一種次級淋巴趨化因子slc的製備方法

2023-05-18 18:17:46

專利名稱：一種次級淋巴趨化因子slc的製備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥生物工程技術領域，是人次級淋巴趨化因子SLC的一種新的製備方法。
背景技術：
趨化因子是由一類結構上相關、功能上不同的小分子細胞因子(8-12KDa)組成的家族。它們在多種組織細胞和白細胞內表達。趨化因子在機體生理和病理狀況下，都起著重要的作用。在炎症、腫瘤、自身免疫病、血管生成、變態反應、幹細胞的分化、次級淋巴器官的發育、AIDS等病毒感染中均有趨化因子及受體的參與。至今已發現近50種趨化因子。絕大多數趨化因子的一級結構中有4個保守的半胱氨酸，根據半胱氨酸的數目和相對位置，按系統命名法將趨化因子分為四大亞家族CXC趨化因子，其前兩個半胱氨酸之間有一個其它的胺基酸相隔；CC趨化因子，前兩個半胱氨酸相鄰；C趨化因子，只有第二和第四位的兩個半胱氨酸；CX3C趨化因子，前兩個半胱氨酸被其它3個胺基酸隔開。有的亞家族若有多種趨化因子，則再根據被發現的先後進行編排。
最近發現一種次級淋巴趨化因子SLC(Secondary Lymphiod tissure Chemokine)也稱CCL21，其由111個胺基酸組成，胺基酸序列從N端至C端為SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSTPATLFLPRKRSQAELCADRKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPA QGCRKDRGASKTGKKGKCSK GCKRTERSQTPKGP。它是一種特殊的趨化因子，除了具有4個保守的半胱氨酸外，C末端還有2個半胱氨酸，研究證明，該趨化因子對新分離的和培養的T淋巴細胞以及成熟的樹突狀細胞有很強的趨化作用，還能指導髓祖先細胞的動員(Murphy P等人Pharmacological Reviews.2000，52(1)145-176)。製備方法國外有報導利用昆蟲細胞表達SLC(NagiraM等人The Journal Of BiologicalChemistry 1997.272，19518-19524)，他們將重組SLC注射到小鼠肺腫瘤實體內，有40％的腫瘤消失，顯示出SLC潛在的治療腫瘤效果，但是用昆蟲細胞表達的成本高，細胞培養繁鎖；國內已有單位用大腸桿菌表達SLC(王東寧等人生物工程學報2001 17(4)392-395)。而用大腸桿菌表達的產物，不易純化。

發明內容
本發明提供一種成本低廉、操作方便的次級淋巴趨化因子SLC的製備方法。所選用的表達系統為畢赤酵母，畢赤酵母表達系統容易操作，成本低，安全性高，能高密度發酵，產物易純化。
製備方法包括如下步驟一、構建SLC重組表達質粒PPIC9K/SLC1、合成引物正向引物為5′GGCTCGAGAAAAGAAGTGGAGGGGCTCAG3′反向引物為5′CCGAATTCCTATGGCCCTTTAGGGGTC3′上述引物的5′端分別引入XnoI和ECoRI酶切位點(橫線所示)；2、將上述引物以人肺cDNA庫為模板進行PCR擴增，得DNA片段，其中有含XhoI和EcoRI酶切位點的SLC DNA片段；3、將所得DNA片段和酵母載體PPIC9分別用XhoI和ECoRI酶切後，用T4DNA連接酶連接，經轉化和酶切及測序其重組質粒，獲得正確序列的SLC重組質粒PPIC9/SLC，再用BamHI/EcoRI酶切下0.6Kb片段，插入到載體PPIC9K的相應酶切位點，獲得重組表達質粒PPIC9K/SLC。
二、構建表達SLC的畢赤酵母工程菌GS115/PPIC9K/SLC將上述重組表達質粒PPIC9K/SLC用BgI II限制性內切酶進行線性化處理，並用電穿孔轉化畢赤酵母受體細胞GS115，經G418(新黴素相關氨基糖苷類抗生素)抗藥篩選，獲得工程菌GS115/PPIC9K/SLC。
三、製備SLC將酵母工程菌GS115/PPIC9K/SLC用BMGY培養基培養，再用BMM誘導培養基培養，離心後分別取上清液以及由上清液上柱純化得到的SLC洗脫液兩種樣品液進行除鹽，再分別測定活性，結果表明，發酵上清液及純化的SLC對從外周血分離到的T淋巴細胞均顯示出明顯趨化活性。


