一種質粒提取試劑盒以及提取方法與流程
2023-05-06 06:41:36 1
本發明涉及分子生物學領域，更特別地，涉及一種質粒提取試劑盒以及質粒提取方法。
背景技術：
質粒提取是分子生物學和藥用質粒研究領域中常見的操作。近年來，基因治療和dna疫苗在癌症、單基因遺傳病、愛滋病、心血管疾病、關節炎等重大疾病的診斷和治療方面顯示了突出的優勢，其應用研究正日益發展。目前質粒逐漸成為基因治療的最重要的基因傳遞系統，應用於基因治療的藥用質粒的提取技術的發展目前已成為該領域研究的重點之一。這進一步促進了高純度質粒提取技術的發展。
在許多研究中，尤其是藥學相關試驗中，所用的質粒中不能含有內毒素，因此，常常需要先對質粒進行內毒素去除操作，。然而，目前尚未有質粒提取試劑盒涉及這方面的試劑，研究人員不得不自己配製相關試劑，造成了巨大的不方便，並且內毒素去除效果也不理想。因此，需要一種新的質粒提取試劑盒，以及提取方法。
技術實現要素：
為解決以上問題，本發明提供了一種質粒提取試劑盒，其包括用於裂解細胞的裂解試劑組、用於去除雜質的洗滌試劑組、質粒溶解試劑和內毒素去除試劑。
優選地，所述裂解試劑組由裂解液i、ii和iii組成，
所述裂解液i為包含10mmedta、0.1067mg/mlrnasea和25mmtris-hcl的水溶液，所述裂解液i的ph為8.0；
所述裂解液ii為包含0.2mnaoh和質量分數1％的sds的水溶液；
所述裂解液iii為包含2-6m鹽酸胍和0.5m醋酸鉀的水溶液，所述裂解液iii的ph為4.2。
優選地，所述洗滌試劑組由洗液a和洗液b組成，
所述洗液a為包含6-8m鹽酸胍、20mmtris-hcl和體積分數30-50％乙醇的水溶液，所述洗液a的ph為6.0；
所述洗液b為體積分數75-90％的乙醇水溶液。
優選地，所述內毒素去除試劑為包含5-20％tritonx-114的水溶液。
在另一個實施方案中，還包括內毒素檢測試劑。
本發明還提供了一種質粒提取方法，使用上述質粒提取試劑盒進行質粒提取，包括以下步驟：
s1：使用所述細胞裂解試劑組裂解包含質粒的宿主細胞，得到細胞破碎液；
s2：將所述細胞破碎液上載於質粒吸附柱上，使用所述洗滌試劑組洗滌上載了細胞破碎液的質粒吸附柱，使用所述質粒溶解試劑從洗滌後的質粒吸附柱溶出質粒，得到質粒粗提液；
s3：使用所述內毒素去除試劑去除所述質粒粗提液中的內毒素，得到去除了內毒素的質粒溶液。
優選地，所述裂解試劑組由裂解液i、ii和iii組成，並且s1包括以下步驟：
s11：將包含宿主細胞的培養物離心去上清，並用所述250體積份的裂解液i重懸所述宿主細胞；
s12：加入250體積份的裂解液ii，上下翻轉混勻，室溫靜置，使宿主細胞充分裂解；
s13：加入350體積份的裂解液iii，上下翻轉混勻，至形成白色聚集物，冰浴2min；
s14：離心得到澄清液體即所述細胞破碎液。
優選地，所述洗滌試劑組由洗液a和洗液b組成，並且s2包括以下步驟：
s21：將所述細胞破碎液上載於所述質粒吸附柱上，離心並去除濾過所述質粒吸附柱的液體；
s22：用洗液a洗滌所述質粒吸附柱：向所述質粒吸附柱中加入500體積份的洗液a，離心並去除濾過所述質粒吸附柱的液體；
s23：用洗液b洗滌所述質粒吸附柱兩次：每次向所述質粒吸附柱中加入700體積份的洗液b，離心並去除濾過所述質粒吸附柱的液體；
s24：使用所述質粒溶解試劑從洗滌後的質粒吸附柱溶出質粒，靜置1min，離心得到的濾液即為所述質粒粗提液。質粒溶解試劑可為水或te緩衝液。
優選地，所述內毒素去除試劑為包含5-20％tritonx-114的水溶液，並且s3包括以下步驟：
