兩個小分子肽及其製備方法和在製備抗病毒藥物中的應用與流程

2023-05-06 03:41:26 2

技術領域：

本發明屬於海洋生物領域，具體涉及一個環五肽化合物和一個線性肽化合物及其製備方法和在製備抗hsv-1病毒藥物中的應用。

背景技術：
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海洋生物資源豐富，代謝產物類型多樣，結構新穎，有較好的生物活性，是近年來研究學者的焦點。肽類化合物是海洋生物代謝產物中的一大類型，目前發現的海洋肽類具有細胞毒、抗菌、抗汙損等活性，另一類具有神經藥理活性，如芋螺的肽類毒素ziconotide具有鎮痛作用，是第一個海洋藥物(商品名為prialt)，被用作治療脊髓損傷引起的慢性疼痛。在海洋微生物的次級代謝產物中，肽類化合物也佔有重要的比例，海洋細菌的代謝產物超過56％的是肽類化合物。

孢疹病毒屬於孢疹病毒家族的成員，具有α，β，γ三個類型，其中hsv-1s屬於α型。hsv的臨床表現是多樣性的，一般為輕症或無症狀感染，但新生兒和免疫低下者能引起嚴重的感染。hsv-1主要通過呼吸道、皮膚和黏膜密切接觸感染，引起口唇、咽、眼及皮膚感染，少數則引起生殖感染。當原髮型孢疹感染後，由於其殘存的病毒長期潛存與三叉神經(hsv-1)，當機體體抗力降低或某些激發因素如發熱、受涼、感染等會引起復發性感染。

目前臨床主要用核苷類藥物治療單純孢疹病毒感染，適用於hsv-的原發性和復發性感染，對潛伏期則難以奏效，常用的藥物主要是阿昔洛韋及其類似藥物，選擇性高，對正常細胞毒性小，但長期使用有一定的副作用，引起接觸性皮炎等，產生耐藥朱，因此，開發利用新的資源，尋求更好地抗hsv藥物已勢在必行。

技術實現要素：
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本發明的第一個目的是提供具有抗hsv-1病毒活性的一個新環五肽化合物aspergillpeptided和一個新線性肽化合物aspergillpeptidee。

本發明的一個新的環五肽化合物和一個新的線性肽化合物，其結構式如式(ⅰ)所示，

其中化合物1：命名為aspergillpeptided；化合物2：命名為aspergillpeptidee。

本發明的環五肽化合物aspergillpeptided、線性肽化合物aspergillpeptidee是通過以下方法製備的，該方法包括以下步驟：

(a)製備麴黴菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397的發酵液；

(b)將步驟(a)得到的發酵液用大孔樹脂吸附，接著用水衝洗大孔樹脂去掉培養基成分，再用甲醇或乙醇衝洗大孔樹脂得到甲醇或乙醇提取物；也可將步驟(a)得到的發酵液用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶劑萃取，濃縮得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物；

(c)將步驟(b)所述甲醇提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物經過正相矽膠柱層析，依次用二氯甲烷與甲醇體積比例分別為100％、90％、80％、70％、60％和50％的二氯甲烷-甲醇系統梯度洗脫，分別收集用二氯甲烷體積分數為90％和60％的二氯甲烷-甲醇為洗脫劑衝洗下來的組份a，b，這兩個組分分別經過矽膠柱和凝膠柱層析得到粗品，經hplc純化，分別得到化合物aspergillpeptided以及化合物aspergillpeptidee。

步驟(a)中所述的發酵液可通過以下方法製備：將麴黴菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397接種到麴黴屬真菌適用的培養基中，在通常的發酵條件下製得，優選的製備方法是將麴黴菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397在麴黴屬真菌適用的平板培養基中生長，待真菌長出孢子後，用竹籤將真菌從平板上至盛有水的三角瓶中，用移液槍將真菌液接種到培養基中(1l三角瓶中盛有300ml培養基)，於室溫靜置培養30天，得到發酵液，所述的培養基為：每升含山梨醇20g，酵母膏3g，mgso4·7h2o0.3g，味精10g，色氨酸2g，kh2po40.5g，麥芽糖20g，海鹽30g，甲醇5ml，餘量為水，ph6.5。

