用於檢測jc病毒dna的測定的製作方法

2023-05-18 10:10:41 1

用於檢測jc病毒dna的測定的製作方法
【專利摘要】一方面，本公開提供用於從腦脊髓液(CSF)樣品分離核酸的方法。一方面，本公開提供用於測定樣品中的JC病毒DNA的量的方法。
【專利說明】用於檢測JC病毒DNA的測定
[0001]相關申請
[0002]本申請根據美國法典第35篇第119條(e)款要求2011年7月29日提交的美國臨時申請號61 / 513,483的權益，所述臨時申請的內容特此以引用的方式整體併入。
發明領域
[0003]本發明屬於生物樣品中的核酸的檢測領域。
[0004]發明背景
[0005]JC病毒(JCV)是已知引起被稱為進行性多灶性白質腦病(PML)的中樞神經系統(CNS)的罕見病症的人多瘤病毒。腦脊髓液(CSF)中的JCV的檢測是PML的確證，但其在技術上是有挑戰性的。因此需要用於CSF中的JCV的檢測和定量的改進的測定。
[0006]發明概述
[0007]本發明的不同方面(尤其)提供用於從腦脊髓液樣品分離核酸(例如像JC病毒(JCV)DNA)的方法和試劑盒。根據本發明的方面，被認為不含病毒的生物樣品(例如，使用標準技術鑑定為不含JCV的CSF樣品)實際上確實含有可使用本文所描述的技術檢測到的病毒(例如，JCV)。檢測腦脊髓液樣品中JCV的存在可能是具有挑戰性的，這是因為在一些情況下病毒以小量存在，這可能導致假陰性判定。在一些方面，本文所描述的是新穎的核酸檢測方法和試劑盒，所述方法和試劑盒通過增加可以從腦脊髓液樣品分離的核酸的產率來部分地減少假陰性結果。這在一些情況下可以通過提供比當前技術中使用的更多的起始材料(例如，較大體積的腦脊髓液)和/或更少載體(例如，較低濃度的RNA)來實現，但本發明不限於此。
[0008]因此，在一些方面，本發明提供從腦脊髓液樣品分離核酸的方法，所述方法包括將載體核酸和/或蛋白酶添加至CSF樣品，孵育包含所述載體核酸和/或所述蛋白酶的樣品，將孵育的樣品施加至核酸結合柱，洗滌施加有所述樣品的柱，以及將洗脫劑施加至所述柱，從而導致核酸的分離。在一些實施方案中，CSF樣品的體積為至少1ml。在一些實施方案中，載體核酸為載體RNA。在一些實施方案中，腦脊髓液樣品中載體RNA的濃度為約2.8yg /ml或更小(或為2.8μ g / ml或更小)。應了解，本發明涵蓋包括任何一個或多個上述步驟(例如，任何單個步驟或任何兩個、三個、四個或五個上述步驟的組合)(或由其組成，或基本上由其組成)的方法。在一些實施方案中，所述方法還可包括另外步驟。本發明還涵蓋進行一個或多個步驟一次以上，例如，可能有利的是進行洗滌步驟兩次或更多次。作為另一個實例，還可能有利的是進行洗脫步驟一次以上。在這類情況下，可通過任何標準方法(例如，乙醇沉澱)來進一步濃縮洗脫的核酸。本發明還涵蓋省略或取代一個或多個上述步驟。例如，在一些情況下，可使用其它固相提取材料(例如，二氧化矽或其它)代替結合柱來捕獲和/或純化核酸。
[0009]一方面，本公開提供用於測定樣品中的JC病毒(JCV)的量的方法、試劑盒以及核酸。JCV是已知引起被稱為進行性多灶性白質腦病(PML)的中樞神經系統的罕見病症的人多瘤病毒。JCV與BK病毒享有大約75% 的核苷酸同源性，所述BK病毒為多瘤病毒家族的另一成員，其通常感染人類，但不會引起PML。
[0010]儘管最初被鑑定為HIV感染的主要併發症，但是近年來免疫抑制治療性抗體已經與增加的PML發病率相關。在一些實施方案中，中樞神經系統中的JCV的檢測是確證受試者中PML的存在的重要步驟。CSF中的JCV的早期檢測可以用作開始PML早期治療(例如，在嚴重疾病症狀的進展之前)的依據。因此，JCV的早期檢測對於良好的患者預後可能是重要的。在一些實施方案中，本發明的方面涉及測定技術和試劑，所述測定技術和試劑可增加生物樣品(例如，CSF樣品)中JCV檢測的靈敏度。在一些實施方案中，本文所描述的實時PCR測定特異性地檢測人CSF中的JCV，靈敏度為10拷貝/ mL。
[0011]本發明的方面涉及用於確證具有PML的病徵或症狀(例如，早期病徵或症狀)的受試者中PML的診斷的方法和組合物。在一些實施方案中，患者的CSF中JCV的存在是PML的診斷(例如，如果患者具有PML的一種或多種其它病徵或症狀)。在一些實施方案中，受試者的CSF中JCV的存在可適用於確定受試者處於PML的風險。具體地說，本發明提供用於在受試者的免疫系統受損或受抑制的情況下確定受試者是否處於發展PML的風險的方法和組合物。例如，本發明的方面涉及通過測定由於存在JCV感染而造成的受試者的發展PML的風險閾值來確定受試者是否適於用免疫抑制劑(例如，那他珠單抗或其它免疫抑制劑)開始或繼續治療。應認識到，當患者的CSF中JCV的存在用於診斷PML(例如，PML的早期診斷)時，則可針對PML對患者進行治療和/或患者正在接受的免疫抑制治療可在適當時中斷。`
