包括對醯基輔酶a∶膽固醇醯基轉移酶具有抑制活性的化合物或者其鹽作為有效成分的...的製作方法

2023-05-18 04:20:56 1

專利名稱：包括對醯基輔酶a∶膽固醇醯基轉移酶具有抑制活性的化合物或者其鹽作為有效成分的 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及一些對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶(ACAT)活性具有抑制效果的化合物及其鹽可被用於殺蟲劑的原理。
背景技術：
合成有機殺蟲劑被廣泛用來提高農作物的產率，清除有毒昆蟲尤其是森林中的有毒昆蟲。然而，幾十年來連續使用以及濫用這些殺蟲劑已經引起對使用自然天敵的生物防護系統的破壞，有毒昆蟲的異常出現或者對殺蟲劑抗性的發展，對非目標生物體包括人類的毒性的發展，環境汙染等等。
由於它們的有害影響，合成的有機殺蟲劑的使用已經逐漸減少，尤其是2004與1993相比國內使用將減少50％。因此，急需發展新型殺蟲劑作為增強農產品產率的工具。同樣，生物製品的世界市場據估計將擴大到超過5兆韓元，生物殺蟲劑的國內市場預計也將擴大到約940億韓元。而且，隨著生物工程技術的進步，將可能實現殺蟲劑市場的這種擴大。
殺蟲劑通過口腔，皮膚以及通氣孔滲入昆蟲體內。當殺蟲劑達到昆蟲的靶位時，有一些將被降解並且變得無毒性，而另一些將被活化，變得更具毒性並且聚集在器官中或者排洩到體外。當將殺蟲劑施用於昆蟲時，僅僅一部分使用的殺蟲劑顯示其在靶位的殺蟲活性。一般情況下，因為有若干限制因素阻礙殺蟲劑到達昆蟲體內的靶位，僅僅一部分使用的殺蟲劑到達其作用位點然後破壞昆蟲的生理學以及生物化學功能，最終殺死昆蟲。因此，當使用或者研製殺蟲劑時，應該深入考慮殺蟲劑的作用位點以及作用機制以及影響殺蟲劑在昆蟲體內有效濃度的代謝。
現行的殺蟲劑根據作用方式被分成影響神經衝動沿軸突傳播的神經毒劑，能量產生抑制劑，昆蟲生長調節劑以及性引誘信息素。昆蟲生長調節劑被分成保幼激素抑制劑以及殼多糖合成抑制劑的亞群。
神經毒劑通過異常刺激，激發或者抑制神經系統殺死昆蟲。
構成神經系統最小單元的神經元通常具有一個從細胞體伸出的長細纖維，稱作軸突。在軸突末端，軸突與另一神經元的樹突接觸同時形成被稱作「突觸」的特化結構。神經衝動沿著軸突傳播。當神經衝動達到軸突末端時，神經遞質，乙醯膽鹼(在下文稱為「ACh」)立即從突觸小泡釋放進入突觸前以及突觸後膜之間的突觸。釋放的ACh在突觸後膜中與其受體結合，引起突觸後神經元的興奮。由此，神經衝動從一個神經元傳送到另一神經元。
神經衝動從突觸前膜傳播到突觸後膜後，從突觸小泡釋放的ACh立即被從突觸後膜釋放的乙醯膽鹼酯酶(在下文稱為「AChE」)水解。AChE具有兩種活性一個是具有負責降解負電荷離子以及酯的位點，並且另一個是水解ACh。
因此，神經衝動傳播到突觸後神經元後當ACh以結合其受體的狀態聚集在突觸後膜時，可以引起超興奮以及痙攣。因此，通過AChE的作用ACh被轉化為膽鹼以及乙酸。膽鹼被突觸前膜攝取用於重新利用並且在突觸小泡中轉化為ACh。
在這方面，當抑制AChE作用於降解ACh的活性的殺蟲劑，主要是有機磷酸酯以及氨基甲酸酯被用於控制昆蟲時，ACh聚集在突觸中，並且神經衝動的傳播變得異常，由此引起痙攣，癱瘓並且最終死亡。有機磷酸酯以及氨基甲酸酯類殺蟲劑已知主要通過作用AChE的活性位點抑制ACh降解。
這些化學試劑經由皮膚相對迅速地滲入昆蟲體內，吸附在神經系統的表面，並且引起神經衝動傳播系統的紊亂並且，在經過某一潛伏期後，出現異常行為，過度的神經活動，嚴重的痙攣以及最後癱瘓以及死亡的症狀。
昆蟲生長調節劑通過幹涉殼多糖合成並且因此幹涉昆蟲角質層的構建而殺死昆蟲，並且被分為保幼激素抑制劑以及殼多糖合成抑制劑。
通常，昆蟲通過由各種與氧化，還原，水解等相關的酶對吸收的殺蟲劑進行代謝而對殺蟲劑進行解毒。然而，一些殺蟲劑通過代謝獲得更高的毒性。這些變化被稱作「活化」，並且主要通過氧化反應活化殺蟲劑。
