一種新型重組腺病毒及其在惡性腫瘤治療中的應用的製作方法

2023-05-18 12:44:06 3

專利名稱：一種新型重組腺病毒及其在惡性腫瘤治療中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及一種表達人表皮生長因子受體(EGFR)反義RNA的重組腺病毒及其在惡性腫瘤治療中的應用。
惡性腫瘤隨著人口老齡化和社會工業化程度的提高而上升，在發達國家及我國一些大城市已成為第一、二位致死性疾病。雖然外科手術、放療及化療作為惡性腫瘤的常規治療手段仍在不斷發展，但常不能治癒腫瘤，且其療效已基本達到極限，因而迫切需要開發新的治療手段。基因治療在基因水平上對治療疾病，近年來逐步成熟，國際上已廣泛進入臨床試驗，是一種很有發展前景的治療手段。研究表明，惡性腫瘤的發生是環境因素與遺傳因素相互作用，導致基因變異所產生的效果積累起來的結果。腫瘤的基因治療就是以一定的基因轉移方法將外源遺傳物質轉移到腫瘤細胞中，達到治療腫瘤的目的。目前國際上被批准的基因治療研究中60％以上針對惡性腫瘤，所涉及的基因範圍和治療策略很廣泛，可分為免疫治療、直接殺滅或抑制腫瘤細胞、改善腫瘤化療療效及抗腫瘤血管生成幾方面。
EGFR為一170kD大小具有酪氨酸激酶活性的膜受體，由1186個胺基酸殘基組成，其中621個胺基酸組成胞外區，23個胺基酸構成的跨膜區，剩餘的542個胺基酸構成胞內區。在實驗研究中，EGFR的超量表達可使正常細胞轉化為惡性細胞，而且這種轉化取決於表皮生長因子受體數量，並同時伴隨著其配體的表達。EGFR的表達在如肺、頭頸、消化道、泌尿生殖道等多種表皮來源惡性腫瘤和最常見的腦瘤一膠質瘤的發生與發展中起著重要作用(Ciardiello F，Tortora G.Clin Cancer Res，2001，72958-2970；Slichenmyer WJ，Fry DW.Semin Oncol，2001，28(suppl 16)67-79)，不但是很多惡性腫瘤的不良愈後因素，而且伴隨著腫瘤放療抗拒能力的提高(Pawlowski V，et al.Clin Cancer Res，2000，64217-4225；AkimotoT，et al.Clin Cancer Res，1999，52884-2890)。因而EGFR作為腫瘤治療的新靶點倍受關注。
針對EGFR有單克隆抗體、特異性酪氨酸激酶抑制劑等多種抑制手段。反義(antisense)戰略也是其中之一，其特點為直接作用於靶基因mRNA，有特異性強、效率高、毒副作用小等優點。但存在的問題是傳統的反義寡核苷酸難以有效地通過細胞膜進入細胞內發揮作用，嚴重地阻礙了此技術用於體內實驗及其進一步的潛在臨床應用(Ma L，Calvo F.FundamClin Pharmacol，1996，597-115)。發明人曾以EGFR反義RNA表達載體轉染乳腺癌細胞，發現對腫瘤生長的抑制可達80％以上(Ma L，et al.Int J Cancer，1998，78112-119)。本發明所涉及的表達EGFR反義RNA的重組腺病毒將反義戰略特異性強、效率高、毒副作用小的優點與腺病毒對上皮性惡性腫瘤細胞的高感染效率的特點相結合，避免了反義寡核苷酸的弱點。
本發明具體實施方案如下1.將在巨細胞病毒(CMV)立即-早期啟動子驅動下的反向人EGFRA64-1 cDNA片段(Ullrich A，et al.Nature，.1984，309418-425)及聚腺苷酸化信號序列重組進E1區和E3區缺失的Ad5腺病毒載體中獲得重組腺病毒。發明人曾以含有同一EGFR反義RNA表達盒的真核細胞表達質粒轉染乳腺癌細胞後，將腫瘤細胞的體內生長抑制80％以上(Ma L，et al.Int JCancer，1998，78112-119)。因為E3區編碼蛋白抑制細胞毒性T細胞介導的免疫反應及細胞因子介導的凋亡，所以為了不降低基因治療的療效而選擇了E3區缺失的腺病毒載體(Windheim M，et al.Curr Top Microbiol Immunol，2004，27329-85)。
2.觀察到重組腺病毒可有效地進入腫瘤細胞。
