新型的紅參發酵用微生物，及其利用該微生物的紅參發酵液和紅參發酵飲料的製作方法

2023-06-12 19:17:21

專利名稱：新型的紅參發酵用微生物，及其利用該微生物的紅參發酵液和紅參發酵飲料的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型的紅參發酵用微生物，及其利用該微生物的紅參發酵液製造方法和紅參發酵飲料。
背景技術：
紅參皂甙的抗疲勞、增強免疫力、改善血行等效果已經得到證實，而且持續的研究結果表明，還具有防老抗老、保護肝功能、改善血液循環、改善痴呆和肝功能等功效。尤其是，紅參的皂甙中難以吸收的主要皂甙(saponin) (Rgl, Re, Rbl, Re, Rb2以及Rd)經過加水分解生成的次要阜式(saponin) (Rg3, Rh2, Compound-K等)被報告,在實驗鼠中具有阻礙腫瘤細胞的轉移、在試管內阻礙腫瘤細胞的入侵、誘發癌細胞的自殺、抑制癌細胞的轉移、降低血壓、抑制兒茶酚胺激素(catecholamine)的分泌、激活鎮痛劑以及增強免疫力等卓越的藥理活性。這樣隨著次要皂甙(saponin)的卓越的藥理活性得到驗證，生成次要皂甙(saponin)的研究開展的非常活躍。主要嘗試的方法有酸加水分解、熱處理、酶加水分解以及有機合成等方法。其中，酶加水分解方法可以在低溫中實施，操作簡便，且由於酶的基質特性副產品非常少，所以說是生產次要皂甙(saponin)最合適的方法。目前為止，通過酶轉換皂甙的研究主要集中在腸內細菌、土壤微生物以及植物組織中分離的微生物。但是，這些方法不適用於食用，所以在實用化方面還是有不少難度。另外，乳酸菌(lactic acid bacteria)是指大量生成乳酸(lactic acid)的細菌,利用食品內的糖(glucose)生成乳酸，不僅改善食品的口味，還進行食品的酸化，阻礙其他有害的微生物成長。並 且，乳酸菌棲息在各種動物的腸管內，保護消化管內的黏膜、改善腸內異常發酵、促進消化和吸收、促進維生素的合成以及鈣的吸收等，所以在從紅參的主要皂式(saponin)中生成次要阜式(saponin)時可以使用。
這些乳酸菌的培養通常都會使用比較典型的乳酸菌商用培基-MRS培基，但是這些商用培基在其成分或化學加工處理方法上，無法得知都使用了哪些材料、經過了哪些化學處理，所以不適合於食用。作為一個例子，韓國註冊專利第0680318號記載了包括胰蛋白腖、大豆腖、蛋白腖等的微生物培養用營養培基的內容。但是，上述的製造胰蛋白腖、大豆腖、蛋白腖等的過程非常複雜，而且在製造過程中還包括了處理氫氧化鈉等強鹼基的人體有害的化學處理過程，在這樣的培基中培養的微生物無法直接用於食用。因此,為了從紅參的主要阜式(saponin)生成次要阜式(saponin),需要開發新型的乳酸菌菌株以及利用該菌株的紅參發酵液的製造方法以及可直接用於食用的，採用對人體無害的材料的乳酸菌培養用培基。

發明內容
本發明的目的在於提供一種提升紅參萃取液中所含的功能性次要皂甙(saponin)的轉換效率的新型的紅參發酵用微生物。本發明的目的在於提供一種利用上述微生物的紅參發酵液製造方法。並且，本發明的目的在於提供一種使紅參萃取液的功能性次要皂甙(saponin)的含量最大化，具有免疫活性和抗癌活性，可安全攝入的紅參發酵飲料。技術方案
為了實現上述的目的，本發明提供具有序列編號8序列的紅參發酵用微生物。根據本發明的一個實施方式，上述微生物呈現出，將紅參所含的Rgl，Re, Rbl,Re, Rb2以及Rd中一個以上的主要阜式(saponin)轉換成F2, Rg3, Rh2以及Compound-K中的一個以上次要皂甙(saponin)的特性。根據本發明的一個實施方式，上述微生物呈現出與副乾酪乳桿菌副乾酪亞種{Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)喊基序列 99% 以上的相同性。根據本發明的一個實施方式，上述微生物具有KCTC12108BP的寄託編號。