昆蟲具有堅硬的外部體壁(外殼)作為皮膚。不象脊椎動物的皮膚，昆蟲的外殼具有諸如維持身體形狀，肌肉支持以及硬化的結構功能，並且具有不同的化學成分。外殼(或者角質層)必須脫落用於昆蟲生長。因此，角質層的形成對於昆蟲的生長是非常重要的。昆蟲的外殼(皮膚)是具有以下三個官能區域的多層結構角質層，外皮以及基底膜。角質層可以被分成兩層上角質層以及前角質層。脊椎動物不存在的殼多糖是角質層的主要成分。當想殺死昆蟲時，殼多糖合成是主要的靶點，並且尤其受到作用於抑制昆蟲角質層脫落的殺蟲劑的抑制，最終殺死昆蟲。
昆蟲外殼的前角質層包含大量為N-乙醯基氨基葡萄糖單位的線型聚合物的殼多糖。與神經毒劑不同，當脫皮抑制劑經由其口腔或者通氣孔被引入昆蟲體內時，昆蟲的角質層不能正常形成，並由此阻斷昆蟲的脫皮。在這當中，脫皮抑制劑抑制前角質層中內部內角質層中殼多糖的生物合成，而不影響由硬化蛋白組成的上角質層的形成。雖然尚未確定其詳細的作用機制，脫皮抑制劑已知通過抑制UDP-N-乙醯基氨基葡萄糖的聚合抑制與殼多糖生物合成相關的酶，所述殼多糖是前角質層的主要成分。
性引誘信息素同樣被用於殺死昆蟲。通常，使用由雌性昆蟲釋放的吸引雄性的信息素捕獲雄性昆蟲並最後將其殺死。然而，性引誘信息素在田間無效。
一些殺蟲劑通過使用機油乳劑覆蓋害蟲的皮膚物理性地使害蟲窒息起作用。然而，目前利用的殺蟲劑主要影響神經系統或者與能量產生相關的酶，所述神經系統或者與能量產生相關的酶對於保持昆蟲的壽命是必不可少的。尤其是，已經開發並且投入使用了攻擊昆蟲特異性功能的殺蟲劑，例如通過抑制形成角質層的殼多糖的生物合成或者通過阻斷保幼激素的產生進行。
昆蟲的生理機能已經部分由許多研究人員報告。最近的研究集中在通過分子生物學方法研究與代謝相關的酶或者受體。
這種研究發現，在昆蟲體內膽固醇是形成質膜和角質層上的蠟以及在血液或者淋巴中的脂類運輸所需的。膽固醇可以用22-脫氫膽固醇或者7-脫氫麥角甾醇以及被稱作「替代化合物」的化合物代替。然而，替代的化合物不能被用來合成昆蟲蛻皮激素。
脂類組分在昆蟲體內親水性較差並且因此不能經由血液或者淋巴在組織之間自由轉移。昆蟲通過使用運輸蛋白克服這種問題。來源於飲食或者經由軀殼壁被引入的磷脂，膽固醇，烴類，保幼激素並且甚至是脂類物質以與運輸蛋白結合的狀態攜帶。
尤其是，保幼激素以與血液或者淋巴中的運輸或者結合蛋白結合的狀態存在。結合蛋白用作保幼激素的介質，並且起到防止保幼激素被非特異性酯酶攻擊的作用。
然而，保幼激素特異性酯酶可以降解保幼激素不管它們是否與結合蛋白結合。因此，血液或者淋巴中保幼激素的滴度通過由咽側體的釋放量以及保幼激素酯酶的活性進行確定。
分泌保幼激素的咽側體在幼蟲發育以及成蟲期繁殖期間顯示周期性活性，並且其分泌激素的高活性與其體積變化具有密切關聯。在高活性狀態，分泌激素的高活性咽側體細胞擴大，隨之細胞液中胞內細胞器擴大。一些報導顯示當保幼激素滴度降低時昆蟲保幼激素抑制昆蟲的變形以及由此抑制昆蟲脫皮。
許多研究人員已經通過使用分子生物技術研究了昆蟲的生理機能，特別是，代謝相關的酶或者受體。然而，有關激素運輸以及甾醇儲藏的研究很少。
因為昆蟲不能合成甾醇，它們需要甾醇作為基本的養分。大多數昆蟲通過將植物甾醇轉化為膽固醇對它們進行利用。膽固醇是蛻皮激素的生物合成所需的，並且參與質膜連同磷脂的形成。
