一種粘帚菌素及其應用的製作方法

2023-05-06 07:08:51

專利名稱：一種粘帚菌素及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種粘帚菌素及其應用，屬醫用抗生素技術領域。
背景技術：
迄今已發現的來源於微生物的抗生素已近萬餘種之多，其中許多已廣泛用於治療各種微生物感染性疾病。近年來由於病原真菌及病原細菌的抗性、病毒的變異，原有的醫用抗菌素、抗病毒抗生素治療效果在減退，需要不斷開發新的抗生素，而發明新的抗生素活性成份是問題的關鍵。
經文獻檢索，未發現與本發明相同的公開報導。

發明內容
本發明的目的在於提拱一種其化學結構新穎的粘帚菌素，粘菌帚素可作為製備醫用抗生素的應用。
本發明是這樣實現的1、粘帚菌素的製備(1)粘帚菌素的生產菌的分離篩選本發明的生產菌株為Gliocladium roseum Gr87，該菌株是從雲南的淡水湖泊的腐木中分離得到的，已於2002年10月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號為CGMCC No.0807。
「Gliocladium roseum Gr87菌株」具有下述形態和培養特徵在PDA培養基上於28℃生長5天，其菌落可鋪滿平板，白色、粉紅色或橙紅色。顯微鏡下能夠觀察到粉紅粘帚黴有兩種分生孢子梗，主分生孢子梗是輪狀分枝，長100-200μm，瓶梗3-4輪，大小為17-30X3μm，分生孢子頭狀分散；次生孢子梗(部分在菌落中心形成)，聚集成掃帚狀，瓶梗緊緊壓縮成4-7輪，大小為10-18X2-3μm。分生孢子橢圓形，無色，壁光滑，大小為10-12X3-4μm，分生孢子粘著形成覆瓦狀的柱或不規則的粘層塊。
(2)粘帚菌素的製備用Gliocladium roseum Gr87菌株，通過抗生素常規的液體或固體的發酵方法，製得本發明所述的粘帚菌素。
本發明所述的粘帚菌素對培養基中的營養源無特殊要求，可利用常用於微生物培養的碳源、氮源及其它營養源。其中碳源可為澱粉，糊精，甘油，葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，麩皮等。氮源可為黃豆粉，黃豆餅粉，花生餅粉，棉籽餅粉，玉米漿，酵母粉，腖，銨鹽，硝酸鹽，以及其它有機或無機含氮化合物。對其它營養源，可適量添加一些無機鹽類，例如，食鹽，磷酸鹽以及鉀、鈣、鐵、鎂、錳、鋅之類的金屬鹽。還可添加些動、植、礦物油等作為消泡劑。
本發明所述的粘帚菌素對培養條件也沒有嚴格限制，以適於抗生素生產菌的生長和獲得抗生素粘帚菌素的最高產量為宜。一般培養溫度為20-30℃，以26℃下菌絲體生長較快；培養基的pH範圍為4-9，以接近中性為好。其它條件如培養基組成、通氣量等均應根據具體情況進行適當的調節，以獲得最好的效果。
粘帚菌素由上述所得的培養物，通過常規提取代謝物的方法提取。例如可利用粘帚菌素與雜質在溶解度、離子結合力、吸咐親和力及分子量等方面的差別進行提取。具體地講，粘帚菌素存在於發酵液中時，可用陽離子、陰離子交換樹脂進行交換，然後用稀鹽酸或醋酸進行解吸，也可用大孔吸咐樹脂或活性炭進行吸咐，然後用含水丙酮進行解吸。這樣可得到粗提物，粗提物再通過大孔吸咐樹脂或離子交換樹脂，就可製得淡黃色的半精製品。最後採用Sephedex-LH20凝膠柱層析，即可得到粘帚菌素的橙黃色結晶。而菌絲體中存在粘帚菌素時，則用任選的有機溶劑(例如甲醇、乙醇、丙醇，乙酸乙酯，四氫呋喃，乙腈)冷浸提取4次，將濃縮的粗提物吸收在固體吸收材料(例如粉碎的天然材料，如高嶺土、粘土、滑石，石英等；或粉碎的合成材料，如微粒狀矽膠，氧化鋁等)上，在矽膠柱中進行色譜分離，幹法上樣，以氯仿/丙酮為洗脫劑進行梯度解吸。這樣得到的粗提物再進行類似於從發酵液中提取粘帚菌素的操作，依次通過大孔吸咐樹脂或離子交換樹脂、Sephedex-LH20凝膠柱層析，即可得到粘帚菌素的橙黃色結晶。
2、粘帚菌素的理化及生物性質a.分子式為C21H16N6O2，分子量為384(FAB法測定)，結構式為
b.物化特徵為外觀橙黃色粉未狀物質；溶解性溶於丙酮、甲醇、二甲亞碸等，不溶於氯仿和水等；高分辨正離子FAB質譜實測值為385.1402，計算值為385.1413；紫外吸收UV(pyridine)λmax(ε)為289.4(0.1818)，238.8(0.2925)，217.4(0.7205)，203.4(0.7806)nm；紅外吸收IR(film)vmax為3409，1734，1682，1634，1605，1547，1482，1458，1428，1345，1303，1246，1142，1114，744；核磁譜特徵見表1，其溶解溶劑為pyridine-d6，500MHz，TMS為內標，δppm.
表1粘帚菌素的核磁譜特徵(吡啶，500MHz)

