一種誘導多能幹細胞的培養基及其用途
2023-05-18 01:35:36
一種誘導多能幹細胞的培養基及其用途
【專利摘要】本發明提供了一種培養誘導多能幹細胞的培養基，所述培養基中含有人參皂苷單體Rb1、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd。本發明還提供一種誘導多能幹細胞的方法，所述方法包括以下步驟：1)將多能性相關基因導入供體細胞；2)將已導入多能性相關基因的供體細胞製備為單細胞懸液，使用本發明的培養基培養步驟1)中導入多能性相關基因的供體細胞；3)鑑定誘導多能幹細胞克隆。鑑於目前ips應用於臨床的瓶頸，本發明發現了人參皂苷單體Rb1、人參皂苷單體Rb3、人參皂苷單體Rd能顯著提高ips誘導效率，並可以顯著延緩細胞的衰老和促進細胞的增殖，將對整個幹細胞研究及新藥研發領域產生深遠影響。
【專利說明】一種誘導多能幹細胞的培養基及其用途
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，涉及人參皂苷的用途，具體涉及含有人參皂苷單體的 多能幹細胞培養基在提高細胞重編程效率、延緩細胞衰老、促進細胞增殖方面的用途。 技術背景
[0002] 中草藥為藥物提供廣闊的來源，在傳統醫學中起重要作用。一些中藥對腦部發育、 免疫性等有顯著療效，但具體的分子機制還不清楚，包括比如作用靶標、信號通路等。中國 傳統醫學中，中藥人參能增強記憶力，明目定神。分析發現人參含有特定活性物質-人參 皂苷（gins en〇Side，GS)。人參皂苷具有類似基本化學結構，大致可分類為達瑪烷型和齊墩 果烷型。由於對單體進行生物活性研究，易於闡明其確切的藥理作用，發現活性較強的化 合物，隨著現代分離和分析技術的進步，人參化學成分得到了進一步的闡明，人參皂苷是人 參主要的生物活性物質，現已確證人參皂苷單體約40種；根據人參皂苷的皂甙元，可以將 他們分為兩組：人參二醇（例如Rgl，Rbl，Re，Rf，RC，RB2, Rb3等）和原人參三醇型（例如 RS3，RK1，RG5，RS4，RS5等）。其中，Rd、Rgl已用於研究神經細胞增殖的。但是人參皂苷在 正常細胞中尤其是在幹細胞中固定功能和作用機制並不清楚。
[0003] 其中，現有技術表明，人參皂苷Rbl在西洋參（花旗參）中含量最多，可影響動物 睪丸的潛力，小鼠的胚胎發育等。協調膽鹼系統的功能，增加乙醯膽鹼合成、釋放，改善記憶 力。人參皂苷Rb3可增強心肌功能，保護人體自身免疫系統。可以用於各種不同原因引起 的心肌收縮性衰竭的治療。人參皂苷Rd可減少乙醯膽鹼誘發的豚鼠離體子宮收縮。對大 鼠有減慢心率和雙相性血壓（先升後降）作用。可抑制貓的行為和腦電圖。此外有抗疲勞 作用。
[0004] 2006年，Yamanaka等人建立了一種新的重編程技術，建立了誘導多能性幹細胞 (induced pluripotent stem cell，iPS cell)系。2007 年，Yamanaka 和 Thomson 研究組 分別建立了人的iPS細胞系。這一重大科學進展使體細胞重編程研究具體到了基因層面， 為研究和應用提供寶貴的細胞資源。由於iPS細胞來自於體細胞而非胚胎，可避免倫理爭 議，具有廣闊的應用前景。
[0005] 細胞重編程是組織修復、器官重建和個體化的再生醫療的基石。如果能掌握細胞 重編程技術，將為組織器官重建等重大科學問題掃除屏障。利用自身體細胞重編程為iPS 細胞，通過體內外誘導技術獲得目標組織和器官，既解決了免疫排斥問題，也解決供型不足 的問題，將會成為人類醫療歷史上重要裡程碑。細胞重編程建立疾病模型ips細胞系可作 為疾病機制機理的研究材料，為採取相應的治療手段提供最可靠的醫學依據。腫瘤、糖尿病 和神經系統疾病等疑難疾病的發生、發展受表觀遺傳修飾調控，相對應的，細胞重編程對基 因定向編輯的研究將對這些疑難疾病的預防、治療提供新的思路。
