生物誘導型活性人工角膜及其製備方法
2023-05-18 06:56:11
專利名稱：生物誘導型活性人工角膜及其製備方法
技術領域：
本發明涉及人工角膜技術，特別涉及一種生物誘導型活性人工角膜及其製備方法。
背景技術：
角膜病是目前眼致盲的主要因素，全球患者約有1000萬人，我國也有約300萬角膜盲患者。但由於供體來源的匱乏，我國每年能進行的同種異體角膜移植術僅約為1000例，大量的患者因人體角膜的短缺得不到醫治，這是一個全球性長期未能解決的問題。由於眼免疫赦免現象和角膜的無血管特性，角膜移植術是全身組織器官移植中成功率最高的手術，因此，人工角膜及其移植優於其他組織工程器官和組織的移植。目前已有的人工角膜有非活性人工角膜及無生物誘導性的組織工程人工角膜兩種，非活性人工角膜利用合成材料如甲基丙烯酸甲酯(MMA)等製作的人工角膜，在進行人體移植時，雖可使人視力有所恢復，但視野範圍極小，人工合成材料難以和眼周圍組織相融合，植入後有異物感，容易出現角膜溶解、房水滲漏、人工角膜脫出以及眼內炎等併發症，給患者帶來很大的痛苦。而通常概念上的組織工程人工角膜是在體外強化的條件下，進行角膜細胞培養。體外培養的細胞在支架材料上生長後，才使之具有生物活性；這種方法製作出的人工角膜雖然在與眼周圍組織相容性方面可能會有所改善，但由於它需要體外培養多種角膜細胞，而目前角膜細胞的獲得和培養的途徑和方法比較困難和不成熟，角膜細胞培養後的保存和傳代繁殖也存在問題，整個過程較複雜、費用高，異體角膜細胞在移植過程中的免疫排斥作用亦是面臨的一大難題。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術的缺點，提供一種與人眼組織具有良好的生物相容性、使用方便、性能良好並可長期保存和長途輸運，便於進行規模生產和實現產業化的生物誘導型活性人工角膜。
本發明的另一目的在於提供一種製備上述生物誘導型活性人工角膜的方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現本生物誘導型活性人工角膜包括如下組分——殼聚糖 0.5％～3％膠原0.5％～3％透明質酸0.1％～0.5％水 93.5％～96.0％以上比例為重量百分比。
除上述組份外，為助於刺激自體生長因子富集的速度，本生物誘導型活性人工角膜還可整合有角膜細胞生長因子如成纖細生長因子(FGF)，表皮細胞生長因子(EGF)和細胞轉化生長因子(TGF-β1)，用量為3～100ng/ml，以0.01％～0.2％的碳二亞胺(EDC)交聯劑交聯，形成帶生長因子的生物誘導型活性人工角膜。
製備上述生物誘導型活性人工角膜的方法包括如下步驟(1)將殼聚糖溶於酸溶液，膠原和透明質酸溶於水；(2)混合各組分；(3)將混合液注入模具中並烘乾；(4)用水浸泡清洗烘乾後所得製品並使其達吸水平衡。
在步驟2的各組分混合均勻後可加入角膜細胞生長因子。
所述酸溶液為鹽酸溶液或醋酸溶液。
所述混合過程為在室溫下攪拌1～2hr，使各組份充分混合均勻。
本發明的作用原理是人角膜組織主要由上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞和膠原纖維及粘多糖構成，膠原蛋白佔角膜乾重的75％，可從動物中大量提取，來源豐富且價格不貴，因此採用膠原作為本人工角膜支架的基質材料。
從動物中提取的膠原，雖然在組成上與人體膠原相似，但在提取過程中其整體結構發生了變化，提純後的膠原失去了強度，作為支架基質材料，在體內受膠原酶的作用，極易降解；為了彌補膠原的這些弱點，增強膠原的強度和控制其在體內的降解率，採取加入殼聚糖的方法；殼聚糖是一種天然的生物氨基多糖，與角膜細胞間質中的粘多糖有相似的結構，成膜性好、強度高、外觀透明，在機體內不被膠原酶降解，可緩慢地被溶菌酶降解，從而可以調節支架基質材料的降解率，同時也可使用交聯劑對材料進行交聯，控制降解率。
透明質酸屬粘多糖，它是構成角膜細胞外和細胞間基質的主要成分，具有粘彈性和大分子水合性，可促進和引導角膜細胞的生長繁殖，與膠原相結合形成的網狀結構對角膜形態和正常生理狀態的維持具有重要作用，通過與角膜內皮的結合，形成角膜組織表面的保護膜，控制體內自由基對角膜細胞造成的損傷，透明質酸分子中大量帶負電荷的羧基與眼表面的粘多糖成份中含有的羥基通過氫鍵結合，易於與眼表面親合。