另一方面，醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶抑制劑已知具有預防以及治療人高血壓的療效。尤其是，它們正在被研製成高血壓的治療劑，其具有與動脈硬化的發病機制相關的新的作用機制。催化膽固醇醯化作用的醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶參與小腸膽固醇的吸收，肝臟中VLDLs(極低密度脂蛋白)的合成以及醯化膽固醇在脂肪組織以及血管壁中的聚集。同樣，醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶已知參與動脈硬化的惡化，並且用作新作用方式研製高血壓治療劑的靶點。醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶抑制劑的代表性實例包括化學合成的尿素，醯胺以及苯酚。其中，一些通過了體內活性試驗的候選藥物正在進行用作動脈硬化治療劑的臨床前試驗。然而，迄今為止，一直沒有有關醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶抑制劑臨床應用的報導。
基於昆蟲主要需要甾醇用於生長以及繁殖的事實，本發明者發現當參與甾醇的儲藏或者運輸的甾醇醯化酶被抑制時昆蟲被殺死，本發明者還研製了能夠通過新確定的作用機制殺死昆蟲的新型安全殺蟲劑。
發明概述本發明引入了已知在生成用於儲藏的甾醇或者在昆蟲的幼蟲期甾醇代謝期間的各種激素中起關鍵作用的甾醇醯化酶的新的抑制靶點，本發明者研究了從天然來源分離並且純化的具有殺蟲活性的新的化合物並且確定了其分子結構。使用本發明的分析系統分析了分離的化合物及其他合成的有機化合物是否對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶的活性具有抑制效果。對抗兩種幼蟲昆蟲的殺蟲分析發現鑑定為對上述酶具有抑制活性的化合物具有殺死幼蟲的效果。
因此本發明的目的是提供對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶活性具有抑制效果的化合物或者其鹽可以用作殺蟲劑的有效成份的概念。


本發明上述的及其他目的，特徵及其他優點將根據下列詳細說明連同附圖得到更清楚的理解，其中圖1是本發明pyripyropene A(式1)的1H-NMR譜圖；圖2是本發明的phenylpyropene A(式2)的1H-NMR譜圖；圖3是本發明的phenylpyropene B(式3)的1H-NMR譜圖；圖4是本發明的phenylpyropene C(式4)的1H-NMR譜圖；圖5是本發明的脫鎂葉綠甲酯一酸(式5)的1H-NMR譜圖；
圖6顯示了本發明的pyripyropene A對小菜蛾(Plutella xylostella L.)幼蟲的殺蟲效果；圖7顯示了本發明5到11的化合物對小菜蛾幼蟲的殺蟲效果；圖8顯示了本發明的phenylpyropene A，B以及C降低黃粉蟲(Tenebrio molitor L.)幼蟲體重的效果；以及圖9是顯示本發明的pyripyropene A，phenylpyropene A以及C和脫鎂葉綠甲酯一酸對黃粉蟲幼蟲的殺蟲活性的照片，其中將幼蟲的生長水平與對照相比。
發明詳述為了使現上述目的，本發明提供了包括對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶具有抑制效果的化合物或者其鹽作為有效成份的殺蟲組合物。
下面將對本發明進行詳述。
本發明提供了包括對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶具有抑制活性的化合物或者其鹽作為有效成份的殺蟲組合物。具體地，本發明提供了包含選自由以下式1到11代表的化合物的化合物作為有效成份的殺蟲組合物。
[式2]
[式3] [式4] [式5] [式6] [式7] [式8]
[式9] [式10] [式11] 式1到11的化合物可以通過化學合成或者從植物或者微生物提取獲得。
在本發明的化合物中，式1到4的化合物由包括培養灰黃青黴F1959(Penicillium griseofulvum F1959)，用乙酸乙酯提取物培養的細胞以及層析產生的提取物的方法製備。