[0006] 在開展人類ESC、iPSC治療疾病進程中，需要解決很多科學問題。比如高效獲得 非病毒非整合完全重編程iPSC，高效誘導iPSC分化為目的細胞、高效去除未分化的殘留細 胞，快速準確的將多能性幹細胞進行胚胎幹細胞與iPSC的多能性研究，確認分化獲得的目 的細胞功能、表觀遺傳修飾等與體內細胞完全一致性，大規模培養非動物源性（xeno-free) 幹細胞及分化細胞等問題。目前在某些領域取得一些進展，比如Warren等通過mRNA誘導 iPSC，能高效獲得非病毒非整合iPSC。但要將iPSC應用於臨床治療，還有很長一段路需要 摸索。早期iPSC誘導效率僅為0. 01-0. 5%，與體細胞核移植為技術基礎重編程效率存在很 大差距，因此，如何提高iPSC誘導效率是iPSC研究領域的熱點研究內容之一。篩選新供體 細胞、添加活性小分子誘導是有效提高iPSC重編程效率方法之一，特別是候選小分子能大 幅度提高ips誘導效率，現在急需解決的問題是臨床前安全性確認。
[0007] 因此，篩選安全有效的重編程活性小分子具有重要實用價值。
【發明內容】
[0008] 如本文中所使用地，術語"iPS"與"誘導多功能幹細胞"可互換地使用，二者具有 相同的含義。
[0009] 本發明涉及的人參皂苷單體為人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3、人參皂苷單 體Rd。
[0010] 本發明的一個目的在於，提供一種誘導多能幹細胞培養基，所述培養基含有Rbl、 人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd，並提供了所述培養基在製備誘導多能幹細胞中 的用途。
[0011] 本發明的又一個目的在於，提供人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參 皂苷單體Rd在製備用於防治衰老的藥物組合物或者在製備用於延緩衰老的保健品或生活 產品中的用途。
[0012] 本發明的目的還在於，提供人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd在製備用於 促進細胞增殖的組合物中的用途。
[0013] 本發明的目的還在於提供採用人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd促進細 胞增殖的方法。
[0014] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的。
[0015] 在本發明的一個方面，本發明提供了一種培養誘導多能幹細胞的培養基，其特徵 在於，所述培養基由常規誘導多能幹細胞培養基以及人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3 和/或人參皂苷單體Rd組成。
[0016] 優選地，所述培養基為含有人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷 單體Rd的K0SR培養基。
[0017] 優選地，所述培養基中人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體 Rd的工作濃度為1-100 μ M，優選地，濃度為5-100 μ M，進一步優選地，濃度為25-100 μ M，更 優選地，濃度為50-75 μ Μ。優選地，在製備所述培養基時，將所述人參皂苷單體Rbl、人參皂 苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd溶解於微量的DMS0中，然後添加到培養基中。
[0018] 在本發明的另一個方面，本發明提供一種誘導多能幹細胞的方法，所述方法包括 以下步驟：
[0019] 1)將多能性相關基因導入供體細胞；
[0020] 2)將已導入多能性相關基因的供體細胞製備為單細胞懸液，使用本發明的培養基 培養步驟1)中導入多能性相關基因的供體細胞，得到誘導多能幹細胞
[0021] 優選地，所述方法還包括鑑定誘導多能幹細胞的步驟。
[0022] 優選地，所述步驟1)中通過包括以下步驟的方法實現的：
[0023] a.將供體細胞接種到含有SP (青鏈黴素雙抗溶液）的10 % DMEM培養液中；優選 地，所述細胞的接種密度為1. 5-2*104/cm2 ;
[0024] b. -天后，將所述含有SP的10% DMEM培養液換成不含SP的10% DMEM，並使用 含有多能性相關基因的病毒感染供體細胞；
