表達亞洲1型口蹄疫病毒vlp的重組腺病毒及其應用的製作方法

2023-05-06 11:06:16

專利名稱：：表達亞洲1型口蹄疫病毒vlp的重組腺病毒及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種重組腺病毒，尤其涉及一種表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒，本發明還涉及該重組腺病毒的構建方法以及該重組腺病毒在預防口蹄疫中的應用，屬於口蹄疫的預防領域。
背景技術：
：口蹄疫(FMD)是偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，其病原為口蹄疫病毒(FMDV)。鑑於口蹄疫對世界經濟造成的嚴重危害，國際獸疫局(OIE)和聯合國糧農組織(FAO)將其列為A類傳染病之首，我國也將其列在一類動物傳染病的第一位。疫苗接種是特異性預防FMD的有效手段，安全有效的疫苗是成功地預防、控制乃至最終消滅FMD的先決條件。雖然OIE推薦的FMD滅活疫苗在消滅歐洲的口蹄疫以及控制世界其他國家的口蹄疫過程中發揮了重要作用，但是目前的口蹄疫疫苗主要存在如下一些致命性缺點，需要更新換代1)生產疫苗用種毒均為強毒株在歐洲曾經發生多起活病毒在生產中逃逸疫苗加工廠、病毒滅活不徹底導致FMD暴發的案例；2)在中國，製備FMD滅活疫苗的抗原未經提純，因此免疫期較短、副作用較大、對於感染動物和免疫動物的鑑別診斷也存在幹擾；3)製備疫苗的抗原需要提純，會大幅提高疫苗的製作成本，這在發展中國家難以承受；4)由美國聯合生物醫學公司生產，2008年在中國上市的FMD合成肽疫苗，克服了FMD滅活疫苗的上述缺點，但短肽受MHC種屬限制，目前只能用於豬而對牛無效，而且時刻面對因流行毒株發生抗原變異而失效或效力降低的危險。基於上述原因，目前國內外研究者都在尋求一種更加安全和有效的FMD疫苗，以克服常規疫苗和合成肽疫苗存在的缺點和不足，其中，利用缺損型腺病毒活載體構建的口蹄疫病毒樣顆粒疫苗已成為研究的熱點，最有希望成為第二代口蹄疫疫苗。迄今為止，還沒有Asia1型口蹄疫病毒樣顆粒的報導。由於FMDV是高變異的病毒，不同血清型的病毒如0型和Asial型口蹄疫的核苷酸序列差異在15%以上，另外，FMDV的基因組結構獨特，正確地克隆和組裝十分困難，因此構建正確表達的FMD病毒樣顆粒並能夠在動物體內誘導出高水平的中和抗體在技術上是十分困難的。
發明內容本發明的目的之一是提供一種由FMDV衣殼蛋白前體P1-2A基因和3C基因拼接在一起而得到的一種融合基因；本發明的目的之二是提供一種能夠高效表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒；本發明目的之三是將上述重組腺病毒應用於預防或治療口蹄疫；本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的一種由口蹄疫病毒(FMDV)衣殼蛋白前體P1-2A基因和3C基因拼接在一起而得到的一種融合基因，其鹼基序列為SEQIDN0:1所示。將SEQIDNO:1所示的鹼基序列與腺病毒穿梭載體相連接，得到重組腺病毒穿梭載體；將重組腺病毒穿梭載體重組進入人缺損腺病毒5型，篩選得到能夠高效表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒；優選的，本發明所述的能夠高效表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒(rAdV-AsialP12A3C)的微生物保藏號是CGMCCNo.3467；分類命名是腺病毒；保藏時間是2009年11月27日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。