s31：向所述質粒粗提液中加入所述述內毒素去除試劑，至tritonx-114濃度為1％，並快速混勻,得到混合液；
s32：將s31得到的混合液冰浴10min，然後於42℃孵育10min；
s33：將經s32處理的混合液於20℃、10000rpm下離心5min，所得上清液即所述去除了內毒素的質粒溶液。
在另一個實施方案中，所述質粒提取試劑盒還包括內毒素檢測試劑，在得到所述去除了內毒素的質粒溶液後，還進行步驟s4：使用所述內毒素檢測試劑檢測所述質粒溶液的內毒素含量，以驗證內毒素去除效果。
本發明的質粒提取試劑盒成分簡單，所有試劑均無毒，可以方便的得到。質粒提取的效率高。內毒素的去除效率可以達到98％，可以滿足真核轉染的要求，對藥學相關試驗比較有優勢。
具體實施方式
以下結合實例對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。
1.得到細胞破碎液
將菌株接種到含有4ml培養基的試管中，37℃過夜培養，180rpm。前一天4pm開始。
將培養好菌液封裝在2個2ml離心管中，12000rpm，2min。棄上清。
加入250μl的裂解液ⅰ(含rnasea1)，用移液器吹打幾次，充分混勻。
加入250μl的裂解液ⅱ，輕輕上下翻轉5-6次，室溫靜置2min，使菌液充分裂解，形成透明溶液(時間不可過長，5min以內)。
加入350μl的裂解液ⅲ，上下翻轉5-6次，直至形成緻密的白色聚集物，冰浴2min。
12000rpm，離心10min，上清液即為細胞破碎液。
2.得到質粒粗體液
將細胞破碎液吸入安放在收集管上的矽膠膜吸附柱中，不能吸到沉澱。
12000rpm，1min。棄掉收集管中的濾液。
向吸附柱中加入500μl的洗液a，12000rpm，30s，棄濾液。
向吸附柱中加入700μl的洗液b，12000rpm，30s，棄濾液，本操作進行兩次。
空離12000rpm，1min。棄掉所有液體。
將吸附柱轉移至超淨工作檯中滅菌後的ep管中，加入te溶液60μl，室溫靜置1min(加液時注意滴加在吸附柱底部中心)。
12000rpm，1min。去掉吸附柱，目的dna溶解在ep管濾液中，即得到質粒粗提液，做好標記，-20°保存。
3.去除內毒素
向質粒粗提液中加入緩衝液配置的內毒素去除液至終濃度為1％。
快速混勻，冰浴10min。42°孵育10min。於20°，10000rpm離心5min，於超淨工作檯中將上清液體吸入ep管中。
4.檢測內毒素去除效果
利用鱟試劑檢測熱源，符合要求的質粒於-20°或-70°保存。
注意事項：試劑一定要提前預熱和預冷。
菌液的培養時間要控制在12-16h左右。
加入solutionⅱ後，裂解時間一定要控制，最好1min。
te緩衝液的ph值要控制在8.0.(酸性條件質粒易分解)。
以下為本實施例中各試劑的配方及配製方法：
裂解液i：25mmtris-hcl、10mmedta，將ph調至8.0高溫高壓滅菌，添加rnasea0.1067mg/ml；
裂解液ii：0.2mnaoh，1％sds，先分別配製10x的naoh溶液和10x的sds溶液，使用前稀釋到1x的混合溶液；
裂解液iii：2-6m鹽酸胍，0.5m醋酸鉀，ph調至4.2；
洗液a：6-8m鹽酸胍，20mmtris-hcl，30-50％乙醇，ph6.0；
洗液b：75-90％乙醇；
te：10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0，高溫高壓滅菌；
內毒素去除試劑：磷酸鹽緩衝系統配置的10％tritonx-114。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。