[0025] 優選地，所述多能性相關基因為Klf4、Sox2、Nanoge和0ct4 ;
[0026] 優選地，在感染的同時，加入8 μ g/ml聚凝胺；
[0027] c.誘導24小時後，棄去含有病毒的培養液，換上含有SP的10% DMEM，隔天再換液 一次；
[0028] d.感染後第六天得到感染好的供體細胞。
[0029] 優選地，所述步驟2)中通過包括以下步驟的方法實現的：
[0030] I )將已導入多能性相關基因的供體細胞製備為單細胞懸液，並接種到飼養層細 胞上；
[0031] 優選地，使用胰酶將供體細胞消化成單細胞，優選地，所述胰酶的濃度為 0.25g/100mL ；
[0032] 優選地，供體細胞與飼養層細胞的數量比優選為1 :6-1 :9,更優選為1 :8 ;
[0033] 優選地，所述飼養層細胞為經絲裂黴素 C處理過的無分化能力的小鼠成纖維細 胞；
[0034] II )將步驟1)中接種好的細胞使用10% DMEM的培養液培養1-2天；
[0035] III)棄去10% DMEM的培養液，使用本發明的培養基培養細胞；
[0036] IV )每隔一天更換一次培養基；
[0037] V )培養3-4天後，得到誘導多能幹細胞；
[0038] 在本發明的再一個方面，本發明提供了人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/ 或人參皂苷單體Rd在製備用於防治衰老的藥物組合物或者在製備用於延緩衰老的保健品 或生活產品中的用途。
[0039] 在本發明的再另一個方面，本發明提供了人參皂苷單體Rb 1、人參皂苷單體Rb3和 /或人參皂苷單體Rd在製備用於促進細胞增殖的藥物中的用途。
[0040] 本發明具有以下的意義：
[0041] 鑑於目前ips應用於臨床的瓶頸，本發明發現了人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體 Rb3、人參皂苷單體Rd能顯著提高ips誘導效率，並可以顯著延緩細胞的衰老和促進細胞的 增殖，由於包括人參皂苷在內的中草藥提取物通過臨床實踐證明安全性較高。因此，本申請 的發現可以加速其在臨床上的應用並開發出基於幹細胞調控的藥物，將對整個幹細胞研究 及新藥研發領域產生深遠影響。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0042] 以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0043] 圖1顯示了在ips誘導過程中，加入不同人參皂苷單體處理後的克隆數統計結果。 結果表明相對於對照組（DMS0組），經Rd、Rbl、Rb3處理後的iPSC克隆數顯著增多，提示 Rd、Rbl、Rb3對ips誘導有顯著的促進作用，柱狀圖是一個統計的結果。
[0044] 圖2是流式細胞儀分析的結果，對誘導第10天的MEF細胞進行0CT4-GFP陽性細 胞數的統計，結果表明經人參皂苷單體Rd，Rb3處理過的實驗組中GFP陽性細胞數目遠遠多 於對照組（DMS0組），其中Vc是作為陽性對照組，Vc在促進細胞重編程中的作用已經被報 道過。
[0045] 圖3顯示的是MEF細胞的細胞周期分析，Hoechst核定位，EdUS對S期細胞進行 標記染色，PHH3對Μ期細胞進行標記染色，對不同細胞周期包括M，S和細胞總數進行了標 記，以驗證藥物對細胞的增殖影響，結果表明人參皂苷單體（Rbl，Rb3, Rd)可以部分提高細 胞增殖。
[0046] 圖4顯示的是MEF細胞中Μ期細胞所佔的比例，經人參皂苷單體處理後的MEF細 胞處於Μ期的細胞比例高於對照組。
[0047] 圖5顯示的是MEF細胞的狀態，傳到第7代時狀態變得不好，有很多細胞開始凋 亡，如對照中所示。在培養過程中加入了人參皂苷單體的MEF卻能保持很好的生長狀態。
[0048] 圖6為不同培養液培養的MEF細胞中衰老基因的表達情況，在加入人參皂苷培養 液中生長的MEF細胞表達衰老基因明顯低於對照組。當細胞傳代至第七代時，正常培養液 中的細胞出現明顯的凋亡現象，而在加入人參皂苷單體的培養液中生長的MEF細胞狀態良 好，極少出現凋亡