將本發明所構建的重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C在293細胞上培養，用FMDV共享表位單克隆抗體進行免疫螢光檢測為陽性，而且培養上清用Westernblot檢測呈現中等強度的陽性反應，表明Asial型口蹄疫VLP在哺乳類293細胞中實現了高效表達。一步生長曲線測定重組腺病毒在293細胞中的複製能力，表明在接種後60h，重組腺病毒的複製水平達到高峰；外源基因在病毒傳代過程中穩定表達，並能夠形成FMDV病毒樣顆粒，當重組腺病毒傳至第8代時毒價可達7.9X108PFU/ml。rAdV_AsialP12A3C接種小鼠在5周內產生口蹄疫特異性中和抗體，在首次免疫後9周(二免後3周)中和抗體達到峰值；而且二次免疫組誘導產生的中和抗體水平明顯高於一次免疫組，由此誘導的具有保護水平的中和抗體可持續21周。試驗結果表明，本發明所構建的用缺損腺病毒表達的亞洲1型口蹄疫病毒VLP，在小鼠體內可持續誘導高水平的中和抗體，可作為預防Asial型口蹄疫的疫苗。圖1重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C感染293細胞引起的細胞病變；(A)正常293細胞；(B)感染rAdV-AsialP12A3C的293細胞。圖2重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C在293細胞中的PCR鑑定；L:DL15000DNALadder；1=H2O；2=WtAdV；3-6第2，4，6禾口8代rAdV-AsialP12A3C。圖3用間接免疫螢光試驗檢測重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C感染的293細胞；(A)rAdV-AsialP12A3C感染的293細胞；(B)wtAdV感染的293細胞。圖4用Westernblot分析FMD病毒樣顆粒在重組腺病毒rAdV_AsialP12A3C感染細胞中的表達；1.野生型腺病毒感染的293細胞；2-4.rAdV-AsialP12A3C感染的293細胞；5.預染的蛋白Marker；6.FMDV146S蛋白。圖5重組腺病毒rAdV_AsialP12A3C的一步生長曲線。圖6重組腺病毒rAdV_AsialP12A3C接種BALB/c小鼠IgG抗體的動態變化；a.重組腺病毒一次免疫組小鼠IgG抗體的動態；b.重組腺病毒二次免疫組小鼠IgG抗體的動態。圖7重組腺病毒rAdV_AsialP12A3C接種BALB/c小鼠中和抗體的動態變化；a重組腺病毒一次免疫組小鼠中和抗體的動態；b重組腺病毒二次免疫組小鼠中和抗體的動態。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。質粒、載體和生化試劑腺病毒骨架載體pAdEasy-1、腺病毒穿梭載體pShut11e-CMV、大腸桿菌BJ5183感受態菌以及AD-293細胞均購自Stratagene公司。大腸桿菌JM109、DH5α感受態細胞和pBluescript質粒由本試驗室保存。PmeI和PacI均為NEBBioLabs產品。轉染試劑EffecteneTransfectionReagent購自QIAGEN公司。口蹄疫病毒VP2單克隆抗體4B2由微生物保藏號是CGMCCNo.3103的雜交瘤細胞系所分泌；(中國發明專利申請號200910161346.9)。無外源基因表達的野生型腺病毒(wtAd)由本實驗室構建並保存，wtAd的構建方法與本發明中重組腺病毒的構建方法相同。實施例1重組腺病毒的構建、純化和鑑定1、Asial型FMDV基因組Pl、2A基因和3C基因的拼接根據本發明人實驗室成功拯救的Asial型FMDV的感染性克隆(王海偉，塗亞斌，周國輝等.Asial型口蹄疫病毒感染性克隆的建立[J].中國預防獸醫學報，2008,30(12)915-919)(於力等，Asial型口蹄疫病毒感染性cDNA及其構建方法和應用，中國發明專利申請號200810171258.2)的Asial/YS/CHA/05株基因組，分別設計上下遊引物(表1)採用RT-PCR方法分別擴增P1-2A基因和3C基因，將pBluescriptIISK(+)和P1-2A的PCR擴增產物分別進行KpnI和XhoI酶切，連接後轉化並且篩選陽性克隆，酶切鑑定正確的重組質粒命名為pBlue-AsialP12A。