圖1重組表達質粒PPIC9K/SLC的構建流程圖
具體實施例方式本發明所用的載體PPIC9和PPIC9K購自Invitrogen公司，所用大腸桿菌宿主菌株TOP10和畢赤酵母宿主菌GS115也購自Invitrogen公司。具體操作步驟如下一、構建SLC重組表達質粒PPIC9K/SLC(見圖1)1、合成引物
為了從人肺cDNA庫中分離到次級淋巴趨化因子SLC基因片段，根據表達載體PPIC9K的克隆位點和SLC基因的結構設計一對引物，其正向引物和反向引物的5′端分別引進XhoI和ECoRI酶切位點(CTCGAG和GAATTC)，正向引物為5′GGCTCGAGAAAAGAAGTGGAGGGGCTCAG3′，反向引物為5′CCGAATTCCTATGGCCCTTTAGGGGTC3′。
2、PCR擴增以人肺cDNA庫為模板進行PCR擴增，其循環擴增的條件為94℃4分鐘；94℃45秒，58℃45秒，72℃2分鐘，30個循環；72℃10分鐘。擴增後的產物，經1％Agarose凝膠電泳分離純化。
3、構建重組質粒PPIC9K/SLC(詳見分子克隆分冊第二版)按常規將純化的PCR產物和載體PPIC9分別用XhoI/ECoRI進行雙酶切和純化，再用T4DNA連接酶進行連接，其連接反應後的混合液以CaCl2法轉化大腸桿菌TOP10。其轉化子的質粒DNA經XhoI/ECoRI酶切初步鑑定後，用AOXI的序列分析引物5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC3′進行核苷酸序列分析，獲得SLC基因序列正確的重組載體轉化子TOP10/PPIC9/SLC。由於表達載體PPIC9K含2個XhoI酶切位點，所以用BamHI/ECoRI分別對載體PPIC9K和PPIC9/SLC進行雙酶切，分別用1％Agaose凝膠電泳分離及純化。再將純化的PPIC9K大片段與PPIC9/SLC的小片段用T4DNA連接酶連接，以CaCl2法轉化大腸桿菌TOP10，經酶切鑑定，獲得的陽性重組子為含重組質粒PPIC9K/SLC的大腸桿菌。
二、構建表達SLC的畢赤酵母工程菌GS115/PPIC9K/SLC(詳見Invitrogtn的畢赤酵母表達操作手冊)取少量重組大腸桿菌(含PPIC9K/SLC質粒)種於3mlLB(含100μg/ml氨苄青黴素)培養基中，37℃培養過夜，以1％的接種量種於50mlLB(含100μg/ml氨苄青黴素)中，37℃培養14小時，按鹼法提取質粒DNA。該質粒DNA用BglII限制性內切酶進行線性化，用兩倍體積的乙醇沉澱DNA，離心後將線性化重組表達載體PPIC9K/SLC的DNA溶於無菌水中，最終濃度為0.4mg/μl，以電穿孔法轉化畢赤酵母菌GS115。GS115感受態細胞的製備如下取GS115單菌落種於5mlYEPD(酵母提取物1％，蛋白腖2％，葡萄糖2％)培養基中，28-30℃振蕩培養過夜，取15μl過夜培養物轉種於40mlYEPD中，繼續培養至OD600約1.3-1.6，離心(5000轉/分)收集菌體，分別用預冷的無菌水和1mol/L山梨醇各洗一次，用預冷的1mol/L山梨醇將菌體懸浮成200μl，取80μl菌體懸浮液與4μg/10μl線性化載體PPIC9K/SLC的DNA混勻，轉入預冷的0.2cm電擊杯(BioRad公司)中，在電擊儀上，設定電壓為1300V，電容為25μF，電阻為200Ω，進行電穿孔轉化，電轉化後，立即於電擊杯中加入0.9ml預冷的1mol/L山梨醇，取出全部的細胞液，塗於4塊MD平板上[1.34％YNB，(4×10-5)％生物素，2％葡萄糖，1mol/L山梨醇，2％瓊脂]，置於28-30℃培養至長出菌落。
由於PPIC9K/SLC重組載體含有細菌卡那黴素基因，線性化的SLC表達單元中仍含有卡那黴素基因，當它轉入酵母細胞後，能使酵母細胞對G418產生抗性，而對G418抗性程度大致取決於卡那黴素基因的整合數，因此可以通過不同濃度的G418來篩選多拷貝的轉化子。將轉化子用無菌牙籤點於含G418的YEPD平板，最終在G418濃度為1.5mg/ml平板上獲得10個GS115/PPIC9K/SLC克隆。