抗PD‑L1蛋白單克隆抗體及其用途的製作方法

2023-05-18 12:42:56 1

本發明涉及生物技術領域，具體涉及可特異結合pd-l1蛋白的單克隆抗體or-5e3、產生所述單克隆抗體的細胞株及應用該抗體用於診斷的方法和用途。

背景技術：

程序性細胞死亡因子1配體1(processeddeath-1ligand1，pd-l1)又稱為b7-h1、cd274，是由cd274基因編碼的一個抑制性共刺激分子，是dong等於1999年從人類基因庫中搜尋b7.1和b7.2免疫球蛋白可變區及恆定區同源分子時在胎盤cdna文庫中發現並確認的。pd-l1屬i型跨膜糖蛋白,有290個胺基酸,包括胞外區、疏水跨膜區和尾部胞漿區。pd-l1蛋白則廣泛表達於淋巴細胞,如活化t和b細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、胸腺內皮細胞等細胞以及心臟和胎盤等部位，同時也在多種腫瘤細胞及腫瘤微環境中的免疫細胞中高表達，如肺癌、乳腺癌、食管癌、淋巴瘤等。

pd-l1在免疫調節中扮演著更關鍵的角色。腫瘤細胞表達的pd-l1與表達在活化t細胞上的負性共刺激分子pd-1結合，可抑制t細胞增殖，並促進活化t細胞的凋亡。近年來，大量的研究表明pd-l1可以作為一種重要的分子標誌物在各種腫瘤中的靶向治療和預後診斷中發揮著重要的作用。

目前臨床上通常用免疫組織化學(immunohistochemistry,ihc)實驗檢測腫瘤組織內腫瘤細胞中pd-l1的表達狀況，其實驗方法的核心為特異性結合pd-l1的單克隆抗體，其性能的優劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研製出一種靈敏度較高的特異性針對pd-l1蛋白的單克隆抗體具有重要的意義。

技術實現要素：

有鑑於此，本發明的目的在於提供一種結合特異性較高的pd-l1蛋白的單克隆抗體，及其在製備用於檢測pd-l1蛋白的免疫檢測工具中的應用。

本發明提供了一種雜交瘤細胞株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為cgmcc)，保藏日期為2017年4月7日，保藏編號為cgmccno.13826。

本發明還提供了一種特異性結合pd-l1蛋白的單克隆抗體or-5e3，由上述雜交瘤細胞株產生。

本發明所述單克隆抗體的製備方法如下：

(1)單克隆抗體的篩選與製備：採用化學合成pd-l1胞內區多肽片段260-290aa(杭州中肽生化有限公司)免疫紐西蘭大白兔(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，取兔脾臟細胞與240e兔骨髓瘤樣細胞株進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，elisa法篩選陽性雜交瘤細胞，獲得能分泌抗pd-l1特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為or-5e3，亞型鑑定為igg；通過無血清培養基製備抗體，通過親和層析柱純化獲得pd-l1單克隆抗體。通過免疫組化實驗驗證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

進一步採用origene高密度蛋白晶片對上述單克隆抗體的特異性進行驗證：

origene高密度蛋白晶片上包含10,000個hek293t細胞蛋白過表達裂解物(不包含pd-l1蛋白)，每種蛋白裂解液在晶片上具有兩個拷貝的重複。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鍾蛋白裂解液的定位可以通過excel文件進行準確定位。蛋白晶片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個晶片點上蛋白的含量，監控每次免疫反應數據的重複性，以及定位陽性信號的方向。

本發明將所述單克隆抗體or-5e3與上述晶片雜交並確定陽性信號位點，結果顯示：本發明所述單克隆抗體or-5e3特異性結合pd-l1蛋白，而與其他蛋白無交叉反應。

本發明還提供了單克隆抗體or-5e3在製備用於檢測pd-l1蛋白的免疫檢測工具中的應用。

具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、晶片或試紙。

在具體的實施例中，本發明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體or-5e3，可檢測免疫細胞以及腫瘤細胞中pd-l1的表達狀況。

本發明還提供了上述單克隆抗體在製備用於檢測免疫細胞以及腫瘤細胞中pd-l1蛋白水平的試劑盒中的應用。

其中所述腫瘤具體包括但不限於淋巴瘤、肺癌、肝癌、結直腸癌、黑色素瘤、腎癌和乳腺癌等。

與現有技術相比，本發明提供了一種雜交瘤細胞株(保藏編號為cgmccno.13826)，以及由此雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體or-5e3。本發明還提供了單克隆抗體or-5e3在製備用於檢測pd-l1蛋白的免疫檢測工具中的應用，含單克隆抗體or-5e3的免疫組化檢測試劑盒，以及單克隆抗體or-5e3在製備用於標記免疫細胞以及腫瘤細胞中pd-l1蛋白水平的試劑盒中的應用。本發明所述單克隆抗體與晶片上10000種其他蛋白無交叉反應，顯著提高了pd-l1蛋白免疫檢測的特異性和可靠性，廣泛適用於各種樣本的免疫細胞以及腫瘤細胞中pd-l1的檢測。

