一種產慶大黴素C2a工程菌及其應用的製作方法
2023-05-06 06:39:36 2
一種產慶大黴素C2a工程菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於抗生素製藥領域，涉及一種主要產生慶大黴素C2a工程菌及其應用。通過分析絳紅小單孢菌慶大黴素生物合成過程，結合生物信息學預測，定向改造慶大黴素生物合成代謝流，提高慶大黴素C2a這一組分的積累，同時大大降低其它組分C1a、C1、C2的積累。採用基因框內敲除的方法，滅活慶大黴素生物合成過程中的差向異構酶基因genB2，包括穿梭質粒pZB303的構建，pZB303轉化至絳紅小單孢菌G1008，篩選阻斷工程菌，發酵生產，代謝產物檢測和組分分析。本發明主產慶大黴素C2a，填補了國內外至今無法產業化生產慶大黴素C2a的空白，利用該工程菌生產C2a，工藝簡單、成本低，在抗生素製藥領域具有極大的應用前景。
【專利說明】一種產慶大黴素C2a工程菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬抗生素製藥領域，涉及一種主產慶大黴素C2a【圖1】工程菌及其應用。利用基因工程和微生物分子遺傳學技術，闡明慶大黴素生物合成基因(GenBankaccession N0.:AJ628149，供《似；AY524043.\ ,gntL ；AJ575343.?>,gacj)的功能，並在絳紅小單孢菌G1008中敲除供》似，獲得一株主產慶大黴素C2a的工程菌，可用於工業化生產慶大黴素C2a。
【背景技術】
[0002]微生物是生產藥物的主要來源。利用絳紅小單孢菌和棘孢小單孢菌來生產慶大黴素都是多組分複合物，如慶大黴素Cl，C2，Cla, C2a和ABX族，導致臨床使用的慶大黴素至今仍然是多組分複合物Cl、C2、Cla和C2a。慶大黴素C族以2-脫氧鏈黴胺為核心，分別在
4、6位上通過糖苷鍵連接絳紅糖胺和加拉糖胺而成。因絳紅糖胺C-6'上甲基化程度的差異，形成了 Cl、Cla、C2a和C2等不同組分。在C-6'位置上有甲基的為Cl，而Cla、C2和C2a沒有甲基，因此Cla、C2和C2a比Cl多了一個游離氨基，而C2a與C2是一對立體差向異構體。多組分藥物，特別是差向異構體藥物，對臨床用藥非常不便，也非常不利。世界衛生組織，發達國家一直提倡臨床治療，採用單組份藥物，特別是非差向異構體藥物。科學家通過傳統技術，現代技術，進行菌株選育，期望得到慶大黴素單組分產生菌，但困難重重，至今未能如願以償。
[0003]隨著基因工程技術的快速發展，新黴素和丁醯苷菌素生物合成過程已經基本闡明。慶大黴素生物合成基因的研究也逐步取得突破，不同產生菌中的生物合成基因簇被陸續克隆出來。至2012年，本課題組公布了絳紅色小單孢菌G1008中的慶大黴素生物合成基因族(GenBank accession N0.:JQ975418),44181bp。隨著小單抱菌分子遺傳學操作體系的建立，慶大黴素系列單組份工程菌的構建逐步展開，並取得了實質性突破，為定向改造慶大黴素產生菌，獲得單組份工程菌奠定了基礎。
[0004]發明人首次完成了主產慶大黴素Cla工程菌的構建，填補了國內外研究空白，申請了發明專利(201110331534.9 ； 一株產慶大黴素Cla的工程菌及其應用)，本發明是該授權專利的進一步延伸與深化，屬系列性發明專利。
[0005]慶大黴素的生物合成從X2開始，只對絳紅糖胺進行修飾，通過對卡那黴素、妥布黴素和慶大黴素生物合成基因簇比較，推測#/^7取genB4為B型的氨基轉移酶基因，其中P?沈?可能與C-6'位差向異構化有關，即慶大黴素C2a轉變成C2。本發明通過破壞絳紅色小單孢菌G1008中基因genB2的功能，得到主產慶大黴素C2a工程菌。
[0006]
【發明內容】
本發明通過微生物分子遺傳學操作體系，藉助基因工程技術，敲除慶大黴素生物合成中的關鍵基因P?沈?，防止慶大黴素C2a被進一步轉化為慶大黴素C2，從而構建了一株主產慶大黴素C2a的工程菌，命名為絳紅色小單孢菌iMicromonospora purpurea) GB102。該工程菌遺傳性狀穩定，不易發生回復突變。已於2014年4月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏地址為北京朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為 CGMCC N0.9112。