3.觀察到EGFR反義RNA在腫瘤細胞中表達。
4.觀察到EGFR蛋白在腫瘤細胞和人微血管內皮細胞中的表達被抑制。
5.觀察到腫瘤細胞的體外和體內生長以及人微血管內皮細胞的體外生長被抑制。
6.觀察到重組腺病毒誘導腫瘤細胞凋亡的作用。
7.觀察到重組腺病毒對腫瘤新生血管的抑制作用。
8.觀察到重組腺病毒增強放射線殺傷腫瘤細胞的作用。
本發明提供一種表達EGFR反義RNA的重組腺病毒，不但可以以液體形式被配成注射液、滴液、噴霧液、塗抹液等用於惡性腫瘤或惡性腫瘤術後瘤床的治療，還可與其他非手術療法聯合應用，其腫瘤類型可以是乳腺癌，非手術療法可以是放療。實施例將通過EGFR反義重組腺病毒對乳腺癌的基因治療作用進一步闡述本發明。
由於EGFR在多種惡性腫瘤的發生和發展中起著關鍵作用，若本發明得以應用，不但將為腫瘤治療提供一種新的治療策略，而且具有廣泛的臨床應用價值。
結合附圖進一步說明本發明

圖1.EGFR反義重組腺病毒AdE5的構建圖2.以RNA酶保護實驗檢測感染了AdE5重組腺病毒的MDA-MB-231細胞(1)，感染了AdE5(2)、AdCO1(3)或PBS處理(4)的MDA-MB-468細胞中EGFR反義RNA的表達。EGFR反義RNA片段被EGFR正義核酸探針保護(箭頭)。以GAPDH反義核酸探針保護GAPDH RNA片段作為內對照。
圖3.以Western印跡雜交實驗檢測10μg(MDA-MB-468細胞)及25μg(MDA-MB-231或HMEC-1細胞)全細胞蛋白中EGFR的表達水平。
圖4.(A)重組腺病毒對體外貼壁生長的MDA-MB-468細胞增殖的影響。(B)EGF及重組腺病毒對體外貼壁生長的HMEC-1細胞增殖的影響。
圖5.AdE5抑制乳腺癌細胞的體內生長。(A)MDA-MB-481腫瘤，(B)MDA-MB-231腫瘤(每組10隻裸鼠)。
圖6.重組腺病毒感染MDA-MB-468細胞後檢測聚(ADP-核糖)聚合酶活性。
圖7.TUNEL實驗檢測重組腺病毒對體外生長的MDA-MB-468細胞(A～E)及腫瘤細胞凋亡的誘導(F～G)。(A)無病毒，(B)AdCO1 50pfu/細胞，(C)AdCO1 100pfu/細胞，(D)AdE550pfu/細胞，(E)AdE5 100pfu/細胞。(F)AdCO1，(G)AdE5 109pfu/腫瘤。(×10)圖8.腫瘤內(A)PBS(n＝5)，(B)AdCO1(n＝3)，(C)AdE5(n＝4)注射後MDA-MB-231腫瘤新生血管研究。新生血管採用抗肌動朊抗體標記成棕色(×10)。
圖9.以MDA-MB-231細胞克隆形成實驗研究AdE5對γ射線的增敏作用。A.重組腺病毒劑量為150pfu/細胞；B.重組腺病毒劑量為300pfu/細胞。
圖10.以γ射線聯合重組腺病毒對MDA-MB-231細胞周期分布的影響。
實施例EGFR反義重組腺病毒及其對乳腺癌的基因治療作用1.EGFR反義重組腺病毒AdE5的構建(圖1)(a)將EGFR A64-1 EcoRI酶解cDNA片段反向插入pCDNA 3載體(InvitrogenCorporation公司)中獲得EGFR AS質粒，其中含EGFR反義RNA表達盒。該表達盒依次包括巨細胞病毒(CMV)立即-早期基因啟動子序列，反向插入的人EGFR 1838鹼基對cDNA片段(編碼受體胞外區及穿膜區域)，聚腺苷酸化信號序列。
(b)以Xmn I酶解EGFR AS後回收3.9kb片段，然後插入含Ad5腺病毒基因的載體pAIX中的E1區域(1.3～9.4mu)形成重組質粒pAIX AS。pAIX含有腺病毒左端0～1.3/9.4～17mu基因片段。
(c)將攜帶EGFR反義RNA表達盒的質粒pAIX AS與ClaI酶解線性化的攜帶d1327腺病毒基因組DNA的RSV-βgal重組腺病毒大片段(LacZ基因插入1.3～9.4mu區域，其後有9.4～100mu病毒基因片段)共轉染293細胞(ATCC公司)，二者在細胞內發生同源重組，形成表達EGFR反義RNA的重組腺病毒AdE5。