保藏信息

用於保藏的雜交瘤細胞株or-5e3的分類命名為：兔抗人程序死亡因子1配體1(pd-l1)單克隆雜交瘤細胞株；

保藏單位全稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；

保藏單位簡稱：cgmcc；

保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；

保藏日期：2017年4月7日；

保藏編號：cgmccno.13826。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實施例2pd-l1單克隆抗體or-5e3在pd-l1陽性細胞上的ihc檢測結果圖，以or-5e3檢測瞬時轉染pd-l1質粒的hek293t細胞中pd-l1蛋白的表達，左圖為轉染空載體的hek293t細胞的ihc檢測結果，右圖為轉染pcmv6-pd-l1質粒的hek293t細胞的ihc檢測結果(一抗為pd-l1單克隆抗體or-5e3，1:100)；

圖2示實施例2胎盤組織免疫組化檢測結果圖(一抗為pd-l1單克隆抗體or-5e3，1:100)；

圖3示實施例2肺癌組織免疫組化檢測結果圖(一抗為pd-l1單克隆抗體or-5e3，1:100)；

圖4示實施例2黑色素瘤組織免疫組化檢測結果圖(一抗為pd-l1單克隆抗體or-5e3，1:100)；

圖5示實施例3origene蛋白晶片鑑定結果圖(一抗為pd-l1單抗or-5e3,1:100；二抗為alexa647-標記的驢抗兔igg，1:500)。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

實施例1、pd-l1單克隆抗體的製備與篩選

根據標準方法用購買於杭州中肽生化有限公司的化學合成pd-l1胞內區多肽片段260-290aa(以下簡稱pd-l1抗原)對紐西蘭大白兔(北京維通利華實驗動物技術有限公司)進行免疫。具體方法如下：

1、動物免疫：pd-l1抗原以完全弗氏佐劑乳化，採用皮下注射方法免疫6-8周齡紐西蘭大白兔，免疫劑量為500μg/只，間隔兩周後進行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為250μg/只。免疫兩次後取血以elisa法梯度稀釋測定血清效價；根據結果確定是否加強免疫，選取抗體效價最高的兔進行細胞融合。

2、細胞融合：骨髓瘤細胞採用紐西蘭大白兔來源的240e兔骨髓瘤樣細胞株，融合時處於對數生長期；取已免疫兔脾臟，製成淋巴細胞單細胞懸液；兔脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞以1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培養基及其餘終止液，離心棄上清後加入hat培養基懸浮混勻，mc定容到50ml，分裝到3.5cm培養皿中，放於溼盒中，置於37℃、5％co2恆溫培養箱中進行培養。

3、篩選和克隆：融合7-10天內挑選細胞克隆，使用pd-l1抗原進行elisa測試。標記細胞株號。對陽性孔細胞進行有限稀釋，每次有限稀釋後5-6天測定elisa值，挑取od280陽性值較高的單克隆孔進行有限稀釋，直至elisa測定96孔板全板結果為陽性。挑取陽性值高的單克隆定株。其對應融合板細胞株為or-5e3。

4、細胞上清單抗的製備與純化：將細胞株or-5e3用含15％血清的dmem培養基培養於10cm培養皿中培養，擴培至約4×107個時，800rpm離心5min，棄上清並將細胞轉移到2l轉瓶中，加入無血清培養基，使細胞密度約為3×105個/ml。繼續培養1～2周後，當細胞死亡率達到60％-70％時(此時細胞密度大概為1-2×106個/ml)，收取細胞懸液6000rpm高速離心20min，取上清，親和層析法進行上清純化，根據抗體壓型選擇相應柱料，單抗or-5e3亞型為igg1，採用proteing進行純化。純化後的單抗濃度測定、分裝(100ul/管，濃度為1mg/ml)、保存在4-8℃。

實施例2、pd-l1單克隆抗體or-5e3為一抗的免疫組化檢測

(1)、實驗方法：

1、分別取過表達空載體和pd-l1質粒的293t細胞、胎盤、肺癌和黑色素瘤組織塊進行石蠟包埋，使用sakura組織切片機進行切片，組織厚度為4μm。

2、脫蠟與水化：分析純二甲苯3×10min，無水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去離子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修復液(1mmedta,ph9.0的10mmtris-hcl緩衝液)高壓鍋高壓熱修復2.5min，待高壓鍋溫度降至約90℃時，打開高壓鍋，取出標本，然後自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3min×3次。

