一種豬金屬硫蛋白的檢測方法

2023-05-18 17:59:56 1

專利名稱：一種豬金屬硫蛋白的檢測方法
技術領域：
本發明涉及動物金屬硫蛋白的檢測方法，具體的說，涉及一種豬金屬硫蛋白定性、定量的檢測方法。
背景技術：
金屬硫蛋白(MT)具有強烈的消除自由基的作用，可作為營養添加劑單獨使用或與穀胱甘肽(GSH)、維生素C(VC)、維生素E(VE)等配合使用，能夠有效地抑制脂質過氧化損傷、保護細胞、降低血液粘度、改善血液循環和提高機體免疫等多種生物學功能。金屬硫蛋白還可以作為一種抗氧化劑使用，防止食品或飼料氧化變質。另外，金屬硫蛋白能與許多金屬離子結合，參與機體金屬代謝調節，平衡機體金屬離子穩態，參與金屬離子運轉與排洩，對礦物質營養起著重要作用，同時鋅—金屬硫蛋白可作為評價動物體內鋅營養狀態的指標。金屬硫蛋白作為食品、飼料以及美容化妝品的添加劑和某些疾病的治療藥物在醫學、食品加工、營養學等各個領域業已廣泛應用。
含有鋅的金屬硫蛋白(Zn-MT)是一種正四面體金屬巰基螯合族，結晶構相相當穩定，在正常的動物體內均含有金屬硫蛋白。因此開展對金屬硫蛋白的檢測方法的研究有著重要的理論價值和廣闊的應用前景。
目前，學術界公認的檢測金屬硫蛋白的經典方法鎘—血紅蛋白飽和法，但該方法不能用於Bi、Hg、Ag、Cu結合的金屬硫蛋白的檢測，且其靈敏度不高，不能用於檢測正常生理狀態下動物體內各組織器官中的金屬硫蛋白的含量。用放射免疫分析法，實驗條件要求較高，且有放射性汙染，不能大幅度地推廣。有些學者也開始試用其它種類的酶聯免疫吸附法(ELISA)，但其結果重複性、穩定性和靈敏度都不如意，因此至今仍缺乏一種簡便、靈敏的檢測方法，不能滿足對金屬硫蛋白作進一步研究的需要。
由此可見，選擇一種方便、快捷、靈敏度高的定量檢測方法，就十分必要了。
另外，固相抗原間接競爭型酶聯免疫吸附法(固相抗原間接競爭型ELISA)是一種特異性強，靈敏度高，能定量檢測生物機體的微量活性有機物的一種理想方法，其工作原理為液相中的MT與孔壁上包被的固相MT相互競爭液相中的MT抗體，液相中的MT越多，則與固相MT結合的抗體越少，最終顯色越淺，設液相中MT含量為0時的顯色深度為100％，計算液相中含不同濃度MT時的顯色百分比作為橫坐標，以液相中MT含量為縱坐標，則可製得間接競爭型ELISA標準曲線。

發明內容
本發明的目的就在於克服現有定量檢測動物金屬硫蛋白方法的不足，開闢一種新的檢測方法，即提供一種豬金屬硫蛋白的檢測方法，該方法能定量檢測處於正常生理狀態下豬體內各組織器官金屬硫蛋白的含量。
本發明的技術方案是採用達到電泳純的、從小鼠抗豬血清中分離純化出抗金屬硫蛋白的免疫球蛋白(IgG)，通過固相抗原間接競爭型酶聯免疫吸附法(固相抗原間接競爭型ELISA)的步驟來完成對正常生理狀態下豬各組織器官內的金屬硫蛋白的定性、定量檢測工作。
具體地說，本發明是用達到電泳純的小鼠抗豬金屬硫蛋白IgG作一抗，用山羊抗小鼠酶標抗體作二抗，採用固相抗原間接競爭型酶聯免疫吸附法，測定豬金屬硫蛋白的含量；其步驟如下①包被——加含標準品金屬硫蛋白MT的包被液即碳酸鈉緩衝液90-110μl/孔，3-5℃包被過夜；取出，每孔加洗滌液即含0.050％tween-20的磷酸緩衝液240-260μl，靜置2.5-3.5min，洗滌3-5次；②封閉——每孔加封閉液即含10.00％新生牛血清的磷酸緩衝液180-220μl，36.9-37.5℃封閉1.5-2.5hr，以轉速40-60轉/分振蕩，並以不振蕩出孔內溶液為限，取出，每孔加洗滌液240-260μl，靜置2.5-3.5min，洗滌3-5次；