本發明提供，將上述微生物添加到紅參萃取液進行發酵的紅參發酵液製造方法。根據本發明的一個實施方式，還包括，上述發酵階段後還添加酶進行處理的階段。根據本發明的一個實施方式，上述發酵時可以添加蔗糖(sucrose)或鹽(NaCl)。根據本發明的一個實施方式，上述發酵時使用的微生物培養液是從白菜、蘿蔔、圓生菜、圓白菜、胡蘿蔔、香蕉、土豆和生菜組成的群組中選擇的一個以上的蔬菜製造的。本發明提供，含有上述製造的紅參發酵液的免疫增強用紅參發酵飲料。並且，本發明提供，含有上述製造的紅參發酵液的緩解癌症以及預防癌症的紅參發酵飲料。有益效果
本發明的新型的紅參發酵用微生物具有，以非常高的效率將紅參所含的主要皂甙(saponin)轉換成次要阜式(saponin)的特性，由此提高體內的阜式吸收效率。並且，本發明的紅參發酵液製造方法優化本發明的新型的紅參發酵用微生物的發酵環境，將次要皂甙(saponin)的轉換效率提升2 3倍，而且使用可食用的微生物培養培基，保證食品安全性，節省成本。並且，本發明的紅參發酵飲料具有非常優異的免疫活性以及抗癌活性(緩解癌症以及抗癌的效果)。


圖1為按照本發明方法篩選的WJ-1，2，4，6，23，33發酵菌株的16S DNA鹼基序列，圖1a為WJ-1菌株、圖1b為WJ-2菌株、圖1c為WJ-4菌株、圖1d為WJ-6菌株、圖1e為WJ-23菌株、圖1f為WJ-33菌株的16S rDNA鹼基序列。圖2為按照本發明方法篩選的發酵菌株的次要皂甙(saponin)轉換能力的TLC層析觀察結果圖。圖2a為WJ-1，2，4以及6菌株的紅參萃取液中，將主要皂甙(saponin)轉換為次要皂甙(saponin)的效果圖(I號泳道:WJ-1，2號泳道:WJ-2，3號泳道:WJ-3，4號泳道:WJ-4，5號泳道:標準，6號泳道:WJ-5，7號泳道:WJ-6，8號泳道:WJ-8，9號泳道:WJ-9)。圖2b為WJ-23，WJ-33菌株的紅參萃取液中，將主要皂甙(saponin)轉換為次要皂甙(saponin)的效果圖(I號泳道:WJ-32，2號泳道:WJ-33，3號泳道:WJ-34，4號泳道:WJ-35，5號泳道:標準，6號泳道:WJ-36)。圖3為利用WJ-33菌株的發酵過程中，分別添加蔗糖或鹽時轉換為次要皂甙(saponin)的結果圖(I號泳道:WJ-32，2號泳道:WJ-33，3號泳道:WJ-34，4號泳道:WJ-35, 5號泳道:標準，6號泳道:WJ-36)。圖4為同時使用按照本發明方法篩選的發酵菌株和作為誘導因子的蔗糖(sucrose)或鹽(NaCl)時,轉換為次要阜式(saponin)的轉換效率觀察結果。圖4a為將WJ-2或WJ-4菌株和蔗糖(sucrose) —同添加到紅參萃取液處理時，生成次要皂甙(saponin)的觀察圖(I號泳道:WJ-1，2號泳道:WJ-2，3號泳道:WJ-3，4號泳道:WJ-4，5號泳道:標準，6號泳道:WJ-5，7號泳道:WJ-6，8號泳道:WJ-8，9號泳道:WJ-9)。4b為將WJ-2或WJ-4菌株和鹽(NaCl) —同添加到紅參萃取液處理時，生成次要皂甙(saponin)的觀察圖(I號泳道:WJ-1，2號泳道:WJ-2 3號泳道:WJ-3，4號泳道:WJ-4, 5號泳道:標準，6號泳道:WJ-5，7號泳道:WJ-6，8號泳道:WJ-8，9號泳道:WJ-9)。圖5為利用按照本發明方法篩選的發酵菌株進行發酵後，一同使用篩濾的酶時，轉換為次要皂甙(saponin)的效率觀察圖(不同泳道採用不同％進行接種和反應)。圖6為本發明紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)的NO生成量確認結果。圖7為 本發明紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)的細胞生存率確認結果圖。圖8為本發明紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)的TNF-α發現量確認結果圖。圖9為本發明紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)的羊棲菜萃取物吞噬作用確認結果。(野生型；DMEM培養基(10% FBS), P-CON;