從灰黃青黴F1959獲得的乙酸乙酯提取物進行層析獲得式1到4的化合物。在層析步驟中，優選進行矽膠柱層析，繼之以高速液相層析。優選地，氯仿以及甲醇的混合物用作矽膠柱層析中的溶劑並且乙腈以及水的混合物用作高速液相層析中的溶劑。
式1到11的化合物具有對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶的抑制活性，並且由於該抑制活性具有抗幼蟲昆蟲的殺蟲活性。
在隨後描述的實驗實施例中，基於昆蟲主要需要甾醇用於生長並且主要利用甾醇醯化酶參與甾醇儲藏以及運輸並且活化以及破壞激素的事實，評價本發明化合物的殺蟲效應。發現所述化合物具有通過抑制參與甾醇代謝期間甾醇的儲藏以及運輸的醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶具有殺蟲活性。
對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶具有抑制活性的本發明的化合物也許已具有控制有毒昆蟲的效果，所述有毒昆蟲包括有害的節肢動物(例如，有害的昆蟲以及有害的蟎)以及有害的線蟲。此外，本發明的化合物可用於有效地控制對傳統的殺蟲劑具有增強抗性的有毒昆蟲。
如果被用作殺蟲組合物的有效成份，沒有添加其它成分的本發明的化合物可以其本身或者其鹽(與諸如鹽酸或者硫酸的無機酸或者諸如對甲苯磺酸的有機酸的農業化學用鹽)的形式利用。然而，本發明的化合物通常與固體載體，液體載體，氣體載體或者餌料混合，或者吸入基體材料，例如多孔陶瓷板或者無紡布，添加表面活性劑，並且如有必要添加其它添加劑，然後配製成各種劑型，例如油類噴霧劑，乳化濃縮物，可溼性粉劑，流動性較好的顆粒，灰塵，氣霧劑，諸如霧化的煙化製劑，可蒸發的製劑，煙燻製劑，有毒的餌料以及用於控制蟎蟲的薄片或者樹脂製劑。
每一上述的製劑可以包含按重量計0.01到95％量的一種或者多種本發明的化合物作為有效成份。
可用於製劑中的固體載體可以包括粘土(例如，高嶺土，硅藻土，皂土，fubasami粘土以及酸性粘土)的精細粉末或者顆粒，合成的水合二氧化矽，滑石，陶器，其它的無機礦物質(例如，矽酸鹽，石英，硫磺，活性炭，碳酸鈣以及水合氧化矽)，以及化學肥料(例如，硫酸銨，磷酸銨，硝酸銨，尿素以及氯化銨)。
液體載體可以包括水，醇(例如，甲醇，乙醇等)，酮(例如，丙酮以及甲基乙基酮)，芳香族烴(例如，甲苯，二甲苯，乙苯以及甲基萘)，脂肪族烴(例如，己烷，環己烷，煤油以及輕油)，酯(例如，乙酸乙酯以及乙酸丁酯)，腈(例如，乙腈以及異丁腈)，醚(例如，二異丙醚以及二氧雜環乙烷)，醯胺(例如，N，N-二甲基甲醯胺以及N，N-二甲基乙醯胺)，滷代烴(例如，二氯甲烷，三氯乙烷以及四氯化碳)，二甲基亞碸，以及植物油(例如，豆油以及棉籽油)。
氣載體或者氣霧劑基質可以包括氟利昂氣，丁烷氣，LPG(液化石油氣)，二甲醚以及二氧化碳氣體。
有毒餌料的基體材料可以包括餌料組分(例如，顆粒裝粉末，植物油，糖以及結晶纖維素)抗氧化劑(例如，二丁基羥甲苯以及去甲二氫愈創木酸)，防腐劑(例如，脫氫乙酸)，用於預防兒童誤食有毒餌料的試劑(例如紅辣椒粉末)，以及引誘劑(例如，乳酪香料以及洋蔥香料)。
表面活性劑的實例可以包括烷基硫酸鹽，烷基磺酸鹽，烷芳基磺酸鹽，烷基芳香基醚及其聚氧乙烯化衍生物，聚乙二醇醚，多元醇酯以及糖醇衍生物。
其它助劑諸如粘合劑以及分散劑的實例包括酪蛋白；明膠；多糖諸如澱粉，阿拉伯樹膠，纖維素衍生物以及藻酸；木質素衍生物；皂土；糖；以及合成的水-溶性聚合物諸如聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮以及聚丙烯酸。
另外，包括PAP(異丙基酸式磷酸鹽)，BHT(2，6-二-叔丁基-4-甲酚)，BHA(2-叔丁基-4-甲氧基苯酚和3-叔丁基-4-甲氧基苯酚的混合物)，植物油，礦物油，表面活性劑，脂肪酸以及脂肪酸酯的穩定劑可以用作製劑助劑。