將pBlue_AsialP12A與3C基因的PCR產物分別進行XhoI和SphI酶切，連接後轉化並且篩選陽性克隆，進行酶切和測序鑑定，測序正確的重組質粒命名為pBlue-AsialP12A3C。表1用於Asial型FMDVPl、2A基因和3C基因拼接的引物tableseeoriginaldocumentpage52、重組腺病毒穿梭載體的構建根據質粒pBlue-ASialP12A3C的基因序列設計引物Pl和P2(表1)，用於擴增pBlue-AsialP12A3C質粒上的P12A3C基因。Pl含有kpnl酶切位點、kozke序列和起始密碼子ATG，P2含有Notl酶切位點和終止密碼子TAG。以質粒pBlue_AsialP12A3C為模板，P1、P2為引物進行PCR擴增。將PCR產物膠回收，然後將回收的PCR產物和腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV進行KpnI和Notl雙酶切，膠回收純化酶切後的產物，與穿梭載體連接，並轉化至JM109感受態菌，經卡那黴素抗性篩選，挑取菌落接種至5mL含有卡那黴素的LB液體培養基中，培養過夜，提取質粒，進行PCR、酶切和測序鑑定。測序正確的質粒命名pShuttle-AsialP12A3C。3、重組腺病毒質粒的獲得將pShuttle-ASialP12A3C用限制性內切酶PmeI線性化，電轉化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-I的BJ5183感受態菌(AdEasy-l-BJ5183)中。經卡那黴素抗性篩選，提取質粒，用PacI酶切鑑定，將陽性重組腺病毒質粒進行測序，正確的命名為pAdV-AsialP12A3C。4、轉染將質粒pAdV_AsialP12A3C轉化DH5a感受態菌，大量增殖重組質粒。用中量質粒提取試劑盒提取重組腺病毒質粒，用PacI酶切，乙醇沉澱滅菌，超淨工作檯無菌吹乾，用無菌超純水溶解沉澱，使質粒的終濃度為0.1-0.2g/L。用QIAGEN公司轉染試劑EffecteneTransfectionReagent進行轉染，具體操作按說明書進行。5、重組腺病毒的純化與鑑定將獲得的初代重組腺病毒(命名為rAdV-AsialP12A3C)反覆凍融後，離心取上清，接種293細胞，連續傳8代，觀察細胞病變情況；取2、4、6和8代病毒，用蛋白酶K處理後，用PCR檢測目的基因。同時取4、6和8代重組腺病毒感染的293細胞，用口蹄疫病毒VP2單抗4B2進行間接免疫螢光試驗及Westernblot分析，以檢測目的基因的表達情況。轉染後7天細胞開始出現病變，細胞變圓、變大、脫落。第9天收穫病毒進行傳代，傳至第5代時，細胞於接種病毒後24-48h完全出現CPE(圖IB)。取第2、4、6和8代重組腺病毒，用DNA提取試劑盒提取重組病毒DNA，PCR均能檢出3.5kb的目的基因(圖2)。6、間接免疫螢光試驗將293細胞鋪於96孔板中，當長到90%單層時，接種15M0I(Multiplicitiesofinfection)rAdV-AsialP12A3C，24h後棄去培養基，用PBS洗滌細胞3次，將rAdV-AsialP12A3C感染的293細胞用預冷的無水乙醇固定15min，加入抗FMDVVP2的單克隆抗體4B2，37°C作用lh，用PBST洗滌後，加入螢光標記羊抗鼠IgG(Sigma)於37°C作用40min,PBST洗滌後自然乾燥，加入緩衝甘油，於螢光顯微鏡下觀察。用針對FMDVVP2蛋白的單克隆抗體4B2進行IFA檢測，結果發現重組腺病毒感染的細胞均出現明顯的螢光，而對照組則檢測不到螢光(圖3)，表明rAdV-AsialP12A3C能正確地表達FMDV-VP2蛋白。