③加一抗即抗豬金屬硫蛋白IgG與樣品——將等量的含抗體和標準品或待測品的稀釋液即含0.050％tween-20和0.150％牛血清白蛋白的磷酸緩衝液混合均勻後，加混合液90-110μl/孔，同一樣品重複2-3孔，36.9-37.5℃反應2.5-3.5hr，以轉速40-60轉/分振蕩，並以不振蕩出孔內溶液為限，取出，每孔加洗滌液240-260μl，靜置2.5-3.5min，洗滌3-5次；④加酶標二抗——加稀釋好的辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠二抗90-110μl/孔，35-39℃反應1.8-2.2hr，以轉速40-60轉/分振蕩，並以不振蕩出孔內溶液為限，取出，每孔加洗滌液240-260μl，靜置2.5-3.5min，洗滌3-5次；⑤加底物——加TMB底物90-110μl/孔，36.9-37.5℃反應18-22min，以轉速40-60轉/分振蕩，並以不振蕩出孔內溶液為限；⑥加反應終止液——加H2SO4溶液45-55μl/孔；⑦在酶標儀上450nm波長讀數。
本發明具有以下優點和積極效果①可以定性、定量檢測在正常生理狀態下豬體內各組織器官的金屬硫蛋白；②能方便、快捷、有效地進行大量樣品的測試，不需要特殊的儀器設備，又避免放射性汙染，可以在一般的生理生化實驗室中進行；③測定結果靈敏度高，其靈敏度達4.1ng/ml；而且穩定性和重複性好。
④由於小鼠是一種非常普遍的實驗動物，成本較低，取材容易，可以進行大批量的金屬硫蛋白抗體的製備，使得該方法具有實用性強的特點。
具體實施例方式
下面結合具體實施例詳細說明1、檢測①豬血漿樣品的製備通過肝門靜脈血管插管抽取肝門靜脈血液9-11ml，用10％EDTA-Na作為抗凝劑，離心20min，3000rpm，4℃，分裝血漿放入-70℃保存，待測；豬組織器官樣品的製備豬肝臟、腎臟、肌肉稱重後，按1/4的量加入含有0.25mol/l蔗糖的Tris-HCl緩衝液(0.1mol/l，pH8.6)，勻漿，離心20min(8000rpm，4℃)，取上清液分裝，放入-70℃保存，待測；②包被標準品MT用包被緩衝液(pH＝9.6)稀釋成濃度為6.25μg/ml，於酶標板中加包被液100μl/孔，蓋好後用封口膜密封，放入4℃條件下過夜(16-24hr)，取出，每孔加洗滌液250μl，靜置3min，洗滌4次；③封閉每孔加封閉液(含10％新生牛血清的PBST pH為7.4)200μl，37℃封閉2hr，以轉速50轉/分振蕩，注意不振蕩出孔內溶液為限，取出，每孔加洗滌液250μl，靜置3min，洗滌4次；④加一抗與待測樣品用稀釋液(PBST pH為7.4)將一抗配成濃度50μg/ml，分別與稀釋8倍的豬肝、豬腎、肌肉及血漿樣品，等量混合均勻，然後每孔加混合液100.00μl，同一樣品重複2-3孔，37℃反應3hr，以轉速40-60轉/分振蕩，注意不振蕩出孔內溶液為限，取出，每孔加洗滌液250μl，靜置3min，洗滌4次；⑤加酶標二抗稀釋液(含1.5％牛血清白蛋白的PBST pH為7.4)將辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠二抗稀釋8000倍，加100μl/孔，37℃反應2hr，以轉速40-60轉/分振蕩，注意不振蕩出孔內溶液為限，取出每孔加洗滌液250μl，靜置3min，洗滌4次；⑥加底物加TMB底物(其濃度為含TMB為0.2mg/ml)100μl/孔，37℃反應20min(以轉速40-60轉/分振蕩，注意不振蕩出孔內溶液為限)；⑦加終止液加濃度為2mol/l H2SO4的50μl/孔；⑧在酶標儀上450nm波長讀數；根據標準曲線得出的回歸方程y＝105×2(22.32880-0.39583x)，其中x代表(OD450nm/0.982)×100(0.982為MT的量為0時所對應的OD450nm)，y代表MT的量，單位為ng/ml；計算出金屬硫蛋白的含量；最後測定金屬硫蛋白的含量分別為豬肝0.13699±0.026686mg/g；腎臟0.308929±0.154568mg/g；肌肉69.6986±32.8346ng/g；血漿10.81385±3.12627ng/ml。
2、配製