2.AdE5的擴增和純化以10個空斑形成單位(pfu)/細胞感染90％匯合狀態的接種於100mm平皿中的293細胞，36～48小時後細胞出現完病變效應時收集細胞。30～40個平皿的細胞匯集在一起，於-80℃～37℃間反覆凍融4次後離心去除細胞碎片。
將2.5ml 1.4g/ml的CsCl溶液和2.5ml 1.25g/ml的CsCl溶液依此加入超離心管中製成CsCl密度梯度液。將5ml待純化的病毒置於CsCl密度梯度液上，SW41轉頭35000轉/min18℃離心1h30min，吸出病毒帶加在5ml 1.35g/ml的CsCl溶液上，SW41轉頭35000轉/min18℃離心18h後吸出病毒帶加至交換柱上，以PBS緩衝液洗脫CsCl並收集純化的病毒，加入7％的無菌幹油後保存於-80℃。以空斑形成實驗確定病毒滴度，3.腺病毒載體對乳腺癌細胞的轉染率分別以25、50、100和25、50、100、200、400pfu/細胞的RSV-βgal重組腺病毒感染乳腺癌細胞MDA-MB-468和MDA-MB-231(ATCC公司)，24～48h後以1％甲醛/0.2％戊二醛溶液固定細胞，以β半乳糖苷酶(β-gal)底物X-gal顯色(37℃，1h)，顯微鏡下記數β-gal表達細胞及視野內細胞總數。發現病毒轉染率隨病毒量的增大及時間的延遲而提高，48h病毒量在50pfu/細胞或以上時轉染率超過90％。
4.EGFR反義RNA在乳腺癌細胞中的表達(圖2)將EGFR A64-1 cDNA片段EcoR I-Sma I雙酶切片段克隆入pGEM4載體中(Promega公司)獲得pGEM-EGFR質粒。以Afl III酶解pGEM-EGFR後，採用SP6聚合酶合成可雜交保護230鹼基長度的EGFR反義RNA片段的正義核酸探針。線性化的pTRI-GAPDH人3-磷酸甘油醛脫氫酶反義對照載體(Ambion公司)經DdeI酶解後，採用T7聚合酶合成可雜交保護154鹼基長度的GAPDH RNA片段的反義核酸探針，作為內對照。探針由Ambion公司的MAXIscript試劑盒和800Ci/mmol 32P UTP標記後，以含8M尿素的5％丙烯醯胺凝膠電泳純化。
重組腺病毒感染乳腺癌細胞3天後的總細胞RNA通過胍氯化銫法提取後保存於-80℃下。10μg細胞RNA與3×104cpm探針混合後，以Ambion公司的Hybspeed RPA試劑盒行RNA酶保護實驗，檢測EGFR反義RNA的表達。發現，只在感染了AdE5重組腺病毒的乳腺癌細胞中才有EGFR反義RNA的表達，而在對照空病毒AdCO1或PBS處理的細胞中則無EGFR反義RNA的表達。
5.EGFR蛋白在乳腺癌細胞及人微血管內皮細胞中的表達被AdE5抑制(圖3)以western印跡雜交檢驗AdE5對EGFR蛋白表達的抑制作用。50～700pfu/細胞重組腺病毒感染MDA-MB-468、MDA-MB-231細胞及人微血管內皮細胞HMEC-13天後提取全細胞蛋白。10～25μg蛋白以7％SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分離後轉移至硝酸纖維素膜上，以麗春紅染色驗證蛋白加樣的均勻性。以1μg/ml小鼠抗人EGFR單克隆抗體(UpstateBiotechnology公司)為一抗4℃孵育過夜，再以辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG Fab片段為二抗室溫孵育1h，最後採用Amersham Life Science公司的ECL試劑檢測EGFR的表達水平。與對照空病毒AdCO1和未感染病毒(0)比較，AdE5顯著抑制此3種細胞EGFR的表達。
6.乳腺癌細胞和微血管內皮細胞的體外增殖被AdE5抑制(圖4)感染前1天7×104MDA-MB-468細胞植於9.6cm2細胞培養皿中。第1天以50和100pfu/細胞的病毒於0.5ml培養液中感染4h，重複3次。以PBS緩衝液衝洗後，細胞在含10％的胎牛血清的培養液中培養。第2、3天胰蛋白酶消化後細胞記數，研究細胞增殖情況。如圖4-A所示，與AdCO1比較，AdE5抑制細胞增殖，且此抑制效果隨著病毒量的增大和時間的延長而加強。