步驟(b)所述的濃縮採用減壓濃縮。

本發明的環五肽化合物aspergillpeptided、線性肽化合物aspergillpeptidee經實驗發現，它們具有抗hsv-1病毒活性，其ic50值分別為9.5、19.8μm；且化合物aspergillpeptided在濃度12.5μm時也能抑制阿昔洛韋耐藥菌株hsv-1-106和hsv-1-153所致的細胞病變，抑制率約50％。

由此本發明的第三個目的是提供環物肽化合物aspergillpeptided或線性肽化合物aspergillpeptidee在製備抗病毒藥物中的應用。

所述的抗病毒藥物優選為抗hsv-1病毒藥物。

一種抗病毒藥物，其特徵在於，含有化合物aspergillpeptided或化合物aspergillpeptidee作為活性成分。

本發明的第四個目的是提供麴黴菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397在製備環五肽化合物aspergillpeptided及一個線性肽化合物aspergillpeptidee中的應用。

本發明從一株柳珊瑚共附生麴黴菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397的發酵液中分離得到兩個新的具有抗hsv-1病毒活性的環五肽化合物aspergillpeptided、線性肽化合物aspergillpeptidee，這些化合物具有抗hsv-1病毒活性，可以開發成具有抗hsv-1病毒的抗生素的先導化合物。

本發明的aspergillussp.scsgaf0076，於2012年10月11日保藏於中國典型培養物保藏中心(cctcc)，地址：中國武漢武漢大學，其保藏編號為：cctccno：m2012397，該菌種公開於專利號：zl201210431886.6，發明名稱：一類環四肽化合物及其製備方法和在製備抗汙損劑中的應用的專利中。

具體實施方式：

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

實施例1：

將山梨醇20g，酵母膏3g，mgso4·7h2o0.3g，味精10g，色氨酸2g，kh2po40.5g，麥芽糖20g，甲醇5ml，海鹽30g混合，用水定容到1l，調節ph至6.5，得到1l培養基，按照此方式配置培養基。將該培養基裝入約330個1000ml的三角燒瓶中，每瓶約300ml，在115℃高壓蒸汽滅菌25分鐘。

將麴黴菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397在麴黴屬真菌適用的平板培養基中生長，待真菌長出孢子後，用竹籤將真菌從平板上移至盛有水的三角瓶中，用移液槍將真菌接種到培養基中(1l三角瓶中盛有300ml培養基)，於室溫(26℃)靜置培養30天後，收取發酵液。

將經上述培養基培養得到的發酵液100l用大孔樹脂吸附，接著用水衝洗大孔樹脂去掉培養基成分，再用乙醇(也可用甲醇)衝洗大孔樹脂得到乙醇提取物，(發酵液也可用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿萃取)，減壓濃縮得到乙醇粗提物85g。乙醇粗提物用正相矽膠(100-200目)幹法拌樣後，裝入玻璃層析柱(h細矽膠)，常溫減壓柱層析，依次用二氯甲烷體積分數為100％、90％、80％、70％、60％、50％的二氯甲烷-甲醇系統梯度洗脫(甲醇比例不斷加大)，根據薄層層析情況合併各個流分，回收洗脫溶劑，蒸乾流分用甲醇轉移。分別收集用甲醇體積分數為90％和60％的二氯甲烷-甲醇為洗脫劑衝洗下來的組份a，b。組分a經常壓矽膠柱層析分離(直徑3cm，柱長60cm，含h細矽膠填料)，用氯仿/甲醇(v/v100:0-50:50)為洗脫溶劑系統，梯度洗脫得到5個小組分，其中用氯仿/甲醇(v/v90:10)洗脫得到的組分經反相矽膠幹法拌樣後，裝入玻璃層析柱(直徑5cm，柱長50cm，含反相rp-18填料)，常溫減壓柱層析，依次用甲醇體積分數為10％、30％、40％、50％、60％、70％、85％和100％的水-甲醇系統梯度洗脫(甲醇比例不斷加大)，收集甲醇體積分數為60％的組分，經過凝膠(直徑10mm，柱長1600mm，凝膠為sephedexlh-20，流動相為體積比1:1的甲醇-氯仿)，得粗品，粗品採用高效液相製備分離，檢測波長為280nm，流速為5ml/min，流動相為甲醇-水(v/v47:53)，色譜柱為phenomenexgemini10mm×250mm，得到化合物1(tr＝27.0min)。組分b經正相矽膠柱層析依次用二氯甲烷體積分數為100％、90％、80％、70％、60％、50％的二氯甲烷-甲醇系統梯度洗脫，收集二氯甲烷體積分數為80％洗脫的組分，再採用反相層析柱層析依次用甲醇體積分數為10％、30％、40％、50％、60％、70％、85％和100％的水-甲醇系統梯度洗脫(甲醇比例不斷加大)，收集甲醇體積分數為45％洗脫的組分，採用高效液相製備分離，檢測波長為280nm，流速為5ml/min，流動相為乙腈-水(v/v72:28)，色譜柱為phenomenexgemini10mm×250mm，得到化合物2(tr＝30.0min)