①包被緩衝液的配製NaHCO32.300-2.304g；Na2CO31.590-1.594-g；NaN30.200-0.204g，雙蒸水溶解定容1000ml，調pH值為9.60-9.62。
②洗滌液的配製為Na2HPO4·12H2O2.900-2.904g；K H2PO40.200-0.204g；KCl0.200-0.204g；NaN30.200-0.204g；NaCl8.000-8.004g，高壓滅菌後加雙蒸水溶解，再加Tween-200.500-0.504ml，定容至1000ml調pH為7.40-7.42。
③封閉液的配製為Na2HPO4·12H2O0.2900-0.2904g；K H2PO40.0200-0.0204g；KCl0.0200g；NaN30.0200-0.0204g；NaCl0.8000-0.8004g，高壓滅菌後加雙蒸水溶解，再加新生牛血清10.00-10.04ml，定容至100ml調pH為7.40-7.42，放入3-5℃保存。
④樣品製備緩衝液的配製為Tris1.2110-12114g；濃HCl(12mol/L)0.200-0.204ml，加雙蒸水溶解後，加蔗糖8.5500-8.5504g，溶解定容至100ml，調pH為8.60-8.62。
⑤稀釋液的配製為(PBST pH為7.4)Na2HPO4·12H2O0.2900-0.2904g；K H2PO40.0200-0.0204g；KCl0.0200-0.0204g；NaCl0.8000-0.8004g，高壓滅菌後加雙蒸水溶解，再加Tween-200.050-0.054ml，牛血清白蛋白1.5000-1.5004g，定容至100ml調pH為7.40-7.42，放入3-5℃保存。
⑥底物液的配製為取底物貯存液200ul和等量的0.25％H2O2(新鮮配置)，混合均勻後，再與10.0ml底物緩衝液混勻；其中，底物貯存液的配製方法為在1.00ml二甲亞礬中加入10mg3，3，5』5』-四甲基聯苯胺(TMB)溶解後放入4-8℃保存；底物緩衝液的配製方法為Na2HPO4·12H2O7.1640-7.1644g；檸檬酸2.1000-2.1004g，雙蒸水溶解定容100ml，調pH值為5.00-5.04。
⑦反應終止液的配製為濃H2SO411ml，溶於雙蒸水中，定容至100ml。
權利要求
1.一種豬金屬硫蛋白的檢測方法，包括固相抗原間接競爭型酶聯免疫吸附法；其特徵在於用達到電泳純的小鼠抗豬金屬硫蛋白IgG作一抗，用山羊抗小鼠酶標抗體作二抗，採用固相抗原間接競爭型酶聯免疫吸附法，測定豬金屬硫蛋白的含量；其步驟如下①包被——加含標準品金屬硫蛋白MT的包被液即碳酸鈉緩衝液90-110μl/孔，3-5℃包被過夜；取出，每孔加洗滌液即含0.050％tween-20的磷酸緩衝液240-260μl，靜置2.5-3.5min，洗滌3-5次；②封閉——每孔加封閉液即含10.00％新生牛血清的磷酸緩衝液180-220μl，36.9-37.5℃封閉1.5-2.5hr，以轉速40-60轉/分振蕩，並以不振蕩出孔內溶液為限，取出，每孔加洗滌液240-260μl，靜置2.5-3.5min，洗滌3-5次；③加一抗即抗豬金屬硫蛋白IgG與樣品——將等量的含抗體和標準品或待測品的稀釋液即含0.050％tween-20和0.150％牛血清白蛋白的磷酸緩衝液混合均勻後，加混合液90-110μl/孔，同一樣品重複2-3孔，36.9-37.5℃反應2.5-3.5hr，以轉速40-60轉/分振蕩，並以不振蕩出孔內溶液為限，取出，每孔加洗滌液240-260μl，靜置2.5-3.5min，洗滌3-5次；④加酶標二抗——加稀釋好的辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠二抗90-110μl/孔，35-39℃反應1.8-2.2hr，以轉速40-60轉/分振蕩，並以不振蕩出孔內溶液為限，取出，每孔加洗滌液240-260μl，靜置2.5-3.5min，洗滌3-5次；⑤加底物——加TMB底物90-110μl/孔，36.9-37.5℃反應18-22min，以轉速40-60轉/分振蕩，並以不振蕩出孔內溶液為限；⑥加反應終止液——加H2SO4溶液45-55μl/孔；⑦在酶標儀上450nm波長讀數。