觀察150和300pfu/細胞的AdE5和AdCO1感染MDA-MB-231細胞後細胞的增殖情況，與未感染病毒的細胞比較未發現2種重組腺病毒對細胞增殖有任何影響。
感染前1天2×105HMEC-1細胞植於9.6cm2細胞培養皿中。第1天以350和700pfu/細胞的病毒感染細胞，重複2次。細胞在含1％去除生長因子(以活性碳-葡聚糖處理)的胎牛血清的培養液中(+/-表皮生長因子，EGF，Upstate Biotechnology公司)培養。第2、4天胰蛋白酶消化後細胞記數，研究細胞增殖情況。如圖4-B所示，EGF刺激細胞的增殖，且此刺激作用隨生長因子濃度的提高而增大；高量不但AdE5抑制細胞增殖，而且可抵消EGF的作用；AdCO1對細胞的增殖以及對EGF的反應無影響。
7.乳腺癌腫瘤生長被AdE5抑制(圖5)將懸浮在0.2ml PBS緩衝液中處於對數生長狀態的107MDA-MB-468細胞及6×106MDA-MB-231細胞皮下接種於5周雌性swiss nu/nu小鼠右肋部。細胞接種後第7天(d7)，腫瘤體積達70mm3左右時將動物進行隨機分組，以稀釋於100μl PBS緩衝液中的109pfuAdE5、AdCO1或100μl PBS緩衝液進行腫瘤內注射。(A)MDA-MB-468腫瘤d7注射1次，(B)MDA-MB-231腫瘤d7和d13各注射1次。每4～8天測量1次腫瘤體積，體積計算公式為π×平均直徑3/6。於d53，MDA-MB-468腫瘤生長被顯著抑制(PBS/AdCO1，p＝0.24；PBS/AdE5，p＝0.0027；AdCO1/AdE5，p＝0.00010)。於d34，腫瘤生長被顯著抑制(PBS/AdCO1，p＝0.71；PBS/AdE5，p＝0.0050；AdCO1/AdE5，p＝0.0058)。
8.AdE5對乳腺癌細胞凋亡的誘導(圖6，7；表1)以50～100pfu/細胞重組腺病毒感染體外貼壁生長的MDA-MB-468細胞，24h後收集提取全細胞蛋白，行western印跡雜交檢測聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)。50μg蛋白以10％SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分離後轉移至硝酸纖維素膜上，以麗春紅染色驗證蛋白加樣的均勻性。以1μg/ml小鼠抗PARP單克隆抗體(Oncogene Research Products公司)為一抗4℃孵育過夜，再以辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG Fab片段為二抗室溫孵育1h，最後採用AmershamLife Science公司的ECL試劑檢測PARP活性。以經P53重組腺病毒AdP53感染的MDA-MB-468細胞作為陽性對照。當細胞發生凋亡時，分子量為115kD的PARP被切割，產生一85～90kD的小片段。如圖6(A)所示，與陰性對照和AdCO1相比，AdE5誘導MDA-MB-468細胞凋亡。且此誘導作用隨病毒量的增加而增強。至300pfu/細胞，檢測PARP片段，重組腺病毒對MDA-MB-231細胞無凋亡誘導作用。
以50～100pfu/細胞重組腺病毒感染體外貼壁生長的MDA-MB-468細胞，3天後收集並將其離心甩輔在玻片上，經4％多聚甲醛固定後採用Roche公司原位細胞死亡檢測試劑盒，以TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)技術檢測細胞凋亡情況，凋亡細胞核被鹼性磷酸酶底物Fast Fast Red(Sigma公司)染成紅色，以蘇木素復染。如圖7(A～E)所示，與陰性對照和AdCO1比較，AdE5誘導MDA-MB-468細胞凋亡，且此誘導作用隨病毒量的增加而增強。至300pfu/細胞，檢測TUNEL，重組腺病毒對MDA-MB-231細胞無凋亡誘導作用。
重組腺病毒感染細胞48h後以流式細胞儀研究細胞周期分布，與AdCO1相比AdE5誘導MDA-MB-468細胞凋亡，在表1中表現為處於＜G0/G1期的細胞顯著增加。且此凋亡誘導作用隨病毒量的增加而增強。