[0007]本發明的目的是提供一種主產慶大黴素C2a的工程菌及其應用。
[0008]在產慶大黴素放線菌的基因組中滅活供》似基因，所述基因序列如SEQ ID N0.1所示。敲除基因的DNA序列為供》似的DNA序列。滅活供》似基因的方法包括基因敲除和基因置換。
[0009]一種產慶大黴素C2a工程菌的製備方法，其特徵是，主要包括以下步驟:
(1)滅話genB2同源重組質粒的構建；
(2)滅活#同源重組質粒轉化絳紅小單孢菌；
(3)滅活供《沈?單交換菌株的篩選；
(4)滅活供基因工程菌的篩選；
(5)滅活genB2基因工程菌代謝產物的鑑定。
[0010]基因敲除的方法為PCR擴增職/7似基因上下遊序列大約2000bp的兩個片段作為同源交換臂，按順序連接到穿梭質粒PKC1139中，得到同源重組質粒pZB303。
[0011]所述的轉化方法為大腸桿菌ET12567/PUZ8002介導的接合轉移方法。 [0012]所述滅活#基因工程菌的篩選為先獲得阿泊拉黴素抗性菌株，鬆弛培養後再從中篩選到阿泊拉黴素敏感菌株，再通過PCR驗證得到genB2基因阻斷工程菌。
[0013]所述的鑑定為採用薄層層析法、高效液相分析和MS分析其代謝產物。
[0014]一種產慶大黴素C2a工程菌在製備抗菌藥物和抗生素藥物中的應用。
[0015]本發明通過框內敲除絳紅色小單孢菌中供《似的DNA序列，滅活其功能，主要包括以下步驟:
a)genB2同源重組質粒pZB303的構建；
基於PCR技術，分別獲得#/7似基因上下遊序列，大約2000bp的兩個片段，作為同源交換臂，按順序連接到穿梭質粒PKC1139上，得到同源重組質粒PZB303【圖2】。
[0016](2)泛同源重組質粒轉化絳紅小單孢菌；
質粒 pZB303 先轉入疋 col1.ET12567/pUZ8002,得到 B.col1.ET12567/ pUZ8002/PZB303，然後通過疋col1.ET12567/pUZ8002/pZB303介導，轉入絳紅色小單孢菌。
[0017](3)genB2單交換菌株的篩選；
以阿泊拉黴素抗性基因為篩選標記，獲得阿泊拉黴素抗性菌株。
[0018](4)供基因敲除工程菌的篩選；
單交換菌株於無抗生素平板培養三代後，從中篩得阿泊拉黴素敏感菌株，經PCR初檢，提取染色體基因組，再通過PCR擴增其特定位點的genB2序列，並對所擴增的DNA測序，證明genB2基因的DNA序列被敲除，基因被滅活，獲得工程菌。
[0019](5)genB2基因阻斷工程菌代謝產物結構確定；
代謝產物分析:工程菌發酵液經酸鹼處理，樹脂吸附，洗脫液脫色，乙醇沉澱精製後，採用薄層色譜(TLC)法、高效液相色譜(HPLC)法和質譜(MS)法，對代謝產物結構進行確定。
[0020]本發明的工程菌，主要產生慶大黴素C2a，在抗菌藥物和抗生素製藥領域，應用前景廣闊。通過框內敲除基因的618bp鹼基序列，滅活其功能，得到一株主產慶大黴素C2a的工程菌。通過擴增供《似的上下遊序列大約為2000bp作為同源交換臂，發生同源重組的概率大大提高，便於得到目的菌株。
[0021]基因genB2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0022]本發明的優點在於:通過微生物分子遺傳學技術，在國際上，首次通過生物學實驗，而不是理論分析與預測，闡明了 genB2基因的功能與慶大黴素C2a轉化為慶大黴素C2有關。然後藉助現代基因工程定向育種法，敲除慶大黴素生物合成的關鍵基因#?似，得到主產慶大黴素C2a工程菌。該工程菌遺傳性狀穩定，不易回復突變，產抗能力強，工藝簡單，成本低，可應用於工業化生產，製備單組份慶大黴素C2a，填補國內外研究空白，具有巨大的潛在經濟效益和社會效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1慶大黴素C2a的化學結構。
[0024]圖2同源重組質粒pZB 303及其酶切驗證圖。其中ZBl為上遊交換臂，ZB2為下遊交換臂；M: Λ -EcoT 14 I digest DNA Marker ；l/2:pZB303 / Xho I 酶切。
[0025]圖3敲除職似基因的同源重組原理圖，其中1:游離質粒pZB303 ; I1:親株G1008染色體組；III:GB102染色體組；PB1/PB2上遊交換臂引物，PB3/PB4下遊交換臂引物，PB5/PB6雙交換驗證引物。