[0012]因此，在一些實施方案中，本發明的方面涉及一種方法，所述方法用於通過以下方式來從腦脊髓液(CSF)樣品分離核酸:將載體核酸和蛋白酶添加至CSF樣品、孵育包含所述載體核酸和所述蛋白酶的樣品、將孵育的樣品施加至核酸結合柱、洗滌施加有所述樣品的柱以及將洗脫劑施加至所述柱，從而導致核酸的分離。
[0013]在一些實施方案中，CSF樣品的體積為至少lml。在一些實施方案中,載體核酸為載體RNA。在一些實施方案中，CSF樣品中載體RNA的所得濃度為2.8微克/ ml或更小。在一些實施方案中，孵育樣品包括在室溫`(RT)下孵育樣品的第一步驟和在高於RT的溫度下孵育樣品的第二步驟。在一些實施方案中，孵育步驟為15分鐘長。在一些實施方案中，高於RT的溫度為56°C。在一些實施方案中，洗滌柱包括將洗滌緩衝液添加至柱並且以4000g的離心力使柱旋轉。在一些實施方案中，施加洗脫劑包括將洗脫劑施加至柱至少兩次。在一些實施方案中，將洗脫劑在柱上孵育5分鐘。在一些實施方案中，施加30微升洗脫劑。在一些實施方案中，CSF樣品中的核酸為DNA，例如病毒DNA (例如，JCV DNA或其它病毒DNA)。
[0014]在一些實施方案中，通過進行實時聚合酶鏈式反應(實時PCR)來測定JC病毒DNA的量來針對核酸(例如，DNA，例如病毒DNA)進行測定。然而，可使用其它檢測方法(例如，其它PCR方法、其它擴增方法、其它基於雜交的方法、一種或多種測序方法等)。在一些實施方案中，實時PCR引物和探針針對JC病毒T抗原編碼序列。在一些實施方案中，實時PCR引物和探針的序列分別為SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:3。
[0015]在一些實施方案中，本發明的方面涉及一種用於通過在樣品上進行實時PCR來測定樣品中的JC病毒DNA的量的方法，其中實時PCR引物和探針針對JC病毒T抗原編碼序列。在一些實施方案中，實時PCR引物和探針的序列分別為SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:3。[0016]在一些實施方案中，本發明的方面涉及一種用於從腦脊髓液(CSF)樣品分離核酸的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包括蛋白酶、載體核酸、核酸結合柱和/或使用說明書。在一些實施方案中，試劑盒進一步包括針對JC病毒T抗原編碼序列的實時PCR引物和探針。在一些實施方案中，實時PCR引物和探針的序列分別為SEQ ID NO:1-2和SEQ IDNO:3。
[0017]在一些實施方案中，本發明的方面涉及一種核酸引物，所述核酸引物特異性地雜交至(例如，在嚴格雜交條件下)保守病毒序列(例如，保守JCV序列(例如，T抗原編碼序列))。在一些實施方案中，核酸為或包括SEQ ID NO:USEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列。
[0018]在本文中更詳細地描述本發明的這些和其它方面。
[0019]發明詳述
[0020]在一些實施方案中，本發明的方面涉及檢測患者樣品中的JCV以便評價患者中PML的風險。雖然初次感染JCV經常無症狀地發生在兒童期(Padgett&Walker，1973)，但JCV通常(可能通過病毒血症)散布於全身(Ikegaya等,2004)。雖然JCV感染在大多數受試者中是無症狀的，但感染可能導致嚴重病狀(像PML)並且甚至在一些受試者中導致死亡。對PML最敏感的受試者為免疫受損的受試者(例如，AIDS患者)或正在經受免疫抑制劑治療的受試者，例如器官移植後或待治療炎症相關病狀(如多發性硬化症)(例如，使用那他珠單抗或其它免疫抑制藥物)。
[0021]據認為在不存在PML的情況下，JCV主要持久存在於腎中，並且PML與腦中JCV的存在相關。因此，在一些實施方案中，本發明的方面涉及檢測CSF中的JCV。然而，本發明的方法和組合物還可適用於檢測尿、血液、腎臟組織或其它患者樣品中的JCV。
[0022]一方面，本公`開提供用於從腦脊髓液(CSF)樣品分離核酸的方法。在一些實施方案中，所述方法包括:將載體核酸和蛋白酶添加至CSF樣品，孵育包含所述載體核酸和所述蛋白酶的樣品，將孵育的樣品施加至核酸結合柱，洗滌施加有所述樣品的柱，以及將洗脫劑施加至所述柱，從而導致核酸的分離。
[0023]腦脊髓液為圍繞並且保護腦和脊髓的流體。所述流體通常為含有蛋白質和白血細胞的透明液體。一般來說，通過腰椎穿刺(脊椎抽液)從受試者獲得CSF。腰椎穿刺是對受試者來說不適的程序，並且腰椎穿刺術的數目應最小化。影響腦和/或中樞神經系統的多種病症(包括腦膜炎、腦腫瘤以及腦出血)可通過分析CSF來進行診斷。腦的病毒感染(如由JC病毒感染)可通過檢測CSF中病毒DNA的存在和/或量化CSF中病毒DNA的量來進行診斷。因為CSF中病毒DNA(或病毒RNA)的量可能是低的，因此具有可精確檢測甚至少量病毒的診斷技術是重要的。
