三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法
2023-05-06 07:17:16
專利名稱：三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法
技術領域：
本發明涉及三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養方法，尤其是涉及三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法。
背景技術：
呼腸孤病毒是ー類宿主範圍很廣的病毒，其宿主可涵蓋哺乳動物、禽類、昆蟲、水生動物等。感染水生生物的一類呼腸孤病毒被歸類為水生呼腸孤病毒屬。Meyers等於1979年首次從美國牡蠣中分離到了水生呼腸孤病毒。目前分離鑑定的水生呼腸孤病毒有40餘株。這些病毒主要通過呼吸和腸道侵染宿主，導致宿主出血病和肝臟與胰臟的疾病。在全球範圍內的水產養殖業中造成了巨大的損失，嚴重威脅了水產養殖業的發展。水生呼腸孤病毒是水生動物中普遍存在的病毒，在魚、蝦、蟹中均有報導。三疣梭子蟹是我國重要的水產養殖品種，在我國的江浙、兩廣、福建等地已經開始成功的規模化養殖，近年來隨著養殖規模的擴大，各種病害頻繁爆發。課題組在對三疣梭子蟹病害的研究過程中，首次從患病的三疣梭子蟹體內檢測到了呼腸孤病毒的存在，通過人エ感染實驗等研究確定其為秋冬季梭子蟹大量死亡的主要病原，該病毒給三疣梭子蟹的養殖帶來了巨大的損失。為了尋找預防和控制三疣梭子蟹呼腸孤病毒感染的有效方法，對該病毒開展病原生物學、診斷學、感染機理等方面研究顯得尤為重要。這就必須要有穩定的病毒來源，最好的方法就是對其進行體外培養。迄今為止，國內外對病毒的體外培養多集中在細胞培養等技術上，呼腸孤病毒雖然具有較廣的宿主範圍，但種間差異較大，因此，利用細胞培養對三疣梭子蟹呼腸孤病毒進行體外培養需要相應的細胞株或細胞系，目前還沒有成熟的蟹細胞培養技木。另外，細胞培養法存在培養成本高、培養條件要求高等缺點，同時還存在著病毒能否傳代的問題。雞胚培養是ー種廣泛運用於哺乳動物病毒、禽類病毒等的培養方法，如授權公告號為CN101633911A，公告日為2010年I月27日，發明名稱為「適合於大規模生產人用禽流感疫苗的純化技術中病毒的培養方法」，就採用了 9-11日齡無畸形、血管清晰、活動的健康雞胚進行病毒培養，這種培養方法可為規模化生產人用禽流感病毒裂解疫苗提供足夠的、合格的禽流感病毒。但是，病毒雞胚培養多見於ー些高等動物病毒的培養，在水生動物病毒領域的研究應用極其罕見。目前，國內外還沒有關於利用雞胚培養方法培養蟹類病毒包括三疣梭子蟹呼腸孤病毒的方法的相關研究報導。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法，該方法首次將雞胚培養技術應用於三疣梭子蟹呼腸孤病毒的培養，可實現三疣梭子蟹呼腸孤病毒快速、高效、穩定、便捷的體外傳代培養。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為
一種呼腸孤病毒，所述病毒為三疣梭子蟹呼腸孤病毒(Portunnustrituberculatusreovirus),該病毒為球狀對稱結構，無囊膜，直徑30±10nm。毒株為R1015株，保藏號為CGMCC No. 5379，於2011年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。—種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法，採用SPF雞胚作為三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養體系，選擇3-4日齡健康雞胚，將預先製備好的三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，繼續培養直至雞胚出現死亡，收集培養時間為3-10天的死亡雞胚進行勻漿、離心分離，得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液。具體的操作步驟如下
(1)選取符合SPF規格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相対溼度50%，每4小時翻蛋一次，培養3-4天後，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發育良好的雞胚在暗室內畫出氣室邊 緣並標明大血管所處位置，以備病毒接種用；
(2)選取感染呼腸孤病毒的三疣梭子蟹若干只，取鰓、肌肉和內臟，按質量體積比Ig:IOml比例將鰓、肌肉和內臟的混合物加入到PH為7. 4的TNE緩衝液，於勻漿器中勻漿；將勻漿液於4°C，6000g，離心20min後取含病毒的上清液，將離心所得的沉澱用I 2ml的TNE緩衝液重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液於4°C，6000g,離心20min，合併兩次離心所得的上清液，將合併所得上清液先用O. 45 μ m的濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的濾膜抽濾除菌，除菌後的上清液每毫升加入1000単位青黴素和IOOOug鏈黴素後，於4°C冰浴過夜處理，即得到三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液；
(3)選取健康，發育良好的3-4日齡的雞胚，將三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液按O. 15-0. 2ml的接種量接種到雞胚的尿囊上，將已接種了病毒的雞胚於32. 5°C的恆溫條件下培養13-14天，收集培養時間為3-10天的死亡雞胚；
(4)將步驟(4)得到的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，按質量體積比Ig:10ml比例將尿囊膜與尿囊液的混合物加入到PH為7. 4的TNE緩衝液勻漿，按步驟(3)操作，即得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液。步驟(2)中採用的TNE緩衝液配製方法是稱取6. 0578g Tris，12g Nacl，1.8612gEDTA，加入800ml雙蒸水完全溶解，用鹽酸調節PH至7. 4，加入雙蒸水定容至IOOOml，高壓滅菌。與現有技術相比，本發明的優點在於本發明首次提出了三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法，該方法具有如下優點