1-CON; DMEM 培養基(10% FBS) + 抑制劑(2 μ M /
紅參；未發酵紅參萃取液+酵母聚糖(zymosan),
發酵紅參；本發明的紅參發酵液+酵母聚糖(zymosan))
圖10為口服本發明的紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)的實驗鼠的脾臟細胞增殖能力確認結果圖。圖11為口服本發明的紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)的實驗鼠腹腔巨噬細胞中的TNF-α發現確認結果圖。圖12為口服本發明的紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)的實驗鼠腹腔巨噬細胞中的IL-1 β發現確認結果圖。圖13為口服本發明的紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)的實驗鼠腹腔巨噬細胞中IL-6發現確認結果圖。圖14為口服本發明的紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)的實驗鼠血漿內的Compound K含量確認結果圖。
酵母聚糖(Zymosan),
24hr) + 酵母聚糖(zymosan):
圖15為本發明的紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)的抑制肺癌細胞增殖的活性確認結果圖。圖16為本發明的紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)抑制胃癌細胞增殖的活性確認結果。圖17為本發明的紅參發酵液(「發酵紅參」)以及未發酵紅參萃取液(「紅參」)抑制大腸癌細胞的活性確認結果圖。圖18為按種類分別添加植物性素材的培基中，培養副乾酪乳桿菌副乾酪亞種{Lactobacillusparacasei subsp./paracasei)後，OD 值的測定結果圖。

圖19為分別添加糖的培基中，培養副乾酪乳桿菌副乾酪亞種{Lac tobaci llusparacasei subsp.paracasei)後，0.D 值的測量結果圖。圖20為分別添加不同濃度的鹽分以及營養成分的培基中，培養副乾酪乳桿菌副乾酪亞種{LactobaciIlusparacasei subsp.paracasei)後，OD 值的測量結果圖。圖21為再添加植物性素材的培基中，培養副乾酪乳桿菌副乾酪亞種{Lac tobaci llusparacasei subsp.paracasei)後，OD 值的測量結果圖。圖22為混合添加植物性素材的培基中，培養副乾酪乳桿菌副乾酪亞種{Lac tobaci llusparacasei subsp.paracasei) 24 小時後，OD 值的測量結果圖。
具體實施例方式下面詳細介紹本發明的具體實施方式
。本發明涉及一種新型的微生物以及利用該微生物的紅參發酵液的製造方法以及紅參發酵飲料。本發明的新型的微生物具有，將紅參所含的主要皂甙(saponin)高效轉化為次要皂甙(saponin)的特性，可以是從紅參米酒中分離的。使用本發明的新型的微生物發酵紅參製作飲料時，富含次要皂甙(saponin)，具有優異的免疫增強以及抗癌功效。本發明的主要阜式(saponin)可以是Rgl、Re、Rbl> Re、Rb2以及Rd中的一個以上，但不限於此。本發明的次要阜式(saponin)可以是F2、Rg3、Rh2以及Compound-K中的一個以上，但不限於此。本發明的新型的微生物可以是新型的乳酸菌，具體而言，與布氏乳桿菌{Lactobacillus buchneri),類布氏乳桿菌{Lactobacillus parabuchneri),副乾酪