7、Westernblot試驗將感染rAdV-AsialP12A3C的293細胞進行SDS-PAGE分析，同時設立口蹄疫全病毒蛋白作為陽性對照，野生型腺病毒感染的293細胞作為陰性對照，之後轉印到硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶封閉後，加入抗VP2的單克隆抗體4B2(11000稀釋)，37°C作用lh，用PBST洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記兔抗鼠IgG(Sigma，110000稀釋)，37°C作用Ih,洗滌後加入DAB溶液顯色。對4、6、8代的重組腺病毒進行Westernblot分析(圖4)，結果表明，rAdV-AsialP12A3C在感染的293細胞中複製、產生病毒樣顆粒、並且穩定地表達。與單克隆抗體4B2發生免疫反應的條帶與FMDV衣殼蛋白VPO、VP3的分子量大小相當，表明rAdV-AsialP12A3C感染293細胞後形成FMDV多聚蛋白，並組裝成FMDV病毒樣顆粒。這與Mayr等的結果相似，他們構建了一株表達A型FMDVP1-2A-3C基因重組腺病毒，同時也將3C基因單點突變失活作為對照，發現失活的3C蛋白不能有效裂解FMDV多聚蛋白，從而使表達A型FMDVP1-2A-3C基因的重組腺病毒在293細胞中不能正確地組裝完整的FMDV病毒樣顆粒，在Westernblot檢測中也就沒有VP0、VP3和VPl條帶的形成。8、重組腺病毒增殖滴度的測定分別用10M0I劑量的第8代重組腺病毒(rAdV-AsialP12A3C)和野生型腺病毒(wtAdV)接種293細胞，在接種後12、24、36、48、60和72h收取病毒並進行毒價測定(KleinaLG.,GrubmanMJ.1992.AntiviralEffectsofaThiolProteaseInhibitoronFoot-and-MouthDiseaseVirus.J.Virol.66:7168_7175.)，建立重組腺病毒與野生型腺病毒的一步生長曲線。分別用10M0I劑量的第4、6、8和10代重組腺病毒接種293細胞，在接種後60h收取病毒並進行毒價測定，檢測不同代次重組病毒的病毒滴度。隨著病毒傳代代次的升高，重組病毒的毒價也呈上升的趨勢，第4、6、8、和10代的毒價分別為104、105、108和IO8PFU,說明重組病毒的複製水平和滴度在第6代以後趨於穩定，第8代達到峰值。經病毒滴度測定，繪製出第8代重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C與其親本病毒的一步生長曲線，即病毒增殖滴度與生長時間的相關性曲線，反映病毒生長繁殖的規律，結果見圖5。結果表明，隨著重組腺病毒感染293細胞時間的延長，病毒滴度逐漸升高，在60h時，病毒的滴度達到峰值，隨後開始下降。試驗例1重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C的保護效力試驗1、BALB/c鼠的免疫接種9周齡BALB/c鼠50隻，購自於中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心，用免疫螢光方法檢測人腺病毒5型抗體為陰性。實驗動物隨機分成9組，第1A、1B、1C和ID組為本發明實施例1所構建的重組腺病毒(rAdV-AsialP12A3C)—次免疫組，每組5隻，重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C免疫劑量分別為每隻鼠1X108、5X107、5XIO6和5XIO5PFU；第2A、2B、2C和2D組為重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C兩次免疫組，每組6隻，免疫劑量分別為每隻鼠1X108、5X107、5XIO6和5XIO5PFU,在第一次免疫後第6周以相同劑量加強免疫；第9組接種wtAdV。重組腺病毒rAdV_AsialP12A3C用PBS稀釋，後腿肌肉注射。