c.生物活性目前經實驗已證明在紙片法抑菌活性的測定試驗中，當粘帚菌素溶液濃度為200ppm時，處理時間為12小時時，其對宋氏痢疾桿菌(Shigellla flexneri)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、志氏痢疾桿菌(Shigella dysenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、溶血性鏈球菌(Streptococcus haemolyticus)、副氏痢疾桿菌(Bacteriumparadysenteriae)等八種病原細菌的抑菌圈分別為1.60、2.13、1.37、1.80、2.17、2.20、1.53、1.80cm。
本發明的積極效果在於粘帚菌素對病原細菌的生長具有明顯的抑制作用，在科研及相關藥物的開發利用中具有重要的研究和應用價值。
具體實施例方式實施例1從粉紅粘帚黴的固體發酵物中提取分離得到本發明化合物粘帚菌素，具體步驟如下a.真菌粉紅粘帚黴(Gliocladium roseum)Gr87的種子培養改良的PDA培養基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母提取物1.0g，甘油6.0g，瓊脂17g，水1000mL，製成試管斜面，挑取菌株接入斜面，28℃培養5天；b.真菌粉紅粘帚黴的固體發酵培養麥子培養基(製備過程為將麥子浸於自來水中48h，然後洗淨，瀝乾清水，分別裝入500cm的三角瓶中，用棉布包紮瓶口15psi下滅菌兩次，每次40min)。
將斜面培養好的菌株挑入固體發酵培養基，於室溫25℃靜置培養30天；c.將上述培養好的粉紅粘帚黴的菌絲體凍幹，再用任選的有機溶劑(例如甲醇、乙醇、丙醇，乙酸乙酯，四氫呋喃，乙腈)冷浸提取4次，將濃縮的粗提物吸收在固體吸收材料(例如粉碎的天然材料，如高嶺土、粘土、滑石，石英等；或粉碎的合成材料，如微粒狀矽膠，氧化鋁等)上，在矽膠柱中進行色譜分離，幹法上樣，以氯仿/丙酮＝0-50％為洗脫劑梯度洗脫。
d.收集1％-10％的氯仿/丙酮洗脫液，減壓濃縮。
e.將上述濃縮液再次在矽膠柱中進行色譜分離，幹法上樣，以石油醚/丙酮＝10-80％為洗脫劑梯度洗脫。
f.收集TLC板上硫酸顯色為橙黃色的20-30％的石油醚/丙酮洗脫液，濃縮得褚黃色結晶，即為結構式所示的混合物。再經Sephedex-LH20多次分離，即可獲得粘帚菌素。
實施例2採用紙片法檢測粘帚菌素對宋氏痢疾桿菌，結核分枝桿菌，綠膿桿菌，志氏痢疾桿菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，溶血性鏈球菌，副氏痢疾桿菌等八種病原細菌的拮抗活性試驗。
1.試驗用藥劑將試驗用樣品先溶於少量有機試劑DMSO，再加入一定濃度的吐溫水溶液分別製備濃度為200ppm的樣品測試溶液。在該溶液中，DMSO的終濃度＜3％、吐溫的終濃度＜5‰。另將相同濃度的DMSO溶解於含有0.5％(V/V)的吐溫-20的水溶液作為對照。
2.病原細菌的培養培養基配方為常規牛肉膏蛋白腖培養基(牛肉膏3g，蛋白腖10g，NaCl5g，水1000mL，pH7.5)，將待測試病原細菌菌種接種到250mL三角瓶中(每瓶裝50mL)，37℃下搖床(轉速為220rpm)培養24小時，病原細菌含量大於1×1010/mL。
製備混菌平板將直徑9cm培養皿來菌後，倒入20mL45℃的前述常規牛肉膏蛋白腖培養基和0.1mL的病原細菌發酵菌液，充分混勻，製成混菌平板。
3.試驗方法紙片測定法。使用的紙片直徑為2mm，進行試驗時，將蘸有測試樣品溶液的紙片放在混菌平板中間，於37℃下培養12小時，測量抑菌圈直徑，重複三個樣品。
4.試驗結果表3粘帚菌素(200ppm)對病原細菌的抑菌作用

結果表明培養12小時後，對照未出現抑菌圈，而粘帚菌素對所測試的八種病原細菌的生長具有明顯的抑制作用，抑菌圈最大的為2.20cm，最小的也為1.37cm，顯示了其對病原細菌的較好抗性。
權利要求
1.一種粘帚菌素，由生產菌株，通過液體或固體發酵及提取代謝物的方法得到，其特徵在於a.生產菌株是粉紅粘帚黴(Gliocladium roseum)Gr87，該菌株於2002年10月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會，保藏號為CGMCCNo.0807；b.粘帚菌素的分子式為C21H16N6O2，分子量為384，結構式為 c.粘帚菌素的物化特徵為外觀橙黃色粉未狀物質；溶解性溶於丙酮、甲醇、二甲亞碸等，不溶於氯仿和水等；高分辨正離子FAB質譜實測值為385.1402，計算值為385.1413；紫外吸收UV(pyridine)λmax(ε)為289.4(0.1818)，238.8(0.2925)，217.4(0.7205)，203.4(0.7806)nm；紅外吸收IR(film)νmax為3409，1734，1682，1634，1605，1547，1482，1458，1428，1345，1303，1246，1142，1114，744。
2.權利要求1所述粘帚菌素可作為製備防治宋氏痢疾桿菌，結核分枝桿菌，綠膿桿菌，志氏痢疾桿菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，溶血性鏈球菌，副氏痢疾桿菌的抗生素應用。
全文摘要
本發明涉及一種粘帚菌素及其應用，屬醫用抗生素技術領域。該粘帚菌素由生產菌株通過常規的液體或固體發酵及提取代謝物的方法得到。生產菌株為Gliocladium roseum Gr87，該菌株於2002年10月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會，保藏號為CGMCC No.0807；粘帚菌素的分子式為C
文檔編號A61P31/06GK1683546SQ20051001069
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月16日 優先權日2005年3月16日
發明者董錦豔, 張克勤 申請人:雲南大學