[0026]圖4 工程菌 GB102 基因組的 PCR 驗證圖。M:marker DL5000 ；1:G1008/(PB5/PB6)；2:GB21/(PB5/PB6) ；3:GB102/(PB5/PB6)。
[0027]圖5工程菌GB102代謝產物的TLC分析圖，1:慶大黴素標準品；2:GB102代謝產物。
[0028]圖6工程菌GB102的代謝產物HPLC分析結果，保留時間:5.126min為Cl ；
11.579min 為 Cla ；14.528min 為 C2a ；16.886 為 C2 ；6.501min 為過量衍生劑，14.502min 為
C2a。
[0029]圖7工程菌GB102的代謝產物質譜(MS)分析結果，親株G1008主要為慶大黴素Cl和C2 ;突變株GB102主要為慶大黴素C2a，只有微量慶大黴素Cl和Cla。
【具體實施方式】
[0030]實施例1:
1、同源重組質粒PZB303的構建
根據2012年本研究室公布的絳紅色小單孢菌G1008慶大黴素生物合成基因族(GenBank accession N0.: JQ975418,44181bp),設訪 genB2 基因框內缺失的方案(圖3)，合成引物(PB1/PB2)，用於擴增上遊交換ZBl ;引物(PB3/PB4)用於擴增下遊交換臂 ZB2。PBl (5 ' - TCTAGATGTAGAGCTCGTCCGCCGCCA-3 ; , XbaO, PB2 (5 ;-AAGCTTAAGGTCCCCGGCGATCTGCTC -3' ,HindIII)，PB3 (5' - AAGCTTAAGATGATCAGCACCCGCGATC-3/ ,Nin dill), PB4 (5' - GAATTCAATGTGGAGAACGGAGCAGACAG-3'boRI)。
[0031]以絳紅小單孢菌G1008的基因DNA為模板，選擇高保真酶Extaq為DNA聚合酶，設計PCR擴增反應體系和條件為:95°C預變性5min，94°C變性lmin，65°C退火lmin，72°C延伸lmin, 72°C保持lOmin，4°C保存。擴增genB2的上遊序列為同源交換臂ZBl，克隆至pMD19_T，得到中間質粒PZB301 (pMD19-T::ZB1);同樣，擴增genB2的下遊序列作為同源交換臂ZB2，克隆至 PMD-19T，得到中間質粒 pZB302 (pMD19_T::ZB2).質粒PZB301經油a I /歷idIII雙酶切，回收大小為1910bp的交換臂ZBl ;質粒pZB302經歷/?dIII/^boR I雙酶切，回收大小為1990bp的交換臂ZB2 ;與此同時，穿梭質粒pKC1139也經油a I /EcoR I雙酶切，回收6500bp的載體片段。三個片段:載體、交換臂ZBl和ZB2經混合，T4DNA連接酶酶連，轉化大腸桿菌toplO感受態細胞，在含有阿泊拉黴素的LB平板上篩選陽性克隆，提取得到大小為10647bp的最終質粒pZB303 (pKC1139:: ZB1-ZB2)。其酶切驗證見圖3，質粒pZB303存在三處通ο I酶切位點，可將質粒切成5711bp、3126bp、1521bp三個片段，電泳條帶與理論預測相符，測序結果證明正確。
[0032]2、同源重組質粒轉化絳紅小單孢菌
將重組質粒PZB303轉化大腸桿菌ET12567/pUZ8002感受態細胞，在含有阿泊拉黴素、氯黴素和卡那黴素的LB平板上培養過夜，挑取抗性菌落，提取質粒，驗證正確，得到大腸桿菌厶 coli ET12567/(pUZ8002/pZB303)供體菌。培養供體疋 co7iET12567(pUZ8002/pZB303)轉接到含相應抗生素的LB培養基中，37°C振蕩培養；當0D600為0.6時收集菌體(約3~4h)，並用新鮮的LB培養基洗滌2次，再用LB液體培養基重懸備用；將絳紅色小單孢菌孢子懸浮於5mL ρΗ8.0的0.05mol/L TES (2-[(三(羥甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸)緩衝液中，60°C水浴熱激2min，待其冷卻至室溫後加入等體積預萌發培養基，37°C振蕩(250r/min)培養3h ;離心收集孢子並重懸於適量的無菌水中，在混合器上振蕩打散孢子，按大約IO8:108與大腸桿菌細胞等量混合，塗布在絳紅色小單孢菌平板培養基上，於37°C培養24h後，用含阿泊拉黴素和萘啶酸溶液覆蓋，使兩種抗生素的終濃度分別為50 μ /mL和25 μ /mL,置37°C培養3-5天，直至長出接合子。 [0033]3、單交換菌株的篩選