2.間接ELISA檢測用包被液將FMDV146S抗原稀釋至20μg/mL,每孔100μL，加入酶標板，4°C過夜包被。用PBS洗3次，5%脫脂乳封閉，37°C孵育lh。PBS洗3次，加入待檢小鼠血清，同時設立鼠陽性和陰性血清為對照。37°C孵育lh。洗滌後加入15000稀釋的HRP標記羊抗鼠二抗，OPD顯色後於492nm處讀取OD值。3.微量細胞中和試驗(1)病毒毒價的測定將重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C接種於單層細胞，37°C吸附Ih後加入維持液，置溫箱培養；逐日觀察，待細胞病變(CPE)達75%以上，收穫病毒懸液凍融3次，以3OOOr/min離心lOmin，取上清液，定量分裝成Iml小瓶置-70°C保存備用，選用的病毒對細胞有較穩定的致病力。取從_70°C冰箱保存的病毒一安瓶，將病毒在96孔培養板上作10倍遞進稀釋即ICT1，ΙΟ"2,10_3……，每孔病毒懸液量為50μ1，每個稀釋度作8孔，每孔加入100細胞懸液，每塊板的最後一行設8孔細胞對照，製備細胞懸液的濃度以使細胞在24h內長滿單層為度。把培養板置5%C02溫箱37°C培養，從48-72h逐日觀察細胞病變，記錄結果。按Reed和Muench兩氏法計算TTCID5tlt5(殷震，劉景華，動物病毒學[M].第2版，北京科學出版社，1997，336340.)舉例說明TCID50計算(接種劑量50μ1)tableseeoriginaldocumentpage8距離比例=56%-50%、56%-33%IgTCID50=高於50%病毒稀釋度的對數-距離比例X稀釋係數的對數高於50%病毒稀釋度的對數為-6，距離比例為0.26，稀釋係數的對數為_1。IgTCID50=-6+0.26X(_1)=-6.3則TCID5tl=10_63，50即病毒作10_6_3稀釋，每孔接種50μ1，可使半數組織細胞管發生病變。(2)中和試驗動物血清中含有多種蛋白質成分對抗體中和病毒有輔助作用，如補體、免疫球蛋白和抗補體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應因素，用於中和試驗的血清或腹水須經加熱56°C、30min滅活處理。取已滅活處理的血清，在96孔微量細胞培養板上，用不含血清的DMEM作一系列倍比稀釋，使其稀釋度分別為原血清的14、18、116、132、164等等，每孔含量為50μ1，每個稀釋度作4孔。取_70°C冰箱保存的病毒液，按經測定的毒價作200TCID5(I0稀釋(與等量血清混合，其毒價為IOOTCID5ci)。如病毒價為10_63，50μ1。所以應將病毒作2Χ10_43稀釋。每孔加入50μ1病毒液，封好蓋，置於37°C溫箱中和lh。在製備細胞懸液時，其濃度以在24h內長滿單層為度血清病毒中和Ih後取出，每孔加入100μ1細胞懸液。置5%C0237°C溫箱培養，自培養48h開始逐日觀察記錄，120h終判。為保證試驗結果的準確性，每次試驗都必須設置下列對照。陽性和陰性(sp2/0)腹水與待檢腹水進行平行試驗，陽性腹水對照應不出現細胞病變，而陰性腹水對照應出現細胞病變。每次試驗每一塊板上都設立病毒對照，先將病毒作0.1、1、10、100、ioootcid5ci稀釋，每個稀釋度作4孔，每孔加50μ1。然後每孔ιοομι細胞懸液。o.itcidtcid5tl應不引起細胞病變，而且IOOTCID5q必須引起細胞病變，否則該試驗不能成立。為檢查被檢腹水本身對細胞有無任何毒性作用，設立被檢腹水毒性對照是必要的。即在組織細胞中加入低倍稀釋的待檢腹水(相當於中和試驗中被檢腹水的最低稀釋度)。即不接種病毒和待檢腹水的細胞懸液孔。正常細胞對照應在整個中和試驗中一直保持良好的形態和生活特徵，為避免培養板本身引起試驗誤差，應在每塊板上都設立這一對照。