[0024]分離核酸
[0025]—方面，本公開提供用於從CSF樣品分離核酸的方法。在一些實施方案中，核酸為DNA。在一些實施方案中，從CSF中分離來自DNA病毒(例如，JCV)的DNA。應認識到，本文所描述的方法可以用於分離其它核酸(例如，來自其它病毒或者來自其它微生物或患者來源的DNA或RNA)。在一些實施方案中，核酸為人核酸(即，在人基因組中發現的)。在一些實施方案中，核酸為病毒核酸。在一些實施方案中，核酸為病毒DNA。在一些實施方案中，核酸為JC病毒DNA。在一些實施方案中，在應用本文所提供的分離方法之前，將核酸添加至CSF樣品(即，「摻加」例如用作參考)。
[0026]一方面，本公開提供用於從CSF樣品分離核酸的方法，所述方法使用來自可商購的核酸分離試劑盒(例如像 QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Cat#57704, Qiagen)和來自Qiagen、Promega以及Epicentre的其它試劑盒)的一種或多種組分。應認識到，還可以使用來自其它可商購的核酸試劑盒的組分來實踐本文所公開的方法。
[0027]在一些實施方案中，從其中分離核酸的CSF樣品的體積為0.5ml或更多、Iml或更多、1.5ml或更多、2ml或更多、2.5ml或更多、3ml或更多、5ml或更多或至少IOml或更多。在一些實施方案中，從其中分離核酸的CSF樣品的體積為lml。應認識到，Iml的樣品大小高於通常用於從生物樣品並且具體地說從CSF中分離核酸的樣品大小(例如，200微升或更小)。根據本發明的一些方面，重要的是使用Iml或更多的CSF體積以便實現足夠靈敏度(例如，以檢測至少10拷貝的JCV核酸)。已經認識到，更小體積(小於lml)不足以提供足夠靈敏度和/或可重複性以確信地確定患者是否具有陽性PML診斷。
[0028]在一些實施方案中，將載體核酸添加至從其中分離核酸的CSF樣品。添加載體核酸為待分離的核酸提供體積，從而使待分離的核酸在本文所提供方法的步驟之一過程中損失的可能性最小化。在一些實施方案中，載體核酸為RNA。一般來說，載體核酸的性質將取決於待分離(和分析)的核酸的性質。因此，如果待分離的核酸為DNA，那麼載體核酸可以是RNA(並且反之亦然)。在完成分離方案後，可容易地去除(例如通過添加RNA酶)不再需要的載體核酸RNA。然而，待分析的核酸和載體核酸可具有相同性質，例如均為DNA。在這類情況下，載體核酸將通常具有與待分離(和分析)的核酸不同的大小，從而允許根據需要容易地分離兩種核酸。
[0029]在一些實施方案中，CSF樣品中載體核酸(例如，RNA)的所得濃度為5微克/ ml或更小、4微克/ ml或更小、3微克/ ml或更小、2微克/ ml或更小、I微克/ ml或更小，或0.5微克/ ml或更小。在一些實施方案中，CSF樣品中載體核酸(例如，RNA)的所得濃度為2.8微克/ ml或更小。如本文所用，所得濃度是指CSF樣品中載體核酸的濃度。因此，可以較高濃度製備載體核酸並 且將其稀釋至CSF樣品中。本文出人意料發現，本公開的方法中所使用的載體核酸的濃度(其低於通常使用的濃度)使得從CSF樣品分離的核酸的產率增加。
[0030]在一些實施方案中，所述方法進一步包括將蛋白酶添加至CSF樣品。雖然CSF樣品可能含有比其它生物樣品(例如，血液)少的蛋白質，但是通過蛋白酶的作用去除蛋白質和多肽可增加從CSF樣品分離的核酸的產率。用於從生物樣品中去除蛋白質和多肽的蛋白酶通常為非特異性蛋白酶，如蛋白酶K和枯草桿菌蛋白酶。應認識到，可能需要添加另外組分或可能需要修改樣品的組成，以允許蛋白酶的酶活性。因此，可添加包含特定量的鹽(例如，NaCl或Mg鹽)的緩衝液或pH緩衝液。另外，可能需要在特定溫度下孵育樣品以允許優化的酶條件。在蛋白酶反應發生後，可去除蛋白酶或使其失活。可例如通過添加蛋白酶抑制劑和/或添加蛋白酶輔助因子抑制劑和/或增加樣品溫度和/或改變緩衝條件(例如，通過添加乙醇)來實現失活。
[0031]在一些實施方案中，將載體核酸和蛋白酶添加至CSF樣品。在一些實施方案中,在添加蛋白酶之前添加載體核酸。在一些實施方案中，在添加載體核酸之前添加蛋白酶。在一些實施方案中，蛋白酶與載體核酸一起添加。可與蛋白酶和/或載體核酸一起、在添加蛋白酶和/或載體核酸之前或之後添加蛋白酶緩衝液。在一些實施方案中，可以將另外組分(如溶胞緩衝液)添加至CSF樣品。這些另外組分包括溶菌酶和離液劑(例如，鹽酸胍和脲)。在一些實施方案中，另外外組分為可商購的核酸分離試劑盒中的「溶胞緩衝液」。通常這些試劑盒中的「溶胞緩衝液」是所使用的第一緩衝液。在一些實施方案中，將來自QIAampMinElute ViruS Spin Kit 的緩衝液 「AL」 添加至 CSF 樣品。