根據同源重組原理(圖3 )，設計雙交換篩選引物(PB 5 /PB6 )，若在genB2特定位點發生單交換，對菌株基因組PCR，可以擴增到1816bp和1156bp的兩個片段，回復突變株或親株可以擴增出1816bp的片段，而#阻斷突變株只可以擴增出1156bp。設計阿泊拉黴素抗性基因引物(PA I /PA2 )。PB5 (5 ' - GCCCGATCGGAACGTGACG -3 ' )，PB6(5 ' - TGCGCAACCTCCGGACCAC -3 ' ), PAl (5 ' - CATTCTTCGCATCCCGCCTCTG -3 ' ), PA2(5' -TCAGCGGTGGAGTGCAATGTCG-3')。
[0034]將接合子轉接到含有25 μ g/ml萘啶酸和50 μ g/ml阿泊拉黴素的平板培養基上，培養3代，徹底清除可能含有的大腸桿菌和絳紅小單孢菌親株。挑取其中長勢較好的一株，命名為絳紅小單孢菌GB21，簡稱為GB21。提取基因組DNA。用擴增阿伯拉黴素抗性基因引物(PA1/PA2)擴增到700bp左右條帶；用雙交換篩選引物(PB5/PB6)進行PCR擴增，獲得1816bp和1156bp兩個條帶,與預測吻合。
[0035]4、供》似基因阻斷工程菌的篩選
將絳紅小單孢菌GB21轉接斜面，鬆弛培養3代後，開始分離單菌落，直至第八代。單菌落影印到含50 μ g/ml阿泊拉黴素的抗性平板上和無抗生素的普通平板上。根據同源重組原理，單交換菌發生第二次重組之後，會失去阿泊拉黴素抗性基因，對阿泊拉黴素敏感。因此，在阿伯拉黴素平板上不長，而對應在普通平板上正常生長的菌株，可能為genB2缺失菌株或者回復突變株。
[0036]獲得的其中一株阿泊拉黴素敏感型菌株，命名為絳紅色小單孢菌GB102，簡稱GB102。提取基因組DNA，並以親株G1008和單交換菌株GB21的基因組DNA作對照，用雙交換篩選引物PB5/PB6進行PCR鑑定。PCR產物電泳檢測見圖4。GB102基因組只擴增到1156bp左右的片段，經測序，結果與預測吻合，因此，絳紅小單孢菌GB102為genB2敲除工程菌。
[0037]實施例2:
1、工程菌GB102的發酵
種子培養基:葡萄糖0.1%，玉米澱粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白腖0.2%，黃豆餅粉1.0%，KNO3 0.05%, CaCO3 0.5%, ρΗ7.0。
[0038]發酵培養基:玉米澱粉6.0%，玉米粉1.0%，蛋白腖0.4%，黃豆餅粉2.0 %，KNO3
0.01%, (NH4)2SO40.1%，CaCO3 0.5%,澱粉酶 0.025%, ρΗ7.5。
[0039]實例I中獲得的絳紅色小單孢菌GB102的發酵。工程菌GB102轉接斜面培養基，在37°C下培養8-9天，待斜面生成豐厚孢子，用接種針刮取I cm 2孢子至種子培養基。在280rpm/min, 37°C搖床培養28-36小時，深沉培養進入對數生長期時，按10%接種量轉接於發酵培養基(裝量為50mL/250mL三角瓶)，37°C搖床發酵120 h(轉速為280rpm)。
[0040]20000升發酵罐生產，攪拌轉速180轉/分鐘，通氣量1:0.5~1.0 (M3 /M3.min),培養基，培養溫度，接種量比例，發酵時間等，類似於搖瓶發酵。
[0041]2、代謝產物提取 A、粗提
發酵液稀釋後分別酸化、鹼化後，用732-NH/樹脂靜態吸附4小時。收集吸附飽和樹月旨，用0.01M HCl溶液酸洗飽和樹脂,再用無離子水洗滌至中性,再用0.01%氨水進行鹼洗，當流出液達PH 9.0以上時，串聯到等體積的711樹脂柱上，收集樹脫液。
[0042]B、精製、結晶
洗脫液經薄膜濃縮到約300000ug/mL，用濃硫酸調至pH5.5飛.0，加5%活性炭脫色，透光度達92%以上，過濾去除固體物，得透明澄清溶液。在攪拌下，緩慢向濃縮液中滴加入95%以上乙醇，進行過夜結晶，之後經離心分離，85%乙醇溶液淋洗即得溼成品。經真空乾燥(真空度500mmHg以上，溫度60°C，乾燥6小時)，得代謝產物精製品。