桿菌苜1J 幹釀亞 f中{Lactobacillus paracasei subsp.paracasei), Lactobacillusharbinensis 或酵母菌酶母{Saccharomyces cerevisiae CBS405)的喊基序列呈現99%以上的相同性。並且，與布氏乳桿菌{Lac tobaciIlus buchneri),類布氏乳桿菌{Lactobacillus parabuchneri),副乾酪乳桿菌副乾酪亞種{Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei), Lactobacillus harbinensis 或酵母菌酶母{Saccharomycescerevisiae CBS405)相比,呈現出顯著的次要阜式(saponin)轉換效率的新的菌株。換句話說，本發明的新型的微生物可以是呈現出將紅參所含的Rgl、Re、RbU Rc、Rb2以及Rd中的一個以上主要阜式(saponin)轉換為F2、Rg3、Rh2以及Compound-K中的一個以上次要皂甙(saponin)的特性的。尤其，本發明的新型的微生物是與副乾酪乳桿菌副乾酪亞種{Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)呈現出 99% 以上相同性的新菌株。
具體而言，上述的微生物可以是具有序列編號3至8中的某一個序列的，最好是具有序列編號8序列的。並且，本發明的微生物最好具有KCTC12108BP的寄託編號。並且，本發明涉及一種紅參發酵液的製造方法，具體而言，包括將上述新型的微生物添加到紅參萃取液進行發酵的階段。根據本發明的一個實施方式，上述的微生物是以紅參萃取液的總重量為準以0.001 3 %(v/w)的比例接種的。並且，本發明的紅參發酵液製造方法是以紅參發酵液的體積為準，以0.001 3% (v/v)的比例添加鹿糖(sucrose)或鹽(NaCl)的。並且，利用本發明的新型的微生物發酵紅參後，為了使皂甙(saponin)的轉換能力加倍，可以在上述的紅參發酵液中再添加食用酶。上述的酶只要是可食用的即可，沒有其他限制。—方面，上述發酵時使用的微生物培養液可以是從可食用的物質中製作的培養液。上述可食用的物質可以是包括植物性素材、糖源以及營養成分的。本發明的植物性素材可以是白菜、蘿蔔、圓生菜、圓白菜、胡蘿蔔、香蕉、土豆以及生菜中的一個以上，其中蘿蔔的效果最佳。並且，作為植物性素材還可以包括蘿蔔、胡蘿蔔以及香蕉中的一個以上。上述植物性素材的添加量而言，微生物培養用培基成分的總重量為準，添加3 25%的重量比較好。這是因為各種植物性素材混合在一起，作為能量源使用。上述的植物性素材可以是以濃縮液的形態(type)或粉末形態(type)添加。
本發明中的糖源可以是鹿糖(sugar)、聚葡萄糖(polydextrose)、果糖(fructose),低聚糖(maltooligo)、葡萄糖(glucose)、糊精(dextrin)、低聚果糖(fructooligo)以及乳糖(lactose)中的一個以上，尤其是乳糖以及葡萄糖中的一個以上比較好。上述糖源是以微生物培養用培基成分的總重量為準，添加I 2.5%的重量為好。這是因為有一定程度的糖源時，乳酸菌的發育更活躍。本發明中的營養成分 採用酶母提取物(yeast extract)為好。上述酶母提取物是具有胺基酸和維生素等成分的純天然添加物，可以購買商用食用酶母提取物使用。上述營養成分是以微生物培養用培基成分總重量為準，添加7 11%的重量為好。上述微生物培養用培基的成分還可以包括鹽分。上述鹽分最好是磷酸二鉀(Dipotassium phosphate;K2HPO4)。上述鹽分是以微生物培養用培基成分的總重量為準,添加0.01 0.03%的重量為好。本發明的微生物培養用培基成分是採用植物性材料的，所以能直接食用是其特徵。尤其，可以用於發酵食品的製造中使用的微生物的培養。本發明涉及一種含有上述製造的紅參發酵液的紅參發酵飲料。本發明的紅參發酵飲料呈現出非常強的增強免疫以及緩解和預防癌症的功效。上述紅參發酵飲料的製造方法相關的記載內容，均適用於本發明的紅參發酵飲料。下面結合實施方式和實驗例子詳細介紹本發明。但是，下面的實施方式和實驗例子只是例示性的，本發明不會局限於下面的實施方式和實驗例子，可以有更多的修改和變更。
