利用玉米花色素苷調節基因Lc快速培育不育水稻的方法
2023-05-18 18:02:21
專利名稱：利用玉米花色素苷調節基因Lc快速培育不育水稻的方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程技術領域，具體說，是利用轉基因技術將玉米花色素苷調節基因Lc導入水稻植株並表達，從而培育出不育水稻植株的方法。
背景技術：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一。全球一半以上的人口以稻米為主要食物來源。水稻也是我國最重要的糧食作物。我國作為ー個水稻種植與消費的大國，水稻的產量一直受到國家、科學界及民眾的關注。用兩種遺傳特性不同的品種作為父母本進行雜交，得到的雜種第一代，往往比父母本有較強的生長勢、適應性、抗逆性和生產力，這叫做雜種優勢。雜交水稻一般可比常規水稻增產20%(白德明，作物研究，1990，4(1) :26-28)。近年來，我國雜交水稻年種植面積佔總水稻面積的57%，即1600萬公頃。全國雜交水稻平均產量為7.2噸/公頃，大約比常規水稻單產多1.4噸/公頃。我國毎年種植雜交水稻所增產的糧食可多養活7000萬人ロ。雜交水稻為解決中國糧食問題，使中國成為最大的糧食自給國發揮了關鍵性作用(龍軍，光明日報，2011，7，12)。水稻屬於自花授粉作物，正常水稻進行雜交必須人為去除一朵花中的雄蕊或雌蕊。國外早在幾十年前，就有人從事雜交水稻的研究，但一直未能用於生產。1964年，我國「雜交水稻之父」袁隆平院士在我國率先開展雜交水稻研究。袁隆平院士課題組在1964年至1965年發現6株天然雄性不育的植株(袁隆平，科學通報，1966，11 (4) : 185-185)，以及在1970年他的助手再次發現水稻不育植株，都為三系雜交水稻成功應用奠定了非常重要的基礎。1973年，石明松在農墾58水稻大田中發現了ー種不同於袁隆平院士早年發現的水稻不育植株。經以後研究得知，石明松發現的水稻不育植株屬於光溫敏雄性不育水稻。這種類型不育株的發現為今天利用兩系雜交方法培育超級雜交稻研究做出了極其重要的貢獻。目前國內外一直都非常重視對水稻不育現象的研究。最近，我國華中農業大學張啟發院士課題組和華南農業大學莊楚雄研究員課題組分別在國際著名雜誌，發表控制水稻光敏感核不育基因的研究成果(Ding et al, http://www. pnas. org/content/109/7/2654; Zhou et al，Cell Research，2012，22 :649-660)。這些研究成果為指導兩系雜交稻育種，以及深入利用水稻雜種優勢都具有深遠的意義。在我國兩次不同類型水稻不育植株的發現以及隨後的研究，都對雜交水稻在生產中的應用起到了極大的推動作用。儘管水稻不育屬於ー種異常的生理現象，但是正是由於對水稻不育機理的研究成果有可能進ー步推進雜交水稻的應用。因此，對水稻不育機理探索一直是科學家們特別感興趣的研究領域。為了更多探索水稻不育的機理，本領域需要建立各種方法設法獲得不育水稻植株的方法。
1989 年，Ludwig 從玉米中分離獲得了 Lc 基因(Ludwig et al, Proc Natl AcadSc i，1989，86 (18) : 7092-7096)。Lc基因參與調控葉脈、葉舌、葉耳、穎片、內稃和果皮等組織中花色素苷的產生，是第I個在植物中發現的具有bHLH結構域的轉錄因子，屬於R/B基因家族成員。目前利用Lc基因進行轉化研究的報導較多，但人們都是單獨利用該基因或與玉米另ー個轉錄因子基因Cl、或是Pl—同導入某種作物中，主要都是試圖改變花色或果皮的顔色，同時設法増加果實中的類黃酮物質含量。Lloyd等在1992年將Lc基因轉入擬南芥和菸草中，轉Lc基因的菸草花色素表達量得到提高；轉Lc基因的擬南芥在葉、莖、萼片中花色素含量增加(Lloyd et al，Science, 1992，258:1773-1775)。