當病毒回歸試驗，陽性、陰性、正常細胞對照相，賦稅毒性對照全部成立時，才能進行判定，被檢腹水孔出現100%cpe判為陰性，50%以上細胞出現保護者為陽性；固定病毒稀釋腹水中和試驗的結果計算，是計算出能保護50%細胞孔不產生細胞病變的腹水稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價。用Reed和Muench兩氏法(或Karber法)計算結果。舉例說明固定病毒_稀釋血清法中和抗體效價計算tableseeoriginaldocumentpage9用Reed和Muench兩氏法(或Karber法)計算結果formulaseeoriginaldocumentpage9lgPD50=高於50%血清稀釋度的對數-距離比例X稀釋係數的對數lgPD50=-1.5-0.5X(-0.3)=-1.35則PD50=1(Γ136，50μ1因10_135=1/22，即122的血清可保護50%細胞不產生病變，122就是該份血清的中和抗體效價。試驗結果重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C—次免疫接種的4組BALB/c鼠(1A/1XIO8PFU,IB/5X107PFU、lC/5XIO6PFUJPID/5XIO5PFU)和間隔6周同樣劑量第二次免疫接種的4組BALB/c鼠(2A、2B、2C、和2D)，在接種後24周期間內採集血清，分別用ELISA和微量中和試驗檢測血清抗體的動態水平，野生型腺病毒WtAdV免疫組作為對照，結果見圖6和圖7。從圖6a可見，一次免疫組的小鼠，IA/1XIO8PFU組和IB/5XIO7PFU組在接種後3周已出現口蹄疫特異性IgG抗體，隨後抗體水平逐漸升高，第8周IB/5XIO7PFU組的IgG抗體達到高峰，而1A/1XIO8PFU組在第9周IgG抗體達到峰值，之後抗體水平逐漸下降，到第24周這兩組接種鼠的抗體水平接近陰性；1C/5XIO6PFU組小鼠只產生很低水平的抗體，而1D/5XIO5PFU組的小鼠與WtAdV對照組同樣一直沒有產生口蹄疫特異性抗體。兩次免疫接種小鼠的免疫應答見圖6b，與一次免疫組小鼠的共同點是，IgG抗體也在8-9周達到峰值、1D/5XIO5PFU組在二次接種後同樣沒有產生抗體，可是兩次免疫組具有如下明顯特徵1)兩次免疫的抗體水平要明顯高於同劑量的一次免疫組，這種抗體水平的差別在免疫組IC(很低的免疫應答)和2C(免疫應答高於IA組)之間尤其明顯；2A組比IA組的抗體水平也有明顯提升；尤為重要的是，2B組不但比IB組的抗體水平明顯提升，而且該劑量(5XIO7)的二次接種可使免疫應答最大化至2A免疫組(1X108)的水平，這更加顯示出加強免疫的重要性；2)同時，抗體應答水平隨著免疫劑量的升高而上升，一次免疫鼠和二次免疫鼠的最低劑量組(1D、2D)始終沒有產生特異性IgG抗體；而在高劑量免疫組(1A、1B、2A、2B)，不但抗體水平高持續時間也長，直至實驗結束仍能夠檢測到口蹄疫特異性抗體的存在。用ELISA檢測IgG抗體可以反映rAdV-AsialP12A3C在免疫接種鼠體內誘導免疫應答的整體水平，而更直觀的保護性免疫指標是中和抗體水平。因此，在檢測血清IgG抗體的同時，本發明也測定了上述各實驗組的中和抗體水平及其動態變化，結果見圖7。一次免疫組的小鼠(圖7a)，IA/1XIO8PFU組和IB/5XIO7PFU組在接種後3_5周出現口蹄疫特異性中和抗體，隨後抗體水平逐漸升高，第5周1B/5X107PFU組的中和抗體達到高峰(89)，而1A/1XIO8PFU組在第9周中和抗體才達到峰值(89)，之後抗體水平逐漸下降，到第9、11周這兩組接種鼠的中和抗體水平分別接近陰性；1C/5X106PFU組和1D/5XIO5PFU組的小鼠不能檢出中和抗體。兩次免疫接種小鼠產生的中和抗體，見圖7b。2A和2B組的中和抗體水平(最高達178和251)比一次免疫的IA組和IB組(最高達89和89)明顯升高，2C組也產生了較高水平的中和抗體(最高達126)，這些二次免疫鼠的中和抗體水平均在初次免疫後第9周、二次免疫後第3周達到峰值；1D/5XIO5PFU組在二次接種後同樣沒有產生中和抗體。