實施方式1-新型的發酵菌株的獲得(I)米酒中分離和培養乳酸菌
為了分離出紅參發酵所需的乳酸菌，從忠南錦山、忠南麻田、大田廣域市收集了人參、紅參米酒以及生米酒等試料(在錦山市場購買)。從中分離100多菌株的乳酸菌後，利用紅參米酒的滅菌水連續稀釋至ΚΓ^ΚΓ5,在MRS agar plate中分別展開(spreading) 100後，在37°C培養基培養了 48小時。按照β -葡萄糖苷酶(β-glucosidase)分泌能力篩選發酵菌株
上述(I)中分離和培養的發酵菌株中，為了篩選出具有皂甙轉換能力的菌株，利用可驗證皂甙轉換能力的七葉苷瓊脂(Esculin agar)方法，如下篩選了 β _葡萄糖苷酶(β -glucosidase)分泌菌株。眾所周之，β_葡萄糖苷酶(β-glucosidase)分泌菌株是切割七葉苷的β_葡萄糖(β-glucose)生成的esculetin (七葉苷中脫落β-glucose的結構)與朽1檬酸鐵銨(ferric ammonium citrate)產生反應,在培基上的聚集地(colony)周圍形成黑色的複合體(complex)。即，形成這些黑色複合體的乳酸菌具有皂甙轉換能力，所以優先篩選了β -葡萄糖苷酶(β-glucosidase)分泌菌株。就是說，篩選了肉眼觀察時在乳酸菌周圍產生黑圈的菌株，這樣篩選的菌株命名如表I。表I
從紅參米酒中篩選的β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase)分泌菌株
權利要求
1.一種具有序列編號8序列的紅參發酵用微生物。
2.根據權利要求1所述的紅參發酵用微生物，其特徵在於，上述微生物可以將紅參所含的Rgl、Re、RbU Re、Rb2以及Rd中的一個以上主要皂甙轉換成F2、Rg3、Rh2以及Compound-K中的一個以上次要皂甙。
3.根據權利要求1所述的紅參發酵用微生物，其特徵在於， 上述微生物呈現出副乾酪乳桿菌副乾酪亞種{Lac tobaciIlus paracasei subsp.paracasei)鹼基序列99%以上的相同性。
4.根據權利要求1所述的紅參發酵用微生物，其特徵在於，上述微生物具有KCTC12108BP的寄託編號。
5.一種紅參發酵液的製造方法，其特徵在於，包括，將權利要求1至權利要求4中的某一項微生物添加到紅參萃取液進行發酵的階段。
6.根據權利要求5所述 的紅參發酵液製造方法，其特徵在於，還包括，上述發酵階段後，添加酶進行處理的階段。
7.根據權利要求5所述的紅參發酵液製造方法，其特徵在於，上述發酵時，添加蔗糖或鹽。
8.根據權利要求5所述的紅參發酵液的製造方法，其特徵在於，上述發酵時使用的微生物培養液是從白菜、蘿蔔、圓生菜、圓白菜、胡蘿蔔、橡膠、土豆和生菜組成的群組中選擇的一個以上製造。
9.一種增強免疫用的紅參發酵飲料，其特徵在於，包括按照權利要求5的製造方法製造的紅參發酵液。
10.一種緩解癌症以及預防癌症的紅參發酵飲料，其特徵在於，包括按照權利要求5的製造方法製造的紅參發酵液。
全文摘要
新型的紅參發酵用微生物，及其利用該微生物的紅參發酵液和紅參發酵飲料。本發明涉及一種具有序列編號8序列的紅參發酵用微生物。
文檔編號C12N1/20GK103173379SQ20121056811
公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月24日 優先權日2011年12月22日
發明者金正勳, 柳炚旴, 李珠美, 金濠彬, 鄭宰旭, 金相來 申請人:熊津食品有限公司