107MDA-MB-468細胞皮下接種於5周雌性swiss nu/nu小鼠右肋部成瘤，第6天和第10天以稀釋於100μl PBS緩衝液中的109pfu AdE5或AdCO1瘤內注射。第3天處死動物將腫瘤保存於液氮中。5μm腫瘤冰凍切片經4％多聚甲醛固定後採用Roche公司TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況。如圖7(F～G)所示，與AdCO1比較，AdE5誘導腫瘤細胞凋亡。
表1.重組腺病毒感染MDA-MB-468細胞後流式細胞儀分析
9.AdE5對乳腺癌新生血管的抑制(圖8)裸鼠皮下接種MDA-MB-231細胞成瘤後，以稀釋於100μl PBS緩衝液中的109pfu AdE5或AdCO1瘤內注射2次，間隔5天。結束治療後5天處死動物，腫瘤組織以含5％乙酸、75％乙醇、2％甲醛的固定液固定後以石蠟包埋。5μm切片經二甲苯處理後，以3％H2O2室溫孵育5min以阻內源性過氧化物酶活性，然後微波處理；採用1∶100稀釋的小鼠抗人平滑肌肌動朊單克隆抗體(Dako公司)為一抗室溫孵育1h；經Zymed Laboratories Inc公司Histomouse-Max試劑盒處理，陽性細胞被辣根過氧化物酶底物DAB染成棕色。切片以蘇木SW480人結腸腺癌SW620人結腸腺癌HepG2人肝腺腫瘤懸浮細胞EL4小鼠淋巴瘤B.樣品化合物1、化合物3、ACM乙醇萃取物、ACM水萃取物C.測定方法計算ED50(有效劑量的50％抑制)粘附細胞MTT(甲基噻唑基四唑鎓)法對於MCF-7、HT-29、KATO III、SW480、HepG2，3天確定細胞。SW620 4天。
懸浮細胞細胞計數法；EL4細胞計數5天。
D.結果計算y＝m Ln(x)+b實例
使用X(10、30、50ppm)與Y值得到相關曲線y＝-0.2643Ln(x)+1.5321ED50＝exp(0.97/2-1.5321)/(-0.2643)樣品製備與樣品描述A.ACM(牛樟芝菌絲體粉末)的水萃取物1.將1克ACM加入裝有40毫升RO H2O的250毫升燒杯中，室溫下將燒杯置於超聲水浴中，持續20分鐘。
2.在45℃下攪拌水浴45分鐘。
表3.4Gyγ射線照射MDA-MB-231細胞後流式細胞儀分析
權利要求
1.一種用於惡性腫瘤治療的重組腺病毒，其特徵是該腺病毒基因組中E1區及E3區缺失，並在E1區位置插入了人表皮生長因子受體(EGFR)反義RNA表達盒。該表達盒依次包括巨細胞病毒(CMV)立即-早期基因啟動子序列，反向插入的人EGFRA64-1 EcoRI酶解1838鹼基對cDNA片段，聚腺苷酸化信號序列。
2.根據權力要求1所述的重組腺病毒，其特徵在於該腺病毒為Ad5型腺病毒。
3.根據權力要求1所述的重組腺病毒，其特徵在於該腺病毒可用於惡性腫瘤的治療。
4.根據權力要求3所述的重組腺病毒，其特徵是惡性腫瘤可以是乳腺癌或其他表達EGFR的惡性腫瘤。
5.根據權力要求3所述的重組腺病毒，其特徵是該腺病毒可用於惡性腫瘤或惡性腫瘤術後瘤床的治療。
6.根據權力要求3所述的重組腺病毒，其特徵是該腺病毒可聯合放療或化療以達到提高惡性腫瘤治療效果的目的。
7.根據權力要求1所述的重組腺病毒，其特徵是所述的重組腺病毒可以以液體形式被配成注射液、滴液、噴霧液、塗抹液等。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及一種表達人表皮生長因子受體反義RNA的重組腺病毒及其在惡性腫瘤治療中的應用。該重組腺病毒本身不但可抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤新生血管生成，而且還可增加放射線對腫瘤細胞的殺滅作用。據此認為該類重組腺病毒在腫瘤的基因治療中具有良好的臨床應用前景。
文檔編號C12N15/12GK1667124SQ200410042800
公開日2005年9月14日 申請日期2004年5月28日 優先權日2004年5月28日
發明者馬林 申請人:中國人民解放軍總醫院