[0043]3、代謝產物分析
薄層色譜分析(TLC):按照中華人民共和國藥典(2010版)，展開劑系統配製如下，氯仿:甲醇:氨水(25%)=1:1:1，配製15ml混合溶液，靜置2h，取下層溶液作為展開劑。TLC檢測結果見圖5(1是慶大黴素標準品，2是GB102代謝產物)，從中可以看出，工程菌GB102主產慶大黴素C2a，C2，少量Cla。
[0044]高效液相色譜分析(HPLC):參照中國人民共和國藥典2005版。用碳十八矽膠為填充劑；以水-冰醋酸-甲醇(25: 5: 70)配製的庚烷磺酸鈉溶液(0.02mol/L)為流動相；檢測波長為330nm.取樣品適量，加入適量的鄰苯二甲醛和異丙醇，混勻後置於60°C水浴中加熱15min，冷卻，過濾，量取10 μ I注入高效液相色譜儀。HPLC分析結果見圖6，慶大黴素標準品各組分的保留時間:Cl (5.13min)，Cla (11.58min),C2a (14.53min),C2 (16.89min)；GB102的粗製樣品則存在兩個主峰，其中14.50min與C2a的保留時間一致，確定為C2a組分，而6.50min的峰 為衍生劑的峰；在5.13min和11.58min存在微小峰，是微量的Cl和Cla。C2 (16.98min)則完全沒檢測到。
[0045]質譜分析(MS):安捷倫6520四級杆飛行時間串聯質譜儀，參數設置:ESI ( + ),100 ~800m/z ;流速，8.0 L.mirT1 ;溫度，350°C;噴霧器壓力，2.07X105 Pa ；Vcap 3500 V ;碰撞電壓，135 V.MS檢測結果見圖7，主要分子量為464的物質，以及其雙電荷峰232，對應於HPLC中主峰C2a ;少量的分子量為450和478物質，對應於HPLC中的Cla和Cl。322.6為碎片峰。
[0046]綜合TLC、HPLC和MS分析結果表明，工程菌GB102主要積累慶大黴素C2a，微量Cla和Cl，而檢測不到C2。
[0047 ]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
【權利要求】
1.一種產慶大黴素C2a工程菌，其特徵在於:所述工程菌為絳紅色小單孢菌GB102，該菌株已於2014年4月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.9112。
2.根據權利要求1所述的一種產慶大黴素C2a工程菌，其特徵在於，在產慶大黴素放線菌的基因組中滅活供《似基因，所述基因序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據權利要求2所述的工程菌，其特徵在於，敲除基因的DNA序列為genB2的DNA序列。
4.根據權利要求2所述的工程菌，其特徵在於，滅活基因的方法包括基因敲除和基因置換。
5.一種如權利要求1所述的一種產慶大黴素C2a工程菌的製備方法，其特徵是，主要包括以下步驟: (1)滅話genB2同源重組質粒的構建； (2)滅活#同源重組質粒轉化絳紅小單孢菌； (3)滅活供《沈?單交換菌株的篩選； (4)滅活供基因工程菌的篩選； (5)滅活genB2基因工程菌代謝產物的鑑定。
6.根據權利要求5所述工程菌的製備方法，其特徵是，基因敲除的方法為PCR擴增供《似基因上下遊序列大約2000bp的兩個片段作為同源交換臂，按順序連接到穿梭質粒PKC1139中，得到同源重組質粒PZB303。
7.根據權利要求5所述的一種產慶大黴素C2a工程菌的製備方法，其特徵是，所述的轉化方法為大腸桿菌ET12567/pUZ8002介導的接合轉移方法。
8.根據權利要求5所述工程菌製備方法，其特徵是，所述滅活基因工程菌的篩選為先獲得阿泊拉黴素抗性菌株，鬆弛培養後再從中篩選到阿泊拉黴素敏感菌株，再通過PCR驗證得到genB2基因阻斷工程菌。
9.根據權利要求5所述的一種產慶大黴素C2a工程菌的製備方法，其特徵在於:所述的鑑定為採用薄層層析法、高效液相分析和MS分析其代謝產物。
10.一種如權利要求1所述的一種產慶大黴素C2a工程菌在製備抗菌藥物和抗生素藥物中的應用。
【文檔編號】A61P31/00GK104004681SQ201410247211
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】洪文榮 申請人:福州市鼓樓區榮德生物科技有限公司