三、SLC在畢赤酵母中的表達和純化及活性的測定1、SLC在畢赤酵母中的分泌表達分別取少量上述10個重組酵母轉化子和含空載體PPIC9K的GS115對照菌株種於50mlBMGY[1％酵母抽提物，2％蛋白腖，1.34％YNB，1％甘油，100mmol/L，PH6.0磷酸鉀緩衝液，(4×10-5％)生物素]培養基中，28℃振蕩培養至OD600約2-6，離心收集菌體，轉入20ml BMM[1％酵母抽提物，2％蛋白腖，1.34％TNB，0.5％甲醇，100mmol/LPH6.0磷酸鉀緩衝液，(4×10-5％)生物素]誘導培養基中，28-30℃振蕩培養3天，離心取上清經SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮蘭染色，10個SLC重組酵母轉化子都顯示一條深色的約12KD的蛋白帶，而對照菌株沒有這條帶，該蛋白帶就是重組SLC，說明這種畢赤酵母工程菌能高水平分泌表達SLC。
2、分離純化選上述10個克隆中表達SLC最好(電泳條帶顯色最深)的GS115/PPIC9K/SLC工程菌用同樣的方法進行發酵培養，將發酵液離心後取上清液，先對5mM Tris-Hcl PH8.0緩衝液進行透析，透析後的樣品以20mM Tris-Hcl PH8.0平衡的CM柱進行層析，用20mMTris-Hcl PH8.0+150mMNacl洗脫液進行洗脫，收集其洗脫峰，再經分子篩Superdex75柱分離，以20mM PBS PH8.0+150mMNacl洗脫，收集洗脫峰的蛋白樣品液。經SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮蘭染色，只見一條SLC的蛋白帶，表明SLC被純化。
3、SLC趨化活性的測定取枸櫞酸鈉抗凝的人外周血3ml，用Hanks液稀釋至5ml，然後將它緩慢加到有3ml淋巴分離液的離心管中，2000轉/分離心20分鐘，收集單個核細胞層的細胞，以Hanks液洗滌一次，用RPM1640培養基懸浮細胞，計數細胞濃度。取24孔細胞培養板，往孔內加500μl趨化樣品液，該樣品液為上述工程菌發酵後，離心所得上清液經G25膠除鹽，0.22μm膜過濾除菌處理所得，將Bodyman小室(美國BD公司)架於孔內，然後往小室內加入分離的單個核細胞30000個/200μl，將細胞置於37℃保溫4小時，收集培養板孔內的細胞，用細胞計數儀計算孔內的細胞數。同時將含空載體PPIC9K的GS115酵母菌發酵液的上清液，用同樣的方法處理，作為陰性對照。結果顯示該畢赤酵母工程菌發酵上清液中含有SLC，其對新分離外周血的淋巴細胞有明顯的趨化作用，趨化細胞數是陰性對照的5倍。發酵上清液經透析和柱層析純化後所得的SLC蛋白峰洗脫液採用同樣的方法測定SLC趨化活性，以PBS緩衝液為陰性對照。結果表明，純化的SLC蛋白樣品液對外周血分離的淋巴細胞有明顯的趨化活性，趨化細胞數量為陰性對照的5倍，說明本純化方法是切實可行的。本發明製備方法簡便，表達水平高，容易純化，成本低廉。
權利要求
1.一種次級淋巴趨化因子SLC的製備方法，包括構建SLC重組表達質粒、構建表達SLC的工程菌及工程菌表達SLC產物的純化，其特徵在於SLC的表達系統為畢赤酵母工程菌。
2.按權利要求1所述的次級淋巴趨化因子SLC的製備方法，其特徵在於構建的SLC重組表達質粒為PPIC9K/SLC。
3.按權利要求2所述的次級淋巴趨化因子SLC的製備方法，其特徵在於工程菌表達SLC產物純化採用CM陽離子交換柱及Superdex-75分子篩。
4.按權利要求1、2、3所述的次級淋巴趨化因子SLC的製備方法，其特徵在於所用的畢赤酵母菌為GS115細胞株，構建的表達SLC的畢赤酵母工程菌為GS115/PPIC9K/SLC。
5.權利要求1、2、3所述次級淋巴趨化因子SLC製備方法所製備的SLC用於製備抗腫瘤藥物的用途。
6.權利要求4所述次級淋巴趨化因子SLC製備方法所製備的SLC用於製備抗腫瘤藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及醫藥生物工程技術領域,是人次級淋巴趨化因子SLC的一種新的製備方法。本發明選用的表達系統為畢赤酵母表達系統,包括如下步驟:(1)合成正、反向引物,以人肺cDNA為模板進行PCR擴增,構建SLC重組表達質粒
文檔編號C12P21/02GK1422959SQ0215123
公開日2003年6月11日 申請日期2002年12月12日 優先權日2002年12月12日
發明者武聖明, 高卜渝, 袁漢英 申請人:武聖明, 高卜渝, 袁漢英