Quattrocchio在1993將Lc基因導入矮牽牛，愈傷組織和花都呈現紅色(Quattrocchio,Plant Cell, 1993，5 (11) : 1497-1512);在番茄中，Lc基因能夠增強花色素苷的積累，轉基因植株呈現明顯的紫色(Goldsbrough et al,Plant J, 1996, 9:927-933);在 1998年，Bradley等發現含有Lc基因矮牽牛葉片為紫色，營養和生殖器官中的花色素苷含量都有所提高，同時還分析了參與類黃酮生物合成相關酶的表達水平，結果顯示，較多與黃酮類物質合成相關酶蛋白的基因表達水平也明顯提高(Bradley et al, Plant, 1998, 13 (3) :381-392)；1999年，Bradley等又將Lc基因導入洋桔梗和天竺葵植物，轉基因後代儘管無明顯性狀改變，但是轉基因洋桔梗類黃酮生物合成途徑中的酶基因表達增加(Bradley et al, PlantSci, 1999，140:31-39) ；De Vos等將Lc和Cl 一同導入馬鈴薯，塊莖中花色素含量增加，塊莖的皮變為紫紅色(De Vos et al, Polyphenols Commun, 2000，1:25-26) ;Bovy 等將 Lc 和Cl 一同導入番茄，轉基因番茄葉片為紫色，在果肉中黃酮醇含量提高，總黃酮醇含量為對照的20倍，參與類黃酮生物合成相關酶基因表達水平也有提高(Bovy et al,The Plant CellOnline, 14，2509-2526) ；Ray等將Lc基因導入苜蓿，在強光和低溫條件下培養，植株表現紫紅色(Ray et al, Plant Physiol, 2003, 132:1448-1463) ；Li 等人報導了將 Lc 基因導入雙色貝母，轉基因植株根、莖、葉中出現紅色(Li et al, Plant Cell R印，2005，23:716-720);Li等將Lc基因導入蘋果，愈傷組織、葉、莖變成紅色和紫紅，同時發現類黃酮生物合成途徑中的ー些酶基因表達水平提高，類黃酮中的花色素苷和原花色素含量也明顯增加(Liet al, Planta, 2007，226:1243-1254)。Yun-Jeong Han 等人為使匍匍翦股穎(creepingbentgrass)更具有觀賞價值，將Lc和Pl兩種基因轉入匍匐翦股穎，使匍匐翦股穎轉變為紫色(Han et al, Plant Cell Reports, 2009，28，397-406)。另外，Henryk Flachowsky 等人發現，異源表達Lc基因的轉基因蘋果樹，其生長習性發生改變，抵抗蘋果黑星病和火疫病的能力也相應有所提高(Flachowsky et al，Planta, 231 (3) :623-635)。本實驗室也曾經將Lc基因在花椰菜花葉病毒35S基因啟動子引導下轉化菸草，獲得24棵轉基因菸草植株。轉基因菸草植株花冠筒、冠簷、花絲顏色都比對照有明顯加深的現象(李建粵等，上海師範大學學報，2008，37 (6) : 613-617)，但是在實驗中我們從轉基因菸草植株上都順利地收穫了第一代種子。在將第一代種子種下後又成功收穫到第二代種子。在前人和本實驗室關於利用Lc基因對作物進行遺傳轉化的研究中從未見涉及引起作物不育現象的報導。
發明內容
本發明的目的之ー是提供ー種快速獲得不育水稻的方法。 本發明還將玉米花色素苷調節基因Lc用於培育和篩選不育水稻。
本發明還提供了 ー種用於培育不育水稻重組表達載體。本發明將玉米花色素苷調節基因Lc用於培育和篩選不育水稻，利用轉基因技術將玉米花色素苷調節基因Lc導入水稻植株並表達，從而培育出不育水稻植株。本發明還提供了ー種利用玉米花色素苷調節基因Lc快速獲得不育水稻的方法，該方法包括以下步驟(I)將啟動子引導的玉米花色素苷調節基因Lc插入載體，得到重組表達載體，並用所述的重組表達載體轉化水稻；所述啟動子為花特異表達基因的啟動子或組成型基因的啟動子；可利用根瘤農桿菌介導的水稻遺傳轉化法將表達載體的T-DNA區段轉入受體水稻中；(2)鑑定選取檢測結果為陽性的轉基因水稻；鑑定方法為 利用PCR鑑定轉基因水稻植株中存在玉米花色素苷調節基因Lc ;利用RT-PCR分析確定玉米花色素苷調節基因Lc在轉基因水稻植株中能夠表達；(3)選取幼穗穎花呈紅色或者抽穗後穎花花葯呈粉紅色的轉基因水稻植株，即為不育水稻植株。步驟(I)中，重組表達載體的製備方法包括以下步驟將玉米花色素苷調節基因Lc插入到載體的含有左右邊界序列的T-DNA中，並且在玉米花色素苷調節基因Lc的上下遊分別連接啟動子和終止子；啟動子為花特異表達基因的啟動子或組成型基因的啟動子。組成型基因的啟動子選自選自花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子片段，或是玉米泛素蛋白基因的啟動子片段，或是水稻肌動蛋白基因的啟動子片段。終止子為胭脂鹼合成酶基因終止子或是花椰菜花葉病毒的35S基因終止子。載體可選用pCAMBIA1301質粒或pCAMBIA1300質粒。本發明還提供了一種用於培育不育水稻重組表達載體，它是由組成型基因的啟動子或花特異表達基因的啟動子引導玉米花色素苷調節基因Lc構建的表達載體，包括如下序列(I)啟動子；(2)玉米花色素苷調節基因Lc ；(3)終止子；啟動子位於玉米花色素苷調節基因Lc上遊，終止子位於玉米花色素苷調節基因Lc下遊；所述啟動子為組成型基因的啟動子或花特異表達基因的啟動子。