(I)目前為止針對蟹病毒培養主要還是依靠人工感染宿主蟹後收集發病或死亡宿主蟹來獲取病毒，並沒有蟹病毒體外培養相關研究報導。本發明中涉及的三疣梭子蟹呼腸孤病毒雞胚培養是雞胚培養首次運用於蟹病毒的體外培養。利用病毒宿主蟹進行人工培養的方法雖然可以較好獲得的病毒，但是存在著宿主蟹帶毒的風險。而SPF雞胚無病毒隱性感染，此外雞胚對病毒的敏感範圍很廣，多種病毒均能適用。(2)用雞胚培養的方法培養三疣梭子蟹呼腸孤病毒，克服了三疣梭子蟹呼腸孤病毒培養過程中無合適培養體系，細胞培養成本高、易汙染且不能進行傳代培養及無法滿足病毒需求等缺點，並且本發明培養的病毒其毒力與原代病毒毒力相當，未出現弱化，可用於該病毒的繼續傳代以及其他任何針對該病毒的研究。(3)蟹類病毒大多都沒有細胞培養的方法，因此蟹類病毒若採用細胞培養將面臨著諸如培養細胞選擇，細胞培養基條件探索等問題。這些過程往往需要花費大量的精力和財力。而使用蟹病毒宿主蟹進行病毒傳代除了上述的帶毒隱患外，還存在實驗動物購買成本高的問題，另外養殖條件和實驗管理以及季節氣候等因素也會對實驗造成一定的影響。雞胚培養則很好的解決了上述問題。本發明中所用的雞胚均購置當地專門的SPF種雞養殖場，獲取方便，成本較低，避免了開發細胞培養以及購買三疣梭子蟹面臨的成本高，對實驗條件要求嚴格，養殖管理等方面的問題，而且不會受季節氣候的影響，一年四季均可培養。(4)接種了三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚在上述相應的培養溫度和培養時間下，病毒能得到較好的繁殖。綜上所述，本發明三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法提供ー種更高效、更適用的三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養方法，以對三疣梭子蟹呼腸孤病毒進行快速、有效的體外傳代培養，克服了在三疣梭子蟹呼腸孤病毒培養過程無合適培養體系，現有培養方法難以進行病毒傳代培養的問題，因此雞胚培養方法在三疣梭子蟹呼腸孤病毒中的應用將填補水產動物病毒雞胚培養體系的空白，並為以後的研究與應用奠定基礎。三撫梭子蟹呼腸孤病毒(Portunnustrituberculatus reovirus),毒株為 R1015株，保藏號為CGMCC No. 5379，於2011年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
圖I三疣梭子蟹呼腸孤病毒雞胚培養電鏡觀察結果。
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發明作進ー步詳細描述。以下實施例對本發明作了進ー步說明，但本發明的保護範圍並不限於此，保護範圍以權利要求為準。本發明三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法，採用SPF雞胚作為三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養體系，選擇預先培養了 3-4天的健康雞胚，將預先製備好的三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，繼續培養直至雞胚出現死亡，收集培養時間為3-10天的死亡雞胚進行勻漿離心分離提取含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液，該三疣梭子蟹呼腸孤病毒的毒株為R1015株，保藏號為CGMCC No. 5379，於2011年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。其具體培養方法如下
(1)選取符合SPF規格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相対溼度50%，每4小時翻蛋一次，培養3-4天後，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發育良好的雞胚在暗室內畫出氣室邊緣並標明大血管所處位置，以備病毒接種用；
(2)選取感染呼腸孤病毒的三疣梭子蟹若干只，取鰓、肌肉和內臟，按質量體積比Ig IOml比例將鰓、肌肉和內臟的混合物加入到PH為7. 4的12%。的TNE緩衝液，於勻漿器中勻漿；將勻漿液於4°C，6000g，離心20min後取含病毒的上清液，將離心所得的沉澱用I 2ml的12%。TNE重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液於4°C，6000g，離心20min，合併兩次離心所得的上清液，將合併所得上清液先用O. 45 μ m的濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的濾膜抽濾除菌，除菌後的上清液每毫升加入1000単位青黴素和IOOOug鏈黴素後，於4°C冰浴過夜處理，即得到三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液；
(3)選取健康，發育良好的3-4日齡的雞胚，將三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液按O. 15-0. 2ml的接種量接種到雞胚的尿囊上，將已接種了病毒的雞胚於32. 5°C的恆溫條件下培養13-14天，收集培養時間為第3-10天的死亡雞胚；
(4)將步驟(4)得到的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，按質量體積比Ig IOml比例將尿囊膜與尿囊液的混合物加入到PH為7. 4的12%。的TNE緩衝液勻漿，按步驟(3)操作，即得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液；