結構推定：

化合物1，1h和13cnmr譜數據如表1所示，通過高分辨質譜(hresims)在m/z處給出準分子離子峰728.3680[m+h]+，結合nmr波譜數據，得知化合物的分子式為c40h49n5o8。13cnmr譜顯示在低場區有5個醯胺或酯羰基的碳信號(δc168.4，169.0，169.6，170.2，170.5)，在高場區有5個胺基酸的α-c信號(δc49.2，55.4，55.4，60.7，62.0)，1hnmr譜顯示出3個醯胺質子信號(δh8.63，6.99，6.63)，這說明該化合物是一個環肽類化合物。通過hsqc、hmbc以及h-hcosy信號，可知該化合物含有2個氧甲基酪氨酸(o-me-tyr)，氮甲基酪氨酸(n-me-tyr)，脯氨酸(pro)，纈氨酸(val)，進一步通過hsqc、hmbc以及h-hcosy，我們推測出該化合物胺基酸片段的連接方式為val-(n-me-)tyr-(o-me-)tyr-(o-me-)tyr-pro，確定該化合物的平面結構如式(ⅰ)示。

化合物1的絕對構型通過marfey反應得以確定。基本方法：①化合物水解。稱取該化合物0.5mg溶於1ml的6nhcl中，115℃條件下17小時，冷卻蒸乾後溶於100ul水中；②marfey反應。100ul水樣樣品中，加1m的nahco320ul，fdaa(1％，丙酮溶解)100ul，40℃條件下1小時，冷卻後，加入20ul2mhcl，蒸乾後溶於甲醇；③hplc分析。用15％-45％的乙腈/水進行梯度洗脫，其中水相中含有0.04％tfa，流速1.0ml/min，檢測波長340nm，分析用色譜柱為ymc-packods-acolumn(250×10mm)。標準品d-ala,l-ala,d-pro,l-pro,n-me-d-tyr,n-me-l-tyr,o-me-d-tyr,o-me-l-tyr,用同樣的方法進行上述②，③處理。最終通過比較反應物的fdaa衍生物和標準品fdaa衍生物在hplc分析的保留時間確定為l-val,n-me-d-tyr,o-me-l-tyr,andl-pro(如式ⅰ示)，由此確定化合物1的結構式如式(ⅰ)中的1所示，化合物1命名為aspergillpeptided。