[0032]本文出人意料地發現在室溫下孵育包含載體核酸和蛋白酶的CSF樣品之後在高於室溫的溫度(例如，56°C)下的第二孵育步驟使得從CSF中分離核酸的產率增加。因此，在一些實施方案中，本文所公開的方法包括在室溫下孵育包含載體核酸和蛋白酶的CSF樣品的步驟，接著在高於室溫的溫度下的第二孵育步驟。在一些實施方案中，取決於所使用的酶製劑，高於室溫的溫度為30°C或更高、40°C或更高、50°C或更高、60°C或更高、70°C或更高、80°C或更高、90°C或更高、高達100°C。在一些實施方案中，高於室溫的溫度在50°C與60°C之間。在一些實施方案中，例如，如實施例中所描述，高於室溫的溫度為56°C。在一些實施方案中，高於室溫的溫度對應於蛋白酶在其下具有最大活性的溫度。
[0033]在一些實施方案中，取決於所使用的酶製劑，孵育步驟為至少I分鐘、至少2分鐘、至少5分鐘、至少10分鐘、至少15分鐘、至少20分鐘、至少25分鐘、至少30分鐘、至少40分鐘、至少50分鐘、至少60分鐘，或高達120分鐘長。在室溫下的孵育步驟與在高於室溫的溫度下的孵育步驟可具有相同的時間長度或可具有不同的時間長度。在一些實施方案中，例如，如實施例中所描述，在室溫下的孵育步驟與在高於室溫的溫度下的孵育步驟均為15分鐘長。 [0034]孵育包含載體核酸和蛋白酶的CSF樣品之後，通過固相提取法(例如，基於柱的核酸純化)來純化樣品。這些方法通常依賴於以下事實:核酸可取決於PH和所使用的緩衝液的鹽含量結合至固相(二氧化矽或其它)，所述緩衝液可以是Tris-EDTA(TE)緩衝液或磷酸鹽緩衝液。通常，可以與本發明的不同方面一起使用的核酸純化方法包括:
[0035]將樣品(例如，如本文所使用的腦脊髓液樣品)添加至結合柱(或「旋轉」柱)，並且核酸由於較低的PH(相對於柱上的矽烷醇基團)和結合溶液的鹽濃度而結合，所述結合溶液可含有(例如)緩衝液、變性劑(如鹽酸胍)、TritonX_100?、異丙醇以及PH指示劑；
[0036]用(例如)5mM KP04pH8.0或類似、80%乙醇(EtOH))洗滌柱；以及
[0037]用緩衝液或水洗脫核酸。
[0038]根據本發明的方面的方法可以包括將包含載體核酸和蛋白酶的CSF樣品施加至核酸結合柱。核酸結合柱是本領域中已知的，並且包括但不限於基於二氧化矽的柱(參見例如，US5，234，809)和陰離子交換柱。在一些實施方案中，可在將CSF樣品施加至柱之前將離液試劑和/或鹽添加至CSF樣品，以產生對CSF樣品中的核酸結合至核酸結合柱(例如，基於二氧化矽的柱)來說最佳的條件。本文所使用的核酸結合柱不限於特定構型，並且包括基於珠粒的柱，核酸結合組分藉以共價附接至柱的柱、通過重力起作用的柱以及通過真空操作起作用的柱。在一些實施方案中，核酸結合柱為可配合在臺式離心機中的Eppendorf管大小的「微型柱」(例如，QIAamp MinElute Virus Spin Kit或由(例如)Epicentre和Promega提供的其它試劑盒)。
[0039]在將CSF樣品施加至核酸結合柱之後，可通過一種或多種洗滌緩衝液(例如，處於pH7.0左右或pH8.0左右的基於Tris的緩衝液)和/或乙醇等分試樣洗滌柱。洗滌緩衝液的條件應使得核酸與核酸結合柱之間的鍵合/相互作用不被破壞，並且核酸保持結合至核酸結合柱。在一些實施方案中，用包含至少70%乙醇的緩衝液(例如，來自商業核酸分離試劑盒的「洗滌緩衝液」，例如像，QIAamp MinElute Virus Spin Kit的緩衝液AW2)洗滌柱。在一些實施方案中，在用「洗滌緩衝液」洗滌柱之後，進行包含乙醇的二次洗滌。
[0040]在一些實施方案中，核酸結合柱為「微型柱」。在一些實施方案中，可通過使柱(例如，在臺式離心機中)旋轉來去除洗滌物。本文出人意料地發現使柱以相對低的離心力旋轉使得從CSF樣品分離核酸的產率增加。在一些實施方案中，將微型柱以小於7000g、小於6000g、小於5000g、小於4000g、小於3000g、小於2000g或小於1000g的力離心以去除洗滌物。在一些實施方案中，將柱以4000g離心。在一些實施方案中，在以相對低的離心力去除洗滌物之後，隨後將柱以高離心力離心以對柱進行乾燥。
[0041]在將CSF樣品施加至柱並且洗滌柱之後，將洗脫劑施加至柱以從柱收穫核酸。洗脫劑為將溶解結合至核酸結合柱的核酸的緩衝液。洗脫劑包括水和磷酸鹽緩衝液。在一些實施方案中，洗脫劑不含DNA酶和/或RNA酶。在一些實施方案中，洗脫劑還包含DNA酶和/或RNA酶抑制劑，和/或DNA酶和/或RNA酶輔助因子抑制劑。在一些實施方案中，洗脫劑包括微生物毒素(如疊氮化鈉)以防止洗脫劑中的微生物生長。在一些實施方案中，洗脫劑為來自商業核酸分離試劑盒的「洗脫緩衝液」(例如，QIAamp MinElute Virus Spin Kit的AVE緩衝液)。