組成型基因的啟動子選自花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子、玉米泛素蛋白基因的啟動子、水稻肌動蛋白基因的啟動子或者花特異表達基因的啟動子。終止子為胭脂鹼合成酶基因終止子或者花椰菜花葉病毒的35S基因終止子。這種重組表達載體還含有內切酶敏感序列或者標記基因序列。本發明通過將含有玉米花色素苷調節基因Lc在組成型基因的啟動子或花特異表達基因的啟動子引導下構成的表達載體轉化水稻，轉基因水稻的穎花不僅會出現類似前人研究中呈現的花色變化的現象，如幼嫩的穎花或抽穗後退化的穎花呈現紅色，抽穗後的花葯會呈粉紅色的現象，還會使這些花器官有顏色變化的水稻植株表現為完全不育的現象。本發明為獲得不育水稻提供了新思路。本發明所要解決的技術問題是提供ー種快速獲得不育水稻的方法，以滿足目前對水稻不育機理研究中需要快速獲得不育水稻的要求，以及在對由Lc基因導致水稻不育機理研究獲得的成果有可能被應用於今後雜交水稻的生產中。
圖I是本發明使用的表達載體pCAMBIA1301-35S-Lc-N0S的T-DNA結構圖。LB、RB為T-DNA的左右邊界；35S-pro、35S-ter為花椰菜花葉病毒35S基因啟動子和終止子；Nos-ter為胭脂鹼合成酶基因終止子；Lc為花色素苷調節基因；hpt為潮黴素抗性基因；gus為β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因。圖2是pCAMBIA1301質粒的T-DNA結構圖。圖中LB、RB為T-DNA的左右邊界；35S-pro、35S-ter為花椰菜花葉病毒35S基因啟動子和終止子；hpt為潮黴素抗性基因；gus為β -葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Xh為XhoI的縮寫；E為EcoRI的縮寫；Sa為SacI的縮寫；K為KpnI的縮寫；S為SmaI的縮寫；B為BamHI的縮寫；X為XbaI的縮寫；Sal為SalI 的縮與；P為PstI的縮與；H為HindIII的縮與。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。構建表達載體和水稻轉化操作中涉及的常規PCR擴增、限制性內切酶酶切和連接、根瘤農桿菌培養轉化等方法主要參考《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯克J等，分子克隆實驗指南(第二版)，科學出版社，1992)。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例I本實施例是為了說明構建含有花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子引導玉米花色素苷調節基因Lc表達載體的方法以及所獲載體的結構組成，構建過程如下(I)在pCAMBIA1301 (來自於中科院上海植物生理與生態研究所王宗陽研究員)質粒載體(圖2) NOS終止子兩端設計PCR引物，上遊和下遊引物分別引入KnpI和EcoR I酶切位點；PCR引物的序列是5』 ggtaccgtttcttaagattgaatcctgttg3 (下劃線為KnpI酶切位點)和 5，gaattcttcccgatctagtaacatagatg3 (下劃線為 EcoR I 酶切位點)。PCR 條件94°C預變性5min、94°C變性30s、58°C退火30s，72°C合成30min，35個循環後，72°C延伸5min。圖2中LB、RB為T-DNA的左右邊界；35S-pro、35S_ter為花椰菜花葉病毒35S基因啟動子和終止子；hpt為潮黴素抗性基因；gus為β -葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Xh為XhoI的縮寫；E為EcoRI的縮寫；Sa為SacI的縮寫；K為KpnI的縮寫；S為SmaI的縮寫；B為BamHI的縮寫；X為XbaI的縮寫；Sal為SalI的縮寫；P為PstI的縮寫；H為Hind III的縮寫。將PCR產物與T載體連接得到T-I載體，並轉化大腸桿菌感受態細胞，採用PCR、酶切及測序鑑定。