生長因子對角膜細胞的培養、生長繁殖及與細胞外和細胞間基質的結合有極大的影響，不同角膜細胞生長因子之間的協同效應和用量對角膜細胞的生長繁殖可進行調控，其中成纖維細胞生長因子(FGF)、轉化生長因子(TGF-β1)，和表皮生長因子(EGF)對角膜細胞的生長繁殖、細胞間的正常融合及與基質的結合均有促進作用。
本發明相對於現有技術具有如下的優點(1)本發明生物誘導型活性人工角膜與眼組織具有優良的相容性，與眼角膜細胞相融合，誘導多種角膜細胞生長因子富集，刺激角膜細胞在其上生長繁殖；在角膜移植和修復前，不需進行體外角膜細胞的培養，因而免除了體外培養角膜細胞的複雜過程和由異體角膜細胞移植引起的免疫排斥反應，以及由此而產生的各種併發症，所以使用不但簡單方便，而且非常安全可靠，作用效果較好；(2)本生物誘導型活性人工角膜具有與人眼角膜相似的光學與力學特性，可根據有關要求進行各種加工成型；已製作的生物誘導型活性人工角膜的光學力學指標與人角膜相似，如下所示材料透光率90～96％；材料折射率1.368～1.382(人眼角膜為1.377)；材料機械強度與人眼角膜相仿，其中溼態抗張強度4Mpa～8.6MPa；含水率55～75％；扯斷伸長率300％～350％；(3)本生物誘導型活性人工角膜比較適合成型加工，製作過程簡單、加工容易方便，所以可以大批量地製備及使用；(4)本生物誘導型活性人工角膜易於長期保存和長途輸運，便於進行規模生產和實現產業化；(5)本生物誘導型活性人工角膜的發明，不但對於人民健康有重要促進作用，可產生重要社會與經濟效益，而且還為其它生物誘導型活性人工組織的研究開闢了道路，因而具有重要的科學意義。
(四)
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步具體的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1本生物誘導型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖 2％膠原 2.5％透明質酸 0.3％水 95.1％以上比例為重量百分比。
用上述各組分製備本生物誘導型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶於鹽酸溶液，將膠原和透明質酸溶於水；(2)將殼聚糖鹽酸溶液與膠原和透明質酸的水溶液在室溫下攪拌1.5小時，使各組份充分混合均勻；(3)在混合均勻的混合液中加入0.1％的碳二亞胺交聯劑，90ng/ml成纖細生長因子，35ng/ml表皮細胞生長因子和60ng/ml細胞轉化生長因子，再充分混合半小時；(4)將混合液注入預製的角膜模具中，注滿角膜模具後將其放入烘箱內烘乾後取出；(5)用清水浸泡清洗烘乾後所得的角膜製品以去除殘留雜質，並使其在水中放置24～48小時以達到吸水平衡，然後取出即製得本生物誘導型活性人工角膜。
實施例2本生物誘導型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖 1％膠原 3％透明質酸 0.2％水 95.65％以上比例為重量百分比。
用上述各組分製備本生物誘導型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶於醋酸溶液，將膠原和透明質酸溶於水；(2)將殼聚糖醋酸溶液與膠原和透明質酸的水溶液在室溫下攪拌2小時，使各組份充分混合均勻；(3)在混合均勻的混合液中加入0.15％的碳二亞胺交聯劑，5ng/ml成纖細生長因子，20ng/ml表皮細胞生長因子和10ng/ml細胞轉化生長因子，再充分混合半小時；(4)將混合液注入預製的角膜模具中，注滿角膜模具後將其放入烘箱內烘乾後取出；(5)用清水浸泡清洗烘乾後所得的角膜製品以去除殘留雜質，並使其在水中放置24～48小時以達到吸水平衡，然後取出即製得本生物誘導型活性人工角膜。
實施例3本生物誘導型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖0.5％膠原 1.5％透明質酸 0.3％水97.7％以上比例為重量百分比。