2.按權利要求1所述的一種豬金屬硫蛋白的檢測方法，其特徵在於包被緩衝液的配製為NaHCO32.300-2.304g；Na2CO31.590-1.594-g；NaN30.200-0.204g，雙蒸水溶解定容1000ml，調pH值為9.60-9.62。
3.按權利要求1所述的一種豬金屬硫蛋白的檢測方法，其特徵在於洗滌液的配製為Na2HPO4·12H2O2.900-2.904g；KH2PO40.200-0.204g；KCl0.200-0.204g；NaN30.200-0.204g；NaCl8.000-8.004g，高壓滅菌後加雙蒸水溶解，再加Tween-200.500-0.504ml，定容至1000ml調pH為7.40-7.42。
4.按權利要求1所述的一種豬金屬硫蛋白的檢測方法，其特徵在於封閉液的配製為Na2HPO4·12H2O0.2900-0.2904g；KH2PO40.0200-0.0204g；KCl0.0200g；NaN30.0200-0.0204g；NaCl0.8000-0.8004g，高壓滅菌後加雙蒸水溶解，再加新生牛血清10.00-10.04ml，定容至100ml調pH為7.40-7.42，放入3-5℃保存。
5.按權利要求1所述的一種豬金屬硫蛋白的檢測方法，其特徵在於樣品製備緩衝液的配製為Tris1.2110-12114g；12mol/L的濃HCl0.200-0.204ml，加雙蒸水溶解後，加蔗糖8.5500-8.5504g，溶解定容至100ml，調pH為8.60-8.62。
6.按權利要求1所述的一種豬金屬硫蛋白的檢測方法，其特徵在於稀釋液的配製為Na2HPO4·12H2O0.2900-0.2904g；KH2PO40.0200-0.0204g；KCl0.0200-0.0204g；NaCl0.8000-0.8004g，高壓滅菌後加雙蒸水溶解，再加Tween-200.050-0.054ml，牛血清白蛋白1.5000-1.5004g，定容至100ml調pH為7.40-7.42，放入3-5℃保存。
7.按權利要求1所述的一種豬金屬硫蛋白的檢測方法，其特徵在於底物液的配製為取底物貯存液200ul和等量的0.25％H2O2(新鮮配置)，混合均勻後，再與10.0ml底物緩衝液混勻；其中，底物貯存液的配製方法為在1.00ml二甲亞礬中加入10mg3，3，5』5』-四甲基聯苯胺(TMB)溶解後放入4-8℃保存；底物緩衝液的配製方法為Na2HPO4·12H2O7.1640-7.1644g；檸檬酸2.1000-2.1004g，雙蒸水溶解定容100ml，調pH值為5.00-5.04。
8.按權利要求1所述的一種豬金屬硫蛋白的檢測方法，其特徵在於反應終止液的配製為濃H2SO411ml，溶於雙蒸水中，定容至100ml。
全文摘要
本發明公開了一種豬金屬硫蛋白的檢測方法，涉及動物金屬硫蛋白的檢測方法，具體地說，涉及一種豬金屬硫蛋白定性、定量檢測的方法。本發明是用達到電泳純的小鼠抗豬金屬硫蛋白IgG作一抗，用山羊抗小鼠酶標抗體作二抗，採用固相抗原間接競爭型酶聯免疫吸附法，測定豬金屬硫蛋白的含量；其步驟有①包被；②封閉；③加一抗與樣品；④加酶標二抗；⑤加底物；⑥加終止液；⑦在酶標儀上450nm波長讀數。本發明可以定性、定量檢測在正常生理狀態下豬體內各組織器官的金屬硫蛋白；方便、快捷，靈敏度高，穩定性和重複性好；成本較低，取材容易，實用性強。
文檔編號G01N33/543GK1619309SQ20041006126
公開日2005年5月25日 申請日期2004年12月3日 優先權日2004年12月3日
發明者張彬, 吳力專, 李麗立 申請人:湖南農業大學