將鑑定正確的T-ι載體和PCAMBIA1301質粒均採用KnpI和EcoRI雙酶切，分別從電泳凝膠中回收小片段和大片段序列，採用T4DNA連接酶進行連接後轉化大腸桿菌感受態細胞，採用PCR、酶切及測序鑑定，獲得pCAMBIA1301-N0S載體；即在兩個35S基因啟動子之間插入ー個NOS終止子。(2)參照GenBank公布的Lc基因序列(GenBank:Μ26227· I),分別在Lc基因編碼區起始密碼子和終止密碼子處設計ー對引物，上遊引物含有XbaI酶切位點，下遊引物含有KnpI酶切位點。從已授粉後的玉米雌花序中提取RNA，利用RT-PCR克隆花色素苷調節基因Lc0PCR 引物的序列是 5』 tctagaatggcgctttcagcttccc3』 (下劃線為 XbaI 酶切位點)和5』 ggtacctcaccgcttccctatagc3』 (下劃線為為Knp酶切位點)。PCR條件為94°C預變性 5min、94°C變性 45s、55°C退火 45s，72°C合成 lmin，35 個循環後，72°C延伸 lOmin。
將PCR產物與T載體連接得到T-2載體，並轉化大腸桿菌感受態細胞，採用PCR、酶切及測序鑑定。將鑑定正確的T-2載體和pCAMBIA1301-N0S載體均採用KnpI和Xba I雙酶切，分別從電泳凝膠中回收小片段和大片段序列，採用T4DNA連接酶進行連接後轉化大腸桿菌感受態細胞，採用PCR、酶切及測序鑑定，獲得pCAMBIA1301-Lc-N0S載體；(3)設計能夠與pCAMBIA1301質粒上引導潮黴素抗性基因的花椰菜花葉病毒35S基因啟動子配對的引物，上遊和下遊引物分別引入Hind III和Xba I酶切位點，PCR擴增後電泳回收分子量約為780bp產物。PCR引物的序列是.5’tctagaagagatagatttgtagagagaata3』 (下劃線為 Xba I 酶切位點)和 5』aagcttcgacactctcgtctactcc3』 (下劃線為 Hind III酶切位點)。PCR條件是94°C預變性5min、94°C變性45s、56°C退火30s，72°C合成45s，35個循環後，72°C延伸IOmin。將PCR產物與T載體連接後得到T-3載體，並轉入大腸桿菌感受態細胞；通過酶切、PCR及測序鑑定。將鑑定正確的T-3載體和pCAMBIA1301-N0S載體均採用Hind III和Xba I雙酶切，分別從電泳凝膠中回收小片段和大片段序列，採用T4DNA連接酶進行連接後轉化大腸桿菌感受態細胞，採用PCR、酶切及測序鑑定，獲得本發明使用的最終表達載體pCAMBIA1301-35S-Lc-N0S，如圖I所示；其中啟動子為花椰菜花葉病毒35S基因啟動子(也可以用玉米泛素蛋白基因的啟動子、水稻肌動蛋白基因的啟動子代替花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子)。實施例2本實施例是為了說明如何利用實施例I構建的表達載體轉化水稻。利用表達載體pCAMBIA1301-35S-Lc_N0S單質粒對水稻進行遺傳轉化，在培育轉基因水稻中涉及的根瘤農桿菌培養及抗性愈傷組織篩選及植株再生主要參考李建粵等的方法進行(李建粵等，西北植物學報，2008，28 (6) : 1082-1087)。實施例3本實施例是為了說明如何從轉基因水稻中獲得不育單株，具體操作如下利用CTAB法抽提實施例2所得到轉基因水稻基因組DNA，使用能夠與的目的基因Lc特異配對的引物對轉基因水稻基因組DNA進行PCR檢測，保留PCR檢測為陽性的植株；PCR 引物分別為 5' GCCGGCTCTCTGTCGCCGGA3'和 5' GTCTGCTGCGGCCTCGCCGGTCTC3'。RT-PCR方法分析確定Lc基因在植株中能夠表達利用TRIZOL Reagent抽提PCR檢測為陽性的轉基因水稻穎花總RNA,並使用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒獲得cDNA的第一鏈。使用能夠與目的基因Lc特異配對的引物確定Lc基因是否能夠轉錄mRNA。保留Lc基因mRNA能夠轉錄的轉基因植株。
在轉基因植株進入生殖發育早期剝取幼穗觀察，保留幼穗穎花呈紅色的植株；或者在轉基因水稻抽穗後，通過剝開穎花見到花葯呈粉紅色的植株，這些即為不育水稻植株。在水稻抽穗後，分別取紙袋套住幼穗穎花呈紅色或抽穗後穎花花葯呈粉紅色植株的穗子和非轉基因水稻穗子；或是將幼穗穎花呈紅色或抽穗後穎花花葯呈粉紅色植株和非轉基因水稻植株放在兩個不同的環境，即達到隔離的效果。在一月後取轉基因和非轉基因對照水稻穗子觀察可以發現，非轉基因水稻能夠正常結種子，而轉基因水稻呈100%不育。用pCAMBIA1300質粒代替pCAMBIA1301質粒作為載體，將玉米花色素苷基因Lc片段插入PCAMBIA1300質粒；或用玉米泛素蛋白基因的啟動子、水稻肌動蛋白基因的啟動子代替花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子；或用35S終止子代替NOS終止子，結果相同，也獲得不育水稻。在轉基因植株進入生殖發育早期剝取幼穗觀察，選擇幼穗穎花呈紅色的植株； 或者在轉基因水稻抽穗後，選擇剝開穎花後見到花葯呈粉紅色的植株，經檢驗，這些也均為不育水稻植株。