[0042]施加至核酸結合柱的洗脫劑的體積通常為較大體積與較小體積之間的折衷，所述較大體積有助於從柱攝取較大百分比的核酸，但會導致分離的核酸的濃度較低，所述較小體積導致分離的核酸的濃度較高，但以不能溶解結合到柱的所有核酸為代價。在一些實施方案中，將I微升或更多、5微升或更多、10微升或更多、20微升或更多、30微升或更多、40微升或更多、50微升或更多、60微升或更多、70微升或更多、80微升或更多、90微升或更多、100微升或更多、200微升或更多或500微升或更多的洗脫劑體積施加至柱。在一些實施方案中，將30微升的洗脫劑施加至柱。
[0043]在一些實施方案中，允許洗脫劑在柱上孵育I分鐘或更長、2分鐘或更長、5分鐘或更長、10分鐘或更長、20分鐘或更長、30分鐘或更長,或60分鐘或更長。在一些實施方案中，允許洗脫劑在柱上孵育5分鐘。
[0044]在一些實施方案中，將相同洗脫劑施加至柱多次。因此，在一些實施方案中，將洗脫劑施加至柱、允許孵育並且將所述洗脫劑(現在包含核酸)從柱中去除(例如，通過離心)，並且隨後將所述洗脫劑重新施加至柱，允許第二次孵育，並且第二次去除。在一些實施方案中，將相同洗脫劑施加至柱兩次、三次、四次、高達五次或更多次。在一些實施方案中，將相同洗脫劑施加至柱兩次。
[0045]在一些實施方案中，將30微升的洗脫劑施加至柱，允許孵育5分鐘，從柱中去除(例如，通過離心)，重新施加至柱，允許再孵育5分鐘並且從柱中去除。
[0046]一旦已經將洗脫劑(現在包含從CSF樣品分離的核酸)從柱中去除，就可以在適當溫度(例如，4°C -200C )下儲存所述洗脫劑和/或可以分析所述洗脫劑中的核酸(例如，測定序列和/或數量)。
[0047]核酸擴增[0048]一方面，本公開提供用於測定樣品中的核酸的量的方法。在一些實施方案中，核酸為DNA。在一些實施方案中，核酸為病毒核酸。在一些實施方案中，核酸為病毒DNA。在一些實施方案中，核酸為JC病毒DNA。在一些實施方案中，核酸是從CSF樣品分離的。在一些實施方案中，核酸是通過本文所公開的任何方法從CSF樣品分離的。在一些實施方案中，核酸為從CSF樣品分離的JC病毒DNA。在一些實施方案中，核酸是通過以下方法從CSF樣品分離的JC病毒DNA:將載體核酸和蛋白酶添加至CSF樣品，孵育包含所述載體核酸和所述蛋白酶的樣品，將孵育的樣品施加至核酸結合柱，洗滌施加有所述樣品的柱，並且將洗脫劑施加至所述柱。
[0049]然而，應認識到，本發明的方面(例如，純化和/或擴增技術)可與任何適合的技術和/或用於結合和/或分離核酸(例如，從CSF中)的基質組合使用。
[0050]一方面，本公開提供用於測定樣品中的核酸的量的方法，所述方法包括在樣品上進行實時聚合酶鏈式反應(實時PCR)，其還被稱為實時定量PCR。實時PCR測定樣品中的病毒核酸的量的方法是已良好確立的(參見例如，McKay等，Real-time PCR invirology, Nucl.Acids Res.2002,20:1292)。簡單地說，在實時PCR中，將可雜交至目標序列(例如，病毒DNA序列)的兩個引物和核酸探針添加至樣品。如果存在目標序列，那麼所述序列將通過結合PCR引物和PCR反應而擴增。將通過由探針結合來檢測/定量PCR核酸產物。通常，核酸探針包括報導元件如螢光標記(例如，6-羧基螢光素，縮寫:FAM))和淬滅劑 (例如，四甲基羅丹明，縮寫:TAMRA)。http: / / en.wikipedia.0rg / wiki /Fluorescein在結合至PCR反應產物之前，將螢光標記淬滅並且沒有觀察到螢光。如果存在目標序列，那麼探針將結合至PCR產生的序列拷貝(注意，如果存在靶標，那麼探針還可結合至靶序列)。探針的結合將導致淬滅劑從螢光標記物理分離，從而產生螢光信號。在一些實施方案中，螢光標籤由聚合酶(例如，Taq聚合酶)的5』核酸酶活性釋放。信號強度將與存在的目標序列的量成比例，從而 允許測定存在的目標序列的量(例如，拷貝數)。通常，量以具有已知量的序列的樣品為基準。多個商業實體提供材料，包括「實體實驗」組分，如聚合酶、試劑盒以及運行實時PCR實驗的硬體。供應商包括Qiagen、Invitrogen、AppliedBiosystems 以及 Bio-Rad。
[0051]一方面，本公開提供用於測定樣品中的JC病毒DNA的量的方法，所述方法包括進行實時聚合酶鏈式反應。在一些實施方案中，實時PCR引物和探針針對JV病毒T抗原。在一些實施方案中，引物對應於核酸序列5fCCC TAT TCA GCA CTT TGT CC3，(SEQ ID NO:1)和5』TCA GAA GTA GTA AGG GCG TGG AG3』 (SEQ ID NO: 2)，並且探針序列對應於 5』-AAA CAAGGG AAT TTC CCT GGC CCT CC-3，(SEQ ID NO:3)。在一些實施方案中，探針螢光標記為FAM並且淬滅劑為TAMRA。在一些實施方案中，螢光標記位於探針的5』端，並且淬滅劑位於3』端。在一些實施方案中，探針為 5』FAM-AAA CAA GGG AAT TTC CCT GGC CCT CC-TAMRA3 (SEQID NO:3)。然而，應認識到，本公開還涵蓋替代性螢光標記、淬滅劑和/或螢光標記和/或淬滅劑在探針序列上的替代性定位。