在本發明的化合物用作農用殺蟲劑，殺蟎蟲劑或者殺線蟲劑的情況下，10英畝區域的使用量通常為0.1到100g。用水稀釋後利用諸如乳化濃縮物，可溼性粉劑或者流動性良好的顆粒的製劑的情況下，施用濃度通常為1到100,000ppm。顆粒，灰塵等的應用通常不用稀釋。當本發明的化合物被用作殺蟲劑，殺蟎蟲劑或者殺線蟲劑預防瘟疫時，乳化濃縮物，可溼性粉劑，流動性良好的顆粒及其他製劑在用水稀釋到0.1到500ppm後進行應用，但是油類噴霧劑，氣霧劑，煙化製劑，有毒的餌料，防蟎薄片等等以其原來的形式應用。
當本發明的化合物被用作用於控制動物，例如農業生產家畜諸如牛和豬，寵物諸如貓和狗的體外寄生物的殺蟲劑或者殺蟎劑時，化合物及其鹽通過已知的系統方法用於獸醫部門控制害蟲，例如通過通過腸胃外給藥永久施用片劑，膠囊，灌服用口服液體藥物，丸劑，feed-through方法以及栓劑形式給藥，例如通過注射，或者通過皮膚給藥，例如噴射油或者水溶液的形式，注灌以及點樣形式給藥；或者通過已知的非系統方法使用諸如頸間或者耳標記物(標籤)的模製品進行給藥。這樣的話，本發明的化合物以每公斤體重的宿主動物0.01到100mg的量施用。
本發明的化合物可以用作混合物或者分別但是同時與本發明的殺蟲組合物以及本發明的殺蟲方法，其它的殺蟲劑，殺線蟲劑，殺蟎劑，驅蟲劑，殺真菌劑，除草劑，植物生長調節劑，增效劑，肥料，土壤改性劑和/或動物性食品一起使用。
實施例本發明將參考下列實施例連同附圖更詳細的進行解釋說明。然而，下列實施例只是用來舉例說明本發明，並且本發明並不限於這些實施例。
實施例1製備對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶具有抑制效果的化合物製備對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶具有抑制效果的化合物(1)用於本發明的灰黃青黴F1959(Penicillium griseofulvum F1959)分離自收集自韓國Ulsan，Gyeongsangbuk-do，土壤，通過真菌學研究鑑定為「灰黃青黴(Penicillium griseofulvum)」，並且培養在韓國，KRIBB的KCTC(韓國典型培養物保藏中心)並且保藏號為KCTC 0387BP。
使用冷凍的分離真菌的原種(10％甘油，-80℃)，通過接種在包含100ml種子培養基0.5％葡萄糖，0.2％酵母抽提物，0.5％多種蛋白腖，0.1％K2HPO4，0.05％MgSO4·7H20(調節到pH 5.8後滅菌)的1L錐形依氏燒瓶中，繼之以在29℃劇烈振蕩培養18小時進行種子培養。將20ml的第一代培養物接種在包含1L的下列培養基的5L錐形依氏燒瓶中2％可溶性澱粉，0.4％soytone，0.3％Pharmamedia，0.1％K2HPO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.3％的CaCO3，0.2％NaCl(調節到pH 5.8後滅菌)，並且在29℃劇烈振蕩培養120小時。
(2)用等體積的乙酸乙酯(EtOAc)伴隨攪拌提取上述(1)製備的發酵培養液體培養基。在壓力下濃縮乙酸乙酯-提取的樣品，由此產生油-相褐色提取物。
將獲得的提取物進行矽膠柱層析(氯仿∶甲醇＝99∶1，98∶2，97∶3，95∶5，90∶10V/V％，4倍矽膠的體積)。通過薄層層析法分析級分化合物的分布，並且將相同化合物的級分合併並且分析對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶的抑制活性。合併具有抑制活性的級分，並用氯仿/甲醇(95∶5到90∶10，V/V％)洗脫，並且在壓力下濃縮洗脫物，由此產生黃棕色油相提取物。
(3-1)將黃棕色提取物進行高速液相層析獲得包含pyripyropene化合物(式1)的活性級分。用YMC公司生產的具有UV檢測器的OSD柱(20×250mm)進行高速液相層析，其中在322nm處檢測pyripyropen化合物。