權利要求
1.ー種利用玉米花色素苷調節基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)將啟動子引導的玉米花色素苷調節基因Lc插入載體，得到重組表達載體，並用所述的重組表達載體轉化水稻； (2)鑑定選取檢測結果為陽性的轉基因水稻； (3)選取幼穗穎花呈紅色或者抽穗後穎花花葯呈粉紅色的植株，即為不育水稻植株。
2.權利要求I所述利用玉米花色素苷調節基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特徵在於，步驟(I)重組表達載體的製備方法包括以下步驟 將玉米花色素苷調節基因Lc插入到載體的含有左右邊界序列的T-DNA中，並且在玉米花色素苷調節基因Lc的上下遊分別連接啟動子和終止子。
3.權利要求I或2所述利用玉米花色素苷調節基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特徵在於，所述的載體為PCAMBIA1301質粒或pCAMBIA1300質粒。
4.權利要求I或2所述利用玉米花色素苷調節基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特徵在於，所述的啟動子為花特異表達基因的啟動子或組成型基因的啟動子。
5.權利要求4所述利用玉米花色素苷調節基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特徵在於，所述組成型基因的啟動子選自花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子片段，或是玉米泛素蛋白基因的啟動子片段，或是水稻肌動蛋白基因的啟動子片段。
6.權利要求2所述利用玉米花色素苷調節基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特徵在於，所述的終止子為胭脂鹼合成酶基因終止子或是花椰菜花葉病毒的35S基因終止子。
7.權利要求I所述利用玉米花色素苷調節基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特徵在於，步驟(2)的鑑定方法為 利用PCR鑑定轉基因水稻植株中存在玉米花色素苷調節基因Lc ;利用RT-PCR分析確定玉米花色素苷調節基因Lc在植株中能夠表達。
8.玉米花色素苷調節基因Lc用於培育和篩選不育水稻。
9.一種用於培育不育水稻重組表達載體，其特徵在於，包括以下序列 (O啟動子； (2)玉米花色素苷調節基因Lc； (3)終止子; 啟動子位於玉米花色素苷調節基因Lc上遊，終止子位於玉米花色素苷調節基因Lc下遊；所述啟動子為組成型基因的啟動子或花特異表達基因的啟動子。
10.權利要求9所述用於培育不育水稻重組表達載體，其特徵在於，還含有內切酶敏感序列或者標記基因序列。
11.權利要求9所述用於培育不育水稻重組表達載體，其特徵在於，所述組成型基因的啟動子選自花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子、玉米泛素蛋白基因的啟動子、水稻肌動蛋白基因的啟動子或者花特異表達基因的啟動子；所述的終止子為胭脂鹼合成酶基因終止子或是花椰菜花葉病毒的35S基因終止子。
全文摘要
本發明公開了一種利用玉米花色素苷調節基因Lc培育不育水稻的方法。方法為(1)將啟動子引導的玉米花色素苷調節基因Lc插入載體，得到重組表達載體，並用所述的重組表達載體轉化水稻；(2)鑑定選取檢測結果為陽性的轉基因水稻；(3)選取幼穗穎花呈紅色或者抽穗後穎花花葯呈粉紅色的植株，即為不育水稻植株。本發明的方法為快速獲得不育水稻提供了新思路。
文檔編號C12Q1/68GK102649966SQ201210141599
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月8日 優先權日2012年5月8日
發明者宋亞娥, 張濤, 戴晴, 李建粵, 李源, 沈忠偉 申請人:上海師範大學