[0052]雖然先前已經使用JV病毒T抗原序列作為實時PCR的靶序列(參見Ryschkewitsch 等，JOf Virological methods2004,121:217),但是本文發現具有 SEQ IDNOl和2的引物與具有SEQ ID NO:3的探針的組合提供優異結果。然而，在一些實施方案中，可使用一個或多個其它探針或引物(例如，靶向至JCV T抗原序列的那些)。[0053]還應認識到，可使用其它基於擴增(例如，PCR等)、基於雜交、基於測序的檢測技術和/或其它檢測技術(例如，使用本文所描述的一個或多個引物或探針)。
[0054]核酸
[0055]—方面，本公開提供分離的核酸。在一些實施方案中，適用於檢測JCV的核酸對於JCV具有特異性(例如，相對於BK病毒或可存在於生物樣品中的其它病毒核酸)。在一些實施方案中，核酸與JCV序列互補，但是不與來自其它病毒的序列互補。在一些實施方案中，適用於檢測JCV的核酸被設計來檢測保守JCV區域(例如，核酸與保守JCV基因組區域互補，例如100%互補)，以便無論其它變體序列是否存在於JCV基因組中都能檢測JCV的存在。在一些實施方案中，核酸為針對(例如，互補於，例如100%互補於)JC病毒T抗原編碼序列的任一鏈的引物和探針。在一些實施方案中，核酸允許通過實時PCR測定樣品中的JC病毒的量。在一些實施方案中，分離的核酸包含SEQ ID N0:1。在一些實施方案中，分離的核酸包含SEQID N0:2。在一些實施方案中，分離的核酸包含SEQ IDNO:3。在一些實施方案中，分離的核酸由SEQ ID N0:1組成。在一些實施方案中，分離的核酸由SEQ ID NO:2組成。在一些實施方案中，分離的核酸由SEQ ID N0:3組成。
[0056]在一些實施方案中，分離的核酸是包含SEQ ID NO:1的核酸引物。在一些實施方案中，分離的核酸是包含SEQ ID NO:2的核酸引物。在一些實施方案中，分離的核酸是包含SEQ ID NO:3的核酸探針。在一些實施方案中，分離的核酸是由SEQ ID NO:1組成的核酸引物。在一些實施方案中，分離的核酸是由SEQ ID NO:2組成的核酸引物。在一些實施方案中，分離的核酸是由SEQ ID NO:3組成的核酸探針。本文所公開的分離的核酸可進一步具有一個或多個官能團(例如，螢光標記)。在一些實施方案中，對應於SEQ ID N0:3的核酸為包含螢光標記和淬滅劑的核酸探針。在一些實施方案中，對應於SEQ ID N0:3的核酸探針為探針 5』 FAM-AAA CAA GGG AAT TTC CCT GGC CCT CC-TAMRA3 (SEQ ID NO:3)。
[0057]試劑盒`
[0058]一方面，本公開提供用於從腦脊髓液(CSF)樣品分離核酸的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包括蛋白酶、載體核酸、核酸結合柱以及使用說明書。
[0059]在一些實施方案中，試劑盒進一步包括針對JC病毒T抗原的實時PCR引物和探針。在一些實施方案中，實時PCR引物和探針的序列分別為SEQID NO:1-2和SEQ ID NO:3。
[0060]在一些實施方案中，本發明涉及用於分離和或檢測來自患者(例如，來自人CSF樣品)的樣品中JCV的存在的試劑盒。因此，本發明的方面涉及試劑盒，其含有用於分離和製備核酸的一種或多種組分和/或用於測定具有特定序列的核酸的存在和/或量的一種或多種組分。在一些實施方案中，試劑盒含有一種或多種緩衝液和/或用於從生物樣品(例如，CSF樣品)中分離JCV顆粒和/或JCV核酸的其它溶液，以及任選地用於進行一個或多個分離步驟的說明書。在一些實施方案中，試劑盒含有用於檢測樣品中的JCV核酸的一種或多種試劑。例如，試劑盒可包括具有特定序列的核酸。在一些實施方案中，可作為乾燥粉末(例如，凍幹製劑)提供核酸(例如，核酸引物)。在一些實施方案中，核酸可提供於溶液中。溶液可以是稀釋劑、緩衝液、鹽溶液、水溶液或其它溶液，包括(例如)水。溶液可含有已知(例如，預定)濃度的核酸。試劑盒可含有用於將核酸溶液稀釋至為一種或多種特定成分所限定的一個或多個適當濃度的說明書，將對所述特定成分做標記用於後續驗證或質量控制目的。在一些實施方案中，試劑盒可含有一種或多種寡核苷酸(例如，PCR引物)，其可以用於檢測生物樣品(例如，CSF樣品)中具有特定序列的核酸的存在。試劑盒還可含有一種或多種酶和/或用於進行本發明的核酸分離、檢測和/或定量測定的其它試劑。在一些實施方案中，試劑盒可含有參考序列和/或具有特定目標序列的參考核酸。還可在試劑盒中提供參考水平(例如，關於參考水平的信息)和/或含有處於參考水平的核酸的參考樣品。所述信息和/或酸可以用作對照。在一些實施方案中，試劑盒還可包括用於從患者樣品(例如，CSF樣品)中分離核酸(例如，JCV核酸)的說明書。