pyripyropen化合物，也就是pyripyropen A(式1)用乙腈和水(45∶55，體積比)的溶劑以及8ml/分鐘的流速在11min從OSD柱洗脫出來。
在壓力下濃縮活性級分並且再次純化，由此產生無色晶體pyripropen A(式1)。化合物的產率為每1L培養基發酵120小時得到13mg的化合物。
(3-2)同樣，包含式2到4化合物的本發明的活性級分通過將上述(2)製備的黃棕色提取物進行高速液相層析獲得。用YMC公司生產的具有UV檢測器的OSD柱(20×250mm)進行高速液相層析，其中在320nm檢測pyripyropen化合物。
Pyripyropene A(式2)，phenylpyropene B(式3)以及phenylpyropeneC(式4)用乙腈和水(75∶25，體積比)的溶劑以及8ml/分鐘的流速分別在15分鐘，26min以及49分鐘從OSD柱洗脫出來。
每一活性級分在壓力下濃縮並且再一次純化，由此產生無色無定形的結晶，phenylpyropene A(式2)，phenylpyropene B(式3)以及phenylpyropene C(式4)。每1L培養基發酵120小時獲得的phenylpyropene A，B以及C的產率分別為2.9mg，3mg以及3.1mg。
測定本發明對昆蟲的甾醇代謝具有抑制效果的化合物的分子結構(1)紫外-可見光譜分析進行紫外-可見光分析確定通過層析獲得的化合物的分子結構。具體地，將獲得的結晶化合物溶於100％甲醇，並且通過使用紫外-可見分光光度計(Shimadzu Company，UV-265)分析對應於吸收峰的波長。
結果，化合物在UV範圍的232和322nm顯示最大吸收，顯示化合物具有吡啶或者苯環。
(2)紅外光譜分析如同下述進行紅外(IR)光譜分析。將2mg每次獲得的結晶化合物溶於氯仿豬，塗抹在AgBr窗上，乾燥並且通過BioRad FT/IR分光光度計(BioRad Digilab Division，FTS-80)進行分析。
結果，化合物顯示約3550cm-1，1740cm-1以及1702cm-1的吸收峰值。IR吸收光譜顯示在有機化合物中分別存在OH基團，C＝O基團，C＝O基團。
(3)質譜分析為了確定化合物的分子量，使用質譜儀VGZAB-7070進行高分辨質譜分析。
結果，發現pyripyropene A(式1)，phenylpyropene A(式2)，phenylpyropene B(式3)，phenylpyropene C(式4)以及脫鎂葉綠甲酯一酸(式5)分別具有583，581，508，450以及592的分子量。
(4)NMR分析為了確定結晶化合物的分子結構進行NMR分析。將10mg的每種結晶化合物完全乾燥，溶於CDCl3，置入5-mm NMR管，並且通過使用Varian Unity-500核磁共振波譜儀進行分析。在500.13MHz觀察1H-NMR波譜。結果顯示在表1到4中。
通過分析上述(1)到(4)確定式1到4化合物的分子結構。
實驗實施例1分析本發明化合物的ACAT活性通過略微改變的Brecher開發的方法(Brecher.P以及C.Chen，Biochimica Biophysica Acat 617458-471，1980)評價本發明化合物對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶(在下文稱為「ACAT」)的抑制活性。在所述方法中，使用肝微粒體作為ACAT的來源，用膽固醇以及14C-標記的油醯基輔酶A的底物確定ACAT的活性。用反應產物膽固醇酯的放射性強度估計ACAT的活性。