4、使用3％過氧化氫滅活組織內源性過氧化物酶，室溫靜置10min。去離子水浸泡5min×3次。

5、加上封閉液(pbs+5％脫脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封閉液，勿衝洗，加入pd-l1單抗(or-5e3)，稀釋比：1:100，使用封閉液進行稀釋。置於溼盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗滌2次，每次洗滌5min。pbst(0.02％tween-20)洗滌1次，每次洗滌5min。

7、滴加聚合物hrp染色試劑盒中試劑pv8000(購於北京中杉金橋公司，catlogno.pv-8000)，37℃孵育15分鐘。使用pbs洗滌3次，每次5min。

8、應用dab溶液(中杉金橋zli-9019)顯色，顯色3～10min。蒸餾水洗滌。

9、蘇木精復染細胞核2min，蒸餾水漂洗，1％鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置1min。

10、脫水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性樹膠封片。

11、鏡檢，見圖1、圖2、圖3和圖4。

(2)、實驗結果：

由圖1結果可見，pd-l1蛋白在過表達pd-l1質粒的293t細胞中呈特異性細胞膜和細胞質表達，而在過表達空載體的293t細胞中無特異性著色。

由圖2結果可見，pd-l1蛋白在胎盤組織中滋養層細胞呈特異性細胞膜和細胞質表達。

由圖3結果可見，pd-l1蛋白在肺癌組織中的腫瘤細胞呈特異性細胞膜和細胞質表達。

由圖4結果可見，pd-l1蛋白在黑色素瘤組織中的腫瘤細胞呈特異性細胞膜和細胞質表達。

結果表明本發明所述的單克隆抗體or-5e3能夠特異性識別胎盤、肺癌和黑色素瘤組織中的pd-l1蛋白。

實施例3、單克隆抗體or-5e3的特異性蛋白晶片檢測

origene高密度蛋白晶片上包含10,000個hek293t細胞蛋白過表達裂解物(不含有pd-l1蛋白)，每種蛋白裂解液在晶片上具有兩個拷貝的重複。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鍾蛋白裂解液的定位可以通過excel文件進行準確定位。蛋白晶片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個晶片點上蛋白的含量，監控每次免疫反應數據的重複性，以及定位陽性信號的方向。以下為使用origene蛋白(origenecatpa100001)晶片進行or-5e3抗體鑑定實驗的實驗方法：

1、將一張蛋白晶片放在50ml離心管中，使用40ml去離子水浸潤晶片，置於搖床上，室溫混合30分鐘。棄掉去離子水，使用10mlpbst平衡晶片。室溫處理10分鐘。

2、向50ml離心管中加入40ml5％脫脂牛奶(用pbst進行稀釋)置於搖床上，室溫封閉30分鐘。

3、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋一抗or-5e3，稀釋比列為1：100。

4、將潔淨的封口膜粘貼到實驗臺上，滴加250-300μl一抗在封口膜上。

5、將蛋白晶片從封閉液中抽出，將蛋白晶片nc膜的一面朝下，從晶片的一邊接觸抗體，慢慢滑下，依靠液體表面張力，抗體將慢慢浸潤晶片nc膜，直至整張nc膜浸潤在一抗溶液中。整個操作過程避免產生氣泡。將晶片移到4℃環境下，靜置，一抗孵育過夜。在晶片上加蓋培養皿蓋，其上黏附一張溼紙巾，以防止長時間孵育導致抗體蒸發。

6、第二天將晶片移至50ml離心管中，使用pbst漂洗晶片兩次，去除多餘的抗體。使用40mlpbst(0.1％tween-20)洗滌晶片，置於搖床上混合均勻，洗滌三次，每次洗滌5min。

7、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋二抗alexa647-標記的驢抗兔igg，稀釋比例為1：500。

8、按照上述步驟4，步驟5進行二抗孵育操作。室溫孵育1小時。在晶片上方用鋁箔紙遮蓋，以防止發生信號漂白。

9、按照上述步驟6，使用pbst洗滌晶片。

10、使用去離子水衝洗晶片，以去除殘餘的鹽分和變性劑。

11、室溫乾燥晶片，確保晶片完全乾燥。

12、使用晶片掃描儀讀取螢光信號。

13、根據bsa-cy3以及bsa-cy5確定晶片方向以及陽性信號的位點。

14、根據陽性信號位點找出對應蛋白裂解液id，根據裂解液資料庫信息，查找到對應蛋白名稱，ncbi錄入號(accessionnumber)，蛋白id，蛋白大小等信息。結果見圖5。

圖5結果顯示，在蛋白晶片上所有蛋白都不與抗體or-5e3結合，表明本發明所述抗體or-5e3具有一定的特異性。