/L0.3nL引物序列三10拜ol/L0.6(iL引物序列四10拜ol/L0.3jiL引物序列五10拜ol/L0單引物序列六10[imol/L0.64引物序列七0單DNA樣品l(iL雙蒸水8.54總體積25*3.種運用複合螢光PCR技術檢測食源性致病腸桿菌的方法,其特徵在於，PCR反應體系2中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍12單引物序列八10拜ol/L0.3jiL引物序列九10拜ol/L0舉引物序列十1(Hunol/L0.3jiL引物序列十一10拜ol/L0攀DNA樣品雙蒸水10.3fiL總體積25^L*4.根據權利要求1所述的一種運用複合螢光PCR技術檢溯食源性致病腸桿菌的方法，其特徵在於，螢光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)95*0IO分鐘(2)95"15秒(3)65X:30秒；(4)回到第(2)步，重複40次；(5)95"C2分(6)梯度升溫60卩至95"每秒上升0.210.5.權利要求1所述的一種運用複合螢光PCR技術在檢測食源性致病腸桿菌方面的應用。全文摘要本發明公開了一種運用複合螢光PCR技術檢測食源性致病腸桿菌的方法，屬於細菌檢驗
技術領域：
，主要的技術方案是設計了引物組序列。致病腸桿菌是食品中常見的致病菌，嚴重威脅著人們的健康。快速、準確的檢測食品中的致病腸桿菌是有效預防和控制病原菌感染的主要前提條件。需要檢測的食源性致病腸桿菌主要包括以下幾種志賀氏菌、沙門氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、出血性大腸桿菌和大腸桿菌O157:H7。針對上述目標菌，本發明克服了現有技術中的缺點，提供一種運用複合螢光PCR技術快速低成本的檢測志賀氏菌、沙門氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、出血性大腸桿菌和大腸桿菌O157:H7的方法。該方法可以使用兩管PCR反應，能夠初篩出上述幾種病原微生物。文檔編號G01N33/52GK101113471SQ200710057578公開日2008年1月30日申請日期2007年6月7日優先權日2007年6月7日發明者佳於,寅劉,葉露萌,唐丹舟,張宏偉,李永君,鄭文杰,魏亞東,黃熙泰申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心;南開大學