具體而言，如同下述製備反應混合物。將兩者都溶於丙酮的膽固醇以及Triton WR-1339懸浮在水中，並且在氮氣中除去丙酮後，補充磷酸鉀緩衝液(pH 7.4，終濃度0.4M)。為了穩定酶反應，向混合物添加牛血清白蛋白到終濃度30μM。然後，將溶於DMSO或者甲醇的樣品添加入混合物。產生的反應混合物預培養在37℃共30分鐘。然後通過添加[1-14C]-油醯基輔酶A溶液到終濃度0.04μCi起始酶反應。在37℃培養30分鐘後，通過添加1ml的異丙醇-庚烷溶液終止反應。然後，將0.6ml的正庚烷以及0.4ml的KPB緩衝液添加入終止的反應混合物中。充分混合混合物並於室溫下靜置2分鐘。相分離後，將200μl的上清液導入閃爍管。向小瓶中添加4ml的閃爍混合物(Lipoluma，Lumac Co.)後，用閃爍計數器(Packard Delta-200)測定合成的膽固醇油酸酯的量。根據下列公式1計算對ACAT的抑制活性抑制活性(％)＝[1-(T-B/C-B)]×100其中，T在包含本發明的化合物連同酶來源的試驗反應混合物中的cpm；C在不包含化合物但是包含酶來源的對照反應混合物中的cpm；以及
B在不包含酶來源但是包含化合物的另一對照反應混合物中的cpm。
結果，pyripyropene A(式1)顯示35ng/ml的IC50值(IC50抑制50％的ACAT活性的化合物的濃度)，並且IC50值計算為0.060nM，因為化合物具有583的分子量。
發現phenylpyropene A(式2)具有500ng/ml的IC50值，並且IC50值被計算為86nM因為化合物具有581的分子量。
發現phenylpyropene B(式3)具有6.5μg/ml的IC50值，並且IC50值被計算為12.8μM因為化合物具有508的分子量。
發現Phenylpyropene C(式4)具有7.2μg/ml的IC50值，並且IC50值被計算為16.0μM因為化合物具有450的分子量。
發現Pheophorbide(式5)具有1.3μg/ml的IC50值，並且IC50值被計算為2.2μM，因為化合物具有592的分子量。
此外，當使用20μg/ml以及100μg/ml的濃度時，式6到11的化合物分別顯示92.4％以及99.2％；96.6％以及97.8％；84.5％以及93.8％；93.4％以及98.4％；17.6％以及82.0％；以及84.8％以及89.6％的ACAT抑制活性。
實驗實施例2分析本發明的化合物抗小菜蛾幼蟲的抑制活性小菜蛾的幼蟲被用作該試驗的實驗昆蟲，其獲自韓國，大田Oundong，Yusong-ku的韓國生物科學以及生物工藝學研究所(KRIBB)的昆蟲研究實驗室。精確稱重後，將具有ACAT抑制活性的合適量的本發明化合物溶於丙酮中，與9體積的100ppm Triton X-100儲液混合，連續稀釋，由此產生活性化合物溶液。如同下述準備用於小菜蛾幼蟲生長的食物均勻生長的捲心菜的葉子切成葉子圓片(3.0cm直徑)，浸入活性化合物溶液30秒，並在通風櫥中乾燥60分鐘。將每一活性化合物-處理的葉子圓片放入具有濾紙片的平皿(55×20mm)中。然後將小菜蛾的10秒鐘齡幼蟲利用不損傷幼蟲的軟刷小心地置於每一葉子圓片上，並生長在恆溫箱中(25±1℃，40-45％相對溼度，16L8D)。24小時以及48小時後，記錄死亡率。對照組沒有用本發明的活性化合物處理，但是生長在用10％丙酮以及9體積的100ppm Trixton X-100儲液的混合物處理的葉子圓片上。重複3次進行葉子圓片生物分析，並通過Finney(1982)開發的概率單位法計算LC50(50％的致死濃度)。
如圖6所示，當小菜蛾幼蟲用0.001到1mg的本發明的具有ACAT抑制活性的化合物中的pyripyropene A(式1)處理，並以24小時的間隔研究化合物的殺蟲活性時，pyripyropene A與對照相比顯示劑量依賴方式的持續殺蟲效應。
如圖7所示，當小菜蛾幼蟲用1mg的式5到11的每一化合物處理，並以24小時的間隔研究化合物的殺蟲活性時，具有高體外ACAT抑制活性的化合物與每一對照相比顯示出強烈的殺蟲效應，而具有相對低ACAT抑制活性的化合物顯示微弱的殺蟲效應。這些結果顯示化合物的體外ACAT抑制活性與它們的殺蟲效應相關。