概括起來，重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C—次免疫小鼠以及兩次免疫小鼠誘導中和抗體具有如下明顯特徵。其一，兩次免疫產生的中和抗體水平要明顯高於同劑量的一次免疫組，這種差別在免疫組IC(無中和抗體免疫應答)和2C(免疫應答明顯高於1A、1B組)之間尤其明顯，2A、2B組比1A、1B組中和抗體水平的提升更為明顯。其二，從總體趨勢看，中和抗體的應答水平隨著免疫劑量的增加而上升，低劑量的1C、1D和2D組均不產生中和抗體，2C組產生中和抗體的水平比較高劑量的2A、2B組低；然而，在1A、2A組與較低劑量的1B、2B組，情形卻有不同。在一次免疫鼠IB可誘導與IA同樣水平的中和抗體，而且IB誘導中和抗體的高峰期(第5周)明顯早於IA(第9周)；類似的情況也見於二次免疫鼠，較低劑量的2B組誘導的中和抗體不但早於2A組，而且誘導中和抗體的水平也明顯高於2A組。這表明，經PBS稀釋的病毒液IB/5XIO7PFU組比未稀釋的病毒液1A/1XIO8PFU組更快速更有效地激發中和抗體的產生，其機理尚不清楚。其三，在小鼠模型的研究結果表明，在5XIO7PFU劑量下兩次免疫接種誘導中和抗體產生的滴度高(最高達251)、持續時間長(在一免後21周中和抗體滴度仍為63)，依據保護性中和抗體滴度(中和抗體滴度為55)確定的保護性免疫持續期為5個月，根據美國Moraes等的研究(MoraesMP，MayrGA,MasonPW,etal.EarlyprotectionagainsthomologouschallengeafterasingledoseofrepIication-defectivehumanadenovirustype^expressingcapsidproteinsoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)strainA24.Vaccine2002；201631-9.其它免疫保護因素(細胞介導免疫、黏膜免疫和天然免疫)推斷的完全保護性免疫的持續期為6個月，由此推斷的臨床保護性免疫的持續期為8個月。權利要求一種由口蹄疫病毒衣殼蛋白前體P1-2A基因和3C基因拼接在一起而得到的一種融合基因，其鹼基序列為SEQIDNO1所示。2.一種重組腺病毒，包括以下方法構建得到將權利要求ISEQIDNO1所示的鹼基序列與腺病毒穿梭載體相連接，得到重組腺病毒穿梭載體；將重組腺病毒穿梭載體重組進入人缺損腺病毒5型，篩選，鑑定，即得。3.按照權利要求1的重組腺病毒，其微生物保藏號是CGMCCNo.3467。4.權利要求1所述的融合基因在製備預防或治療口蹄疫藥物中的用途。5.權利要求2或3所述的重組腺病毒在製備預防或治療口蹄疫疫苗中的用途。6.一種預防口蹄疫的疫苗組合物，其特徵在於含有有效量的權利要求2或3所述的重組腺病毒。全文摘要本發明公開了表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒及其應用。本發明將FMDV衣殼蛋白前體P1-2A基因和3C基因拼接在一起而得到一種融合基因，其鹼基序列為SEQIDNO1所示。將SEQIDNO1所示的鹼基序列與腺病毒穿梭載體相連接，得到重組腺病毒穿梭載體；將重組腺病毒穿梭載體重組進入人缺損腺病毒5型，篩選，鑑定，得到一種高效表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒，其微生物保藏號是CGMCCNo.3467。本發明所構建的用缺損腺病毒表達的亞洲1型口蹄疫病毒VLP，在小鼠體內可持續誘導高水平的中和抗體，可作為預防Asia1型口蹄疫的疫苗。文檔編號C12N7/01GK101818163SQ20101011453公開日2010年9月1日申請日期2010年2月26日優先權日2010年2月26日發明者於力,周國輝,王海偉,王芳申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所