[0061]在一些實施方案中，試劑盒包括至少一個容器裝置，其具有安置在其中的本文所描述的一種或多種試劑(例如，洗滌緩衝液、溶胞緩衝液、蛋白酶、洗脫緩衝液等)和/或核酸(例如，PCR引物、檢測探針等)。在某些實施方案中，試劑盒進一步包括包含一種或多種其它試劑或探針的其它容器。試劑盒還可含有檢測試劑。在一些實施方案中，試劑盒中的一種或多種探針可以被標記。在一些實施方案中，試劑盒可包括用於標記探針(例如，在與JCV核酸接觸之前或之後)的試劑。檢測試劑的實例包括但不限於:放射性標記、螢光標記、酶標記(例如，辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶)以及親和標記(例如，生物素、抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白)。
[0062]詳細地說，分隔式試劑盒包括任何試劑盒，其中試劑包含在單獨的容器中。所述容器包括小玻璃容器、塑料容器，或塑料或紙的條帶。所述容器允許試劑從一個隔室有效轉移至另一個隔室，以使得樣品和試劑不會交叉汙染並且可以將每個容器的藥劑或溶液以定量方式從一個隔室添加至另一個。在一些實施方案中，試劑盒可包括將接受測試樣品的容器、含有測定中所使用的探針或引物的容器、含有洗滌試劑(如磷酸鹽緩衝鹽水、Tris緩衝液及類似物)的容器以及含有用於檢測雜交探針、擴增產物或類似物的試劑的容器。
[0063]通過以下實施例進一步說明本發明，所述實施例決不應當被解釋為進一步的限制。整個本申請中所引用的所有文獻(包括參考文獻、發布的專利、公布的專利申請以及共同未決的專利申請)的全部`內容特此以引用的方式明確併入，特別是對於上文參考的教義來說。
實施例
[0064]實施例1:從腦脊髓液(CSF)中提取DNA
[0065]材料和方法
[0066]-對QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Cat#57704, QIAGEN)方案進行修改用於處理人CSF樣品。以下緩衝液用於DNA提取
[0067]-通過將30mL乙醇(96%-100% )添加至含有13mL緩衝液AW2濃縮物的瓶中並且充分混合來製備緩衝液AW2。將緩衝液儲存在環境溫度下。
[0068]-通過將1.4mL緩衝液AVE添加至凍幹QIAGEN蛋白酶的瓶中並且輕柔地混合來製備QIAGEN蛋白酶。將蛋白酶儲存在2°C _8°C下。
[0069]-載體RNA溶液(Iμ g / μ L):通過將310 μ L緩衝液AVE添加至凍幹載體RNA的管中以製得I μ g / μ L溶液並且通過脈衝渦旋進行混合來製備。將載體RNA儲存在-20+1 (TC下並且不經受多於三次凍融。緩衝液AL中的載體RNA的最終濃度為5.6μ g / mL。例如，對於η樣品，將[(1.1) X (5.6) X (η) ] μ L的載體RNA溶液添加至[(1.1) X (n) JmL緩衝液AL。通過輕柔倒置來混合試劑並且在製備當天使用。
[0070]DNA 提取
[0071]將冷凍的CSF融化至室溫並且以5000g離心5分鐘。離心之後，用移液管將1000 μ L的CSF吸移至15mL離心管中。將QIAGEN蛋白酶(125 μ L)和AL緩衝液-載體RNA溶液(5.6 μ g / mL, 1000 μ L)添加至 CSF。
[0072]將樣品渦旋15秒並且在室溫下孵育15分鐘，隨後在56°C下在水浴中孵育15分鐘。
[0073]孵育之後，將1250 μ L乙醇(96% -100% )添加至樣品並且通過脈衝渦旋15秒充分混合。隨後將溶胞產物在室溫(15°C -25°C )下孵育7分鐘。
[0074]通過將全部溶胞產物施加至QIAamp Minelute柱中，使用QIAvac24Plus真空歧管(Cat#19413, QIAGEN)來處理溶胞產物。如果需要，那麼多次施加用於施加全部溶胞產物。在結合之後，用5001^緩衝液4胃2洗滌柱並且以4000g離心I分鐘，隨後用500 μ L乙醇(96% -100% )洗滌並且以4000g離心I分鐘。
[0075]通過以13000g離心3分鐘來乾燥QIAamp Minelute柱,隨後在柱的蓋子關閉的情況下，以13000g離心2.5分鐘。