實驗實施例3分析本發明的化合物對黃粉蟲幼蟲的抑制活性在本發明具有ACAT抑制活性的化合物中，試驗phenylpyropeneA，B以及C(式2到4)對幼蟲昆蟲的體重降低效果。在本試驗中，將黃粉蟲的幼蟲用作實驗昆蟲，其獲自韓國KRIBB的昆蟲研究實驗室。健康的秒齡蟲幼蟲(10-12mm)的黃粉蟲在進行該試驗前24小時進行選擇。每一式2到4的化合物溶於10％丙酮到終濃度1mg/ml並進行連續稀釋。將1ml的稀釋的化合物溶液與通常用作食物的1g麥麩混合。將產生的混合物倒入玻璃平皿(90×20mm)中，並在壓力下將平皿置於乾燥器中約2小時除去有機溶劑。稱重後，將每試驗組10隻活力強的黃粉蟲的幼蟲連同本發明化合物以及麥麩的混合物置於具有濾紙圓片的平皿(87×15mm)中。然後，將幼蟲培養在25℃，40-45％的相對溼度，16-小時照明/8-小時黑暗循環的條件下。72小時後，每隔兩天記錄幼蟲的體重以及食物攝取量。重複3次進行該分析，並且用10％丙酮處理對照組。結果顯示在表8和9中。
如圖8所示，當黃粉蟲幼蟲用與10g麥麩混合的1mg的phenylpyropene A，B或者C(式2到4)處理並且在第3以及7天記錄幼蟲的體重時，與每一對照相比化合物顯示持續的降低幼蟲體重的效果。
此外，當用與10g麥麩混合的1mg的pyripyropene A(式1)，phenylpyropeneA以及C(式2以及4)或者脫鎂葉綠甲酯一酸(式5)處理時，研究化合物的生長抑制活性。如圖9所示，在所有用化合物處理的黃粉蟲幼蟲中發現幼蟲的生長抑制。尤其是，當用具有高ACAT抑制活性的pyripyropene A處理時，大多數黃粉蟲的幼蟲在幼蟲以及蛹階段被殺死，並且一些通過早期的羽化殺死。同樣，當用其它化合物處理時，超過50％的黃粉蟲昆蟲在幼蟲以及蛹階段被殺死，而倖存的幼蟲受到生長抑制，並且倖存幼蟲的數目因此顯著地降低。而且，倖存的幼蟲比對照活力差。這些結果顯示本發明的化合物具有通過抑制幼蟲的生長的殺幼蟲的效果。
工業實用性如上所述，本發明涉及包括對ACAT具有抑制效果的化合物或者其鹽作為有效成分的殺蟲組合物。具有ACAT抑制活性的化合物通過抑制有毒昆蟲體內甾醇的代謝而具有優異的殺蟲效應。因此，本發明的化合物可用作安全並且有效的殺蟲劑。此外，一些具有ACAT抑制活性的化合物可以從灰黃青黴F1959很容易地獲得。
權利要求
1.殺蟲組合物，包括對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶具有抑制效果的化合物或者其鹽作為有效成份。
2.根據權利要求1的殺蟲組合物，其中對醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶活性具有抑制效果的化合物是一種或者多種選自由下式1到11代表的化合物[式1] [式2] [式3] [式4] [式5] [式6] [式7] [式8] [式9] [式10] [式11]
3.根據權利要求2的殺蟲組合物，其中式1到4的化合物由包括如下步驟的方法進行製備培養灰黃青黴F1959；用乙酸乙酯提取物培養的細胞；以及層析獲得的提取物。
全文摘要
本發明涉及包括對醯基輔酶A∶膽固醇醯基轉移酶(ACAT)具有抑制活性的化合物或者其鹽作為有效成分的殺蟲組合物。對ACAT具有抑制活性的化合物通過抑制有毒昆蟲體內的甾醇代謝而具有優異的殺蟲效應。因此，本發明的化合物可以用作安全並且有效的殺蟲劑。
文檔編號A01N47/24GK1744817SQ200380109546
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月11日 優先權日2003年1月7日
發明者金永國, 李炫宣, 魯文喆, 金成鬱 申請人:韓國生命工學研究院