[0049] 圖7為衰老基因（P21、btg2、gadd45b)的表達水平比較，在加入人參皂苷培養液中 生長的MEF細胞表達衰老基因明顯低於對照組（DMS0)，圖中將對照組的基因表達水平設置 為1，人參皂苷培養液中培養的細胞的衰老基因表達水平明顯低於對照組。
【具體實施方式】
[0050] 豐要材料和試劑
[0051] 低溫保存箱購自中國，海爾；製冰機購自中國，唯利安；液氮罐購自中國，東亞；四 度離心機購自美國，Beckman ;生物安全櫃、二氧化碳培養箱和Nanodrop購自美國，Thermo ; 體式顯微鏡、石錯切片機購自德國，Leica;細胞計數儀、純水儀、病毒超濾離心管（Amicon ultra-15 centrifugal filter unit)購自美國，Millipore;電子天平購自德國，賽多利斯； 移液槍、多聚酶鏈式反應（PCR)儀購自德國，Eppendorf ;雷射共聚焦顯微鏡購自德國，Carl Zeiss ;實時螢光定量PCR儀購自美國，Talent ;滅菌鍋購自日本，Sanyo ;正置顯微鏡購自日 本，Olympus ;
[0052] 電泳儀套裝，GelDoc XR凝膠成像系統購自美國，BI0-RAD ;圓形玻片（Coverslip) 購自美國Bellco Glass。除非特別指明，本文中的試劑來源如下：0pti-MEM培養液， Invitrogen 公司；Knock0ut?DMEM 培養液，Invitrogen 公司；KnockOut? 血清（K0SR), Invitrogen 公司；胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS), Invitrogen 公司；0.05 % 及 0.25%胰蛋白酶，Invitrogen公司；100X鏈黴素-青黴素（S-P), Invitrogen公司；二甲基 亞碸（DMS0)，Invitrogen公司；人參皂苷單體（Rd，Rbl，Rb3)，上海智化醫藥科技有限公司； ΙΟΟχ 非必需胺基酸（Non essential amino acids，NEAA)，Invitrogen 公司；100 X 穀氨醜 胺，Invitrogen 公司；N_2 supplement, Invitrogen 公司；B_27Supplements, Invitrogen 公司；i3-mercaptoethanol(i3-疏基乙醇，100M)，Invitrogen 公司；lOOx 鏈黴素 / 青黴 素（Streptomycin/Penicillin, SP), Invitrogen 公司；TrypLE?, Invitrogen 公司；明膠， Sigma 公司；絲裂黴素 C，Sigma;SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-，Real_Time 試劑盒，日本 Τ0Υ0Β0 公司；TRIzol，Invitrogen 公司；pMX_0ct4，pMX_Sox2，pMX-c-Myc 和 pMX-Klf4質粒，Addgene公司；RNA Reverse試劑盒，Invitrogen公司；AP試劑盒，碧雲天； 感受態DH5a菌株，TransGen公司；Triton X-100,北京索萊寶科技有限公司；多聚甲醛 (PFA), Sigma ；Hoechst 33342, Invitrogen。
[0053] 除非特別指明，本文中所用到的細胞，購自中國科學院動物研究所。
[0054] 除非特別指明，以下實施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規渠道商 購獲得。
[0055] 實施例1培養某的制各
[0056] K0SR培養基為一種用於培養幹細胞的常規培養基，本實施例中的K0SR培養基購 自Invitrogen公司。配方如表1所示
[0057] 表1 K0SR培養基的配方
[0058]
【權利要求】
1. 一種用於培養誘導多能幹細胞的培養基，其特徵在於，所述培養基由常規誘導多能 幹細胞培養基以及人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd組成。