化合物2，1h和13cnmr譜數據如表2所示，通過高分辨質譜(hresims)在m/z處給出準分子離子峰467.2296[m+h]+，結合nmr波譜數據，確定化合物的分子式為c25h30n4o5。13cnmr譜顯示在低場區有3個醯胺或酯羰基的碳信號(δc161.9，171.9，173.5)，1hnmr譜顯示出3個醯胺質子信號(δh8.78，8.63，10.85)，這說明該化合物是一個肽類化合物，通過hsqc、hmbc以及h-hcosy信號，推測該化合物包含3個胺基酸片段，分別為纈氨酸(val)，酪氨酸(tyr)和色氨酸(trp)。進一步通過hmbc相關信號，nh-val(δh8.63)與c＝o-trp(δc171.9)相關，nh-trp(δh8.78)與c＝o-tyr(δc161.9)相關，從而確定該化合物胺基酸的排列方式為tyr-trp-val，確定該化合物的平面結構如式(ⅰ)示。

化合物2的絕對構型通過上述相同的marfey反應得以確定。化合物水解後，標準品d-val，l-val，d-tyr，l-tyr，d-trp，l-trp用相同的方法進行處理，最終通過比較反應物的fdaa衍生物和標準品fdaa衍生物在hplc分析的保留時間確定為d-val，d-tyr。化合物中的色氨酸經過水解後，hplc沒有檢測到色氨酸，由於l型色氨酸作為前體物質加入到培養基中，所以我們推測該化合物中的色氨酸的構型為l-trp，化合物2的結構式如式(ⅰ)中的2所示，化合物2命名為aspergillpeptidee。

表1：化合物1的1h和13c數據(500,125mhz,dmso-d6,δppm)

表2：化合物2的1h和13c數據(500,125mhz,dmso-d6,δppm)

實施例2：環五肽類化合物aspergillpeptided、線性肽化合物aspergillpeptidee的抗hsv-1病毒活性測試

通過採用mtt法觀察樣品對vero細胞的細胞毒性、以及細胞病變效應法(cpe法)測試樣品對單純皰疹病毒(hsv-115577)菌株、阿昔洛韋耐藥菌株hsv-1-106、以及阿昔洛韋耐藥菌株hsv-1-153所致細胞病變的抑制作用，了解aspergillpeptided和aspergillpeptidee的抗單純皰疹病毒ⅰ型(hsv-ⅰ)作用。細胞病變效應法簡述如下：(1)vero細胞以1.5*105個/ml接種於96孔細胞培養板中，100ug/孔，置37度，5％co2，培養24h長成單層。(2)棄生長培養液，將不同濃度的環五肽類化合物aspergillpeptided、線性肽化合物aspergillpeptidee與hsv-1病毒稀釋液(100tcid50)等體積混合後加至單層細胞，每個濃度設4個復孔，同時設陽性藥物阿昔洛韋(acv)對照組、正常細胞對照組及病毒對照組。(3)37℃，5％co2繼續培養48h。(4)48h後，光鏡下觀察，記錄細胞病變效應(cpe)。細胞病變程度評價：0～25％為+，26％～50％為++，51％～75％為+++，76％～100％為++++。詳細實驗方法參考文獻(j.ethnopharm.2002,79,205–211)所述。

實驗結果顯示，細胞毒活性測試表明化合物aspergillpeptided和aspergillpeptidee抑制宿主vero細胞生長的最大無毒濃度tc0分別為81.9,153.2μm；在它們的最大無毒濃度下，化合物aspergillpeptided和aspergillpeptidee抗hsv-1病毒的ic50值分別為9.5、19.8μm；此外，化合物aspergillpeptided在濃度12.5μm時也能抑制阿昔洛韋耐藥菌株hsv-1-106和hsv-1-153所致的細胞病變，抑制率約50％。陽性對照阿昔洛韋抗hsv-1病毒的ic50值為3.0μm，抑制宿主vero細胞生長的最大無毒濃度tc0為>1000μm。雖然aspergillpeptided和aspergillpeptidee的抗hsv-1病毒活性不如阿昔洛韋，但它們不屬於阿昔洛韋系列的核苷類化合物，作用機制將與阿昔洛韋不同，且化合物aspergillpeptided對阿昔洛韋耐藥菌株hsv-1-106和hsv-1-153也有較好抑制作用。由此可見aspergillpeptided、aspergillpeptidee具有較好抗hsv-1病毒活性。