用上述各組分製備本生物誘導型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶於醋酸溶液，將膠原和透明質酸溶於水；(2)將殼聚糖醋酸溶液與膠原和透明質酸的水溶液在室溫下攪拌2小時，使各組份充分混合均勻；(3)將混合液注入預製的角膜模具中，注滿角膜模具後將其放入烘箱內烘乾後取出；(4)用清水浸泡清洗烘乾後所得的角膜製品以去除殘留雜質，並使其在水中放置24～48小時以達到吸水平衡，然後取出即製得本生物誘導型活性人工角膜。
實施例4本生物誘導型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖 1.5％膠原2％透明質酸0.1％水 96.4％以上比例為重量百分比。
用上述各組分製備本生物誘導型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶於醋酸溶液，將膠原和透明質酸溶於水；(2)將殼聚糖醋酸溶液與膠原和透明質酸的水溶液在室溫下攪拌2小時，使各組份充分混合均勻；(3)將混合液注入預製的角膜模具中，注滿角膜模具後將其放入烘箱內烘乾後取出；(4)用清水浸泡清洗烘乾後所得的角膜製品以去除殘留雜質，並使其在水中放置24～48小時以達到吸水平衡，然後取出即製得本生物誘導型活性人工角膜。
測量上述各實施例製得的生物誘導型活性人工角膜的光學力學指標與人眼角膜的參數比較如表一所示表一
由上表比較結果可知，本生物誘導型活性人工角膜在性能參數與人眼角膜值非常接近，由此可見，本生物誘導型活性人工角膜與人眼角膜較為相似。
將上述製得的生物誘導型活性人工角膜分別進行動物埋植實驗、人工角膜板層移植實驗。由實驗結果可觀察到植入後本人工角膜可一直保持透明，60天後取出染色後作病理切片在光學顯微鏡下觀察，可見角膜結構正常，無炎症細胞，上皮無增厚及變薄，實質層無水腫，內皮結構正常；植入的生物誘導型人工角膜材料能與角膜相容，角膜與材料之間相粘結，在與角膜相粘連的材料處可見角膜細胞生長並具有向材料內部生長的趨勢；材料兩個月在體內的降解率約為30％。
權利要求
1.一種生物誘導型活性人工角膜，包括如下組分殼聚糖 0.5％～3％膠原 0.5％～3％透明質酸 0.1％～0.5％水 93.5％～96.0％以上比例為重量百分比。
2.根據權利要求1所述生物誘導型活性人工角膜，其特徵在於整合有角膜細胞生長因子。
3.根據權利要求2所述生物誘導型活性人工角膜，其特徵在於所述角膜細胞生長因子為成纖細生長因子，表皮細胞生長因子和細胞轉化生長因子，用量分別為3～100ng/ml，以0.01％～0.2％的碳二亞胺交聯劑交聯。
4.一種生物誘導型活性人工角膜的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)將殼聚糖溶於酸溶液，膠原和透明質酸溶於水；(2)混合各組分；(3)將混合液注入模具中並烘乾；(4)用水浸泡清洗烘乾後所得製品並使其達吸水平衡。
5.根據權利要求4所述生物誘導型活性人工角膜的製備方法，其特徵在於在各組分混合均勻後，加入角膜細胞生長因子。
6.根據權利要求4所述生物誘導型活性人工角膜的製備方法，其特徵在於所述酸溶液為鹽酸溶液或醋酸溶液。
全文摘要
本發明提供一種生物誘導型活性人工角膜,包括如下組分:殼聚糖0.5%～3%、膠原0.5～3%、透明質酸0.1%～0.5%、水93.5%～96.0%,以上比例為重量百分比;為助於刺激自體生長因子富集速度,也可先在材料上整合角膜生長因子;一種生物誘導型活性人工角膜的製備方法,包括如下步驟:將殼聚糖溶於酸溶液,膠原和透明質酸溶於水;混合各組分;將混合液注入模具中並烘乾;用水浸泡清洗烘乾後所得製品並使其達吸水平衡。本生物誘導型活性人工角膜具有與人眼角膜相似的特性,與眼組織的相容性好,適合成型加工,製作過程簡單,並易於長期保存和長途運輸,社會與經濟效益較好,並具有重要的科學意義。
文檔編號A61L27/00GK1382425SQ0211521
公開日2002年12月4日 申請日期2002年5月14日 優先權日2002年5月14日
發明者黃耀熊, 李沁華 申請人:暨南大學