[0076]當柱乾燥時，將其放置在乾淨的不合DNA酶的微離心管中，並且將30 μ L緩衝液AVE施加至膜的中心並且孵育5分鐘。孵育之後，將管以全速離心I分鐘。為了增加所洗脫的DNA的量，將洗脫物從管 中去除，並且重新施加至膜的中心，隨後孵育5分鐘並且以全速離心I分鐘。
[0077]提取之後，I μ L DNA用於DNA定量並且儲存20 μ L用於PCR分析。
[0078]實施例2:用於JCVDNA定暈的實時PCR測定
[0079]材料和方法
[0080]針對JC病毒基因組的T抗原基因的保守區域設計引物和探針，並且進行BLAST搜
索以確保交叉反應性。引物和探針的序列如下:
[0081]
【權利要求】
1.一種用於從腦脊髓液(CSF)樣品分離核酸的方法，所述方法包括: 將載體核酸和蛋白酶添加至CSF樣品， 孵育包含所述載體核酸和所述蛋白酶的樣品， 將孵育的樣品施加至核酸結合柱， 洗滌施加有所述樣品的所述柱，以及 將洗脫劑施加至所述柱，從而導致所述核酸的分離。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述CSF樣品的體積為至少1ml。
3.如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述載體核酸為載體RNA。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述CSF樣品中的所述載體RNA的所得濃度為2.8微克/ ml或更小。
5.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中孵育所述樣品包括在室溫(RT)下孵育所述樣品的第一步驟和在高於RT的溫度下孵育所述樣品的第二步驟。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述孵育步驟為15分鐘長。
7.如權利要求5或權利要求6所述的方法，其中所述高於RT的溫度為56°C。
8.如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中洗滌所述柱包括將洗滌緩衝液添加至所述柱並且以4000g的離心力使所述柱旋轉。·
9.如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中施加洗脫劑包括將所述洗脫劑施加至所述柱至少兩次。
10.如權利要求1至9中任一項所述的方法，其中將所述洗脫劑在所述柱上孵育5分鐘。
11.如權利要求1至10中任一項所述的方法，其中施加30微升的洗脫劑。
12.如權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述CSF樣品中的所述核酸為DNA。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述DNA為病毒DNA。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述病毒DNA為JC病毒DNA。
15.如權利要求14所述的方法，其進一步包括進行實時聚合酶鏈式反應(實時PCR)來測定JC病毒DNA的量。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述實時PCR引物和探針針對所述JC病毒T抗原。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述實時PCR引物和探針的序列分別為SEQIDNO:1-2 和 SEQ ID NO:3。
18.一種用於測定樣品中的JC病毒DNA的量的方法，所述方法包括: 在所述樣品上進行實時PCR，其中所述實時PCR引物和探針針對所述JC病毒T抗原。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述實時PCR引物和探針的序列分別為SEQIDNO:1-2 和 SEQ ID NO:3。
20.一種用於從腦脊髓液(CSF)樣品分離核酸的試劑盒，所述試劑盒包括蛋白酶、載體核酸、核酸結合柱以及使用說明書。
21.如權利要求20所述的試劑盒，其進一步包括針對所述JC病毒T抗原的實時PCR引物和探針。
22.如權利要求21所述的試劑盒，其中所述實時PCR引物和探針的序列分別為SEQIDNO:1-2 和 SEQ ID NO:3。
23.一種核酸引物，其包含SEQIDNO:10
24.—種核酸引物，其包含SEQIDNO:20
25.一種核酸 探針，其包含SEQIDNO:30
【文檔編號】C07H21/00GK103827319SQ201280046246
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年7月27日 優先權日:2011年7月29日
【發明者】索馬·雷 申請人:生物基因Idec Ma公司