2. 根據權利要求1所述的培養基，其中，所述培養基為含有人參皂苷單體Rbl、人參皂 苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd的KOSR培養基。
3. 根據權利要求1或2所述的培養基，其中，所述培養基中人參皂苷單體Rbl、人參皂 苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd的濃度為1-100 μ M，優選地，濃度為5-100 μ M，進一步 優選地，濃度為25-100 μ Μ，更優選為50-75 μ Μ。
4. 一種製備如權利要求1-3中任一項所述的培養基的方法，包括將人參阜苷單體Rbl、 人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd溶解於微量的DMSO中得到溶液，然後將上述溶液 加入到常規培養基中，使所述培養基中人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂 苷單體Rd的濃度為1-100 μ M，優選地，濃度為5-100 μ M，進一步優選地，濃度為25-100 μ M， 更優選為50-75 μ Μ。
5. -種誘導多能幹細胞的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟： 1) 將多能性相關基因導入供體細胞； 2) 將已導入多能性相關基因的供體細胞製備為單細胞懸液，使用權利要求1-3中任一 項所述的培養基培養步驟1)中導入多能性相關基因的供體細胞，得到誘導多能幹細胞； 優選地，所述方法還包括鑑定誘導多能幹細胞的步驟。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述步驟1)是通過包括以下步驟的方法 實現的： a. 將供體細胞接種到含有SP的10% DMEM培養液中； 優選地，所述細胞的接種密度為1. 5-2*104/cm2 ; b. -天后，將所述含有SP的10% DMEM培養液換成不含SP的10% DMEM，並使用含有 多能性相關基因的病毒感染供體細胞； 優選地，所述多能性相關基因為Klf4、Sox2、Nanoge和0ct4 ; 優選地，在感染的同時，加入8 μ g/ml聚凝胺； c. 誘導24小時後，棄去含有病毒的培養液，換上含有SP的10% DMEM，隔天再換液一 次； d. 感染後第六天得到感染好的供體細胞。
7. 根據權利要求5或6所述的方法，其特徵在於，所述步驟2)是通過包括以下步驟的 方法實現的： I )將已導入多能性相關基因的供體細胞製備為單細胞懸液，並接種到飼養層細胞 上； 優選地，使用胰酶將供體細胞消化成單細胞，優選地，所述胰酶的濃度為 0.25g/100mL ； 優選地，供體細胞與飼養層細胞的數量比優選為1 :6-1 :9,更優選為1 :8 ; 優選地，所述飼養層細胞為經絲裂黴素 C處理過的無分化能力的小鼠成纖維細胞； II )將步驟1)中接種好的細胞使用10% DMEM的培養液培養1-2天； III)棄去10% DMEM的培養液，使用如權利要求1-3中任一項所述培養基培養細胞； IV )每隔一天更換一次培養基； V )培養3-4天後，得到誘導多能性幹細胞克隆。
8. 人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd在製備用於防治衰老 的藥物組合物或者在製備用於延緩衰老的保健品或生活產品中的用途。
9. 人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd在製備用於促進細胞 增殖的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P39/06GK104195103SQ201410394740
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月12日 優先權日:2014年8月12日
【發明者】周琪, 王秀傑, 顧奇, 郝捷, 韓偉方, 劉鑫, 王磊, 王柳 申請人:中國科學院動物研究所, 中國科學院遺傳與發育生物學研究所