(5)傳代培養將步驟(4)中製備的病毒液按照步驟(3)的方法接種雞胚。 在此具體實施例中，步驟(I)中種蛋培養時間3天後接種效果最佳；步驟(2)中米用的TNE緩衝液配製方法是稱取6. 0578g Tris，12g Nacl，1.8612g EDTA，加入800ml雙蒸水完全溶解，用鹽酸調節PH至7. 4，加入雙蒸水定容至1000ml，高壓滅菌。在本實施例中，死亡雞胚各組織電鏡觀察結果如圖I中所示，各組織細胞中見大量的球狀病毒粒子，其形態大小與三疣梭子蟹組織中以及純化後的的病毒形態大小基本相同。將其純化後回歸接種梭子蟹感染成功，致死率100%，臨床症狀與自然發病死亡蟹相同，說明病毒經雞胚培養後病毒毒力沒有減弱。在對病毒進行雞胚傳代研究中，接種了從死亡雞胚組織中分離得到的含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液的雞胚在培養結束時死亡率為100%，對照組(空白對照組，未接種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚)雞胚沒有出現死亡，這說明了病毒的雞胚傳代培養是可行的。結果表明利用雞胚培養三疣梭子蟹呼腸孤病毒取得成功。
權利要求
1.一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法，其特徵在於採用SPF雞胚作為三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養體系，選擇預先培養了 3-4天的健康雞胚，將預先製備好的三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，繼續培養直至雞胚出現死亡，收集培養時間為3-10天的死亡雞胚進行勻漿離心分離，得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液，所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒的毒株為R1015株，保藏號為CGMCC No. 5379，於2011年10月21日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心。
2.根據權利要求I所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法，其特徵在於具體的操作步驟如下 (1)選取符合SPF規格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相對溼度50%，每4小時翻蛋一次，培養3-4天後，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發育良好的雞胚在暗室內畫出氣室邊緣並標明大血管所處位置，以備病毒接種用； (2)選取感染呼腸孤病毒的三疣梭子蟹若干只，取鰓、肌肉和內臟，按質量體積比Ig:IOml比例將鰓、肌肉和內臟的混合物加入到PH為7. 4的TNE緩衝液，於勻漿器中勻漿；將勻漿液於4°C，6000g，離心20min後取含病毒的上清液，將離心所得的沉澱用I 2ml的TNE緩衝液重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液於4°C，6000g,離心20min，合併兩次離心所得的上清液，將合併所得上清液先用O. 45 μ m的濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的濾膜抽濾除菌，除菌後的上清液每毫升加入1000單位青黴素和IOOOug鏈黴素後，於4°C冰浴過夜處理，即得到三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液； (3)選取健康，發育良好的3-4日齡的雞胚，將三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液按O.15-0. 2ml的接種量接種到雞胚的尿囊上，將已接種了病毒的雞胚於32. 5°C的恆溫條件下培養13-14天，收集培養時間為3-10天的死亡雞胚； (4)將步驟(3)得到的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，按按質量體積比Ig:10ml比例將尿囊膜與尿囊液的混合物加入到PH為7. 4的TNE緩衝液勻漿，按步驟(2)操作，即得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液。
3.根據權利要求2所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法，其特徵在於步驟(2)中採用的TNE緩衝液配製方法是稱取6. 0578g Tris，12g Nacl，1.8612g EDTA，加入800ml雙蒸水完全溶解，用鹽酸調節PH至7. 4，加入雙蒸水定容至1000ml，高壓滅菌。
全文摘要
本發明公開了三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養方法，特點是採用SPF雞胚作為三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養體系，選擇3-4日齡健康雞胚，將預先製備的三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，繼續培養直至雞胚出現死亡，收集培養時間為3-10天的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，將尿囊膜與尿囊液混合後勻漿、離心、過濾即得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液，優點是提供一種更高效、更適用的三疣梭子蟹呼腸孤病毒體外培養方法，以對病毒進行快速、有效的體外傳代培養，克服了在三疣梭子蟹呼腸孤病毒培養過程無合適培養體系，將填補蟹類病毒雞胚培養體系的空白，並為以後的研究與應用奠定基礎。
文檔編號C12R1/93GK102628030SQ20121001913
公開日2012年8月8日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者劉聯國, 周永強, 彭嬌, 李登峰, 陳炯 申請人:寧波大學