一種從生物樣品中將登革病毒滅活和去除的方法
2023-05-07 00:28:06 1
專利名稱：一種從生物樣品中將登革病毒滅活和去除的方法
技術領域：
本發明涉及一種病毒的滅活和去除方法，尤其是從生物樣品中將登革病毒滅活和去除的方法。
背景技術：
登革病毒(Dengue virus)屬於黃病毒科，形態結構與乙腦病毒相似，但體積較小，約40～50nm，依抗原性不同分為1、2、3、4四個血清型，同一型中不同毒株也有抗原差異。其中2型傳播最廣泛，各型病毒間抗原性有交叉，與乙腦病毒和西尼羅病毒也有部分抗原相同。病毒在蚊體內以及白紋伊蚊傳代細胞(C6/36細胞)、猴腎、地鼠腎原代和傳代細胞中能增殖，並產生明顯的細胞病變。
登革病毒感染引起登革熱。該病流行於熱帶、亞熱帶地區，特別是東南亞、西太平洋及中南美洲。我國於1978年在廣東佛山首次發現本病，以後在海南島及廣西等地均有發現。
人對登革病普遍易感。潛伏期約3～8天。病毒感染人後，先在毛細血管內皮細胞及單核巨噬細胞系統中複製增殖，然後經血流擴散，引起發熱、頭痛、乏力，肌肉、骨骼和關節痛，約半數伴有噁心、嘔吐、皮疹或淋巴結腫大。部分病人可於發熱2～4天後症狀突然加重，發生出血和休克。臨床上根據上述症狀可將登革熱分為普通型和登革出血熱/登革休克症候群二個類型。後者多發生於再次感染異型登革病毒後，其基本病理過程是異常的免疫反應，它涉及病毒抗原-抗體複合物、白細胞和補體系統，病情較重，病毒率高。
登革病毒經蚊(主要是埃及伊蚊)傳播，全球每年有五千萬至一億人感染登革病毒，而此經蚊子傳播的疾病還在穩步增長。登革病毒能在含有蛋白的液體(如血液)中持久生存，因而能通過血液或血製品傳播。如不加以控制，這將會是一個嚴重的公共衛生問題。
美國專利5,808,011公開了應用層析法去除朊病毒的方法。美國專利6,468,733公開了應用有機溶劑/去汙劑法聯合納米過濾法滅活病毒的方法。美國專利申請10/220,929公開了應用陽離子交換層析法吸附免疫球蛋白的生產方法，而所得的免疫球蛋白組分可能帶有病毒因而需要進行病毒滅活處理。上述這些方法都沒有經過登革病毒的去除驗證，因而從未被應用於登革病毒去除的實際操作中。
經血液傳播的病原體(如登革病毒)是血液或血製品生產中令人特別關注的問題。一袋受病原汙染的血漿，如果混入大生產的血漿庫中就有可能將疾病傳播給眾多的血製品使用者。因此，有必要提供一種能夠有效去除登革病毒的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種從生物樣品中將登革病毒滅活和去除的方法。
本發明是一種從含有至少一種目標生物分子的生物樣品中將登革病毒滅活和去除的方法。該方法包括如下步驟(1)應用至少一種有機溶劑有效地滅活登革病毒；(2)通過陽離子交換層析法將登革病毒與目標生物分子實際上分開。
步驟(1)可用的有機溶劑選自磷酸三正丁酯、磷酸三叔丁酯、磷酸三正己酯、磷酸三乙基己酯或磷酸三正癸酯中的一種或多種。
上述步驟(1)的有機溶劑作用是滅活脂包膜病毒，此時有機溶劑可與非離子型去汙劑一起聯合使用。所述的去汙劑選自辛基酚聚氧乙烯醚、辛基-β-硫代毗喃葡萄糖苷或聚氧乙烯山梨醇單油酸酯中的一種或多種。該步驟(1)的優選情況是以重量百分比濃度為0.1％～2.0％的磷酸三正丁酯，聯合以重量百分比濃度為0.1％～5.0％的辛基酚聚氧乙烯醚一起使用。優選的病毒滅活條件是在1℃～50℃下處理至少一小時。
上述步驟(2)可通過任何層析樹脂實現。該樹脂的一些非限制性例子是矽膠、氧化鋁、鈦多聚陽離子、交聯葡聚糖、瓊脂糖、交聯瓊脂糖以及帶陽離子基團的多聚體。優選情況是，該陽離子交換層析選用帶有羧甲基基團的交聯瓊脂糖，並且該步驟(2)包括在pH4.0±0.5範圍內進行層析柱的預平衡和上樣、在pH7.0±0.5範圍內進行層析柱的清洗以及在pH9.0±0.5範圍內應用含有0.1±0.05M甘氨酸和0.15±0.1M氯化鈉的洗脫液將目標生物分子從層析柱上洗脫下來。其中上柱緩衝液可以為乙酸緩衝液，低鹽，離子強度小於5mS/cm。
優選的情況是，上述的生物樣品是源自人血漿、人血漿的沉澱物或者人血漿的冷沉澱物，而該目標生物分子是免疫球蛋白。人源的免疫球蛋白是經過如下順序的步驟從人血漿中得到的(1)在pH7.1±0.1範圍內將人血漿進行8±0.5％乙醇的低溫沉澱，接著在pH5.85±0.05範圍內進行19±0.5％的乙醇沉澱；(2)將所得到的沉澱溶解，並且加入pH3.9的0.8M乙酸鈉/4.0M乙酸緩衝液；(3)調節pH至5.1±0.1；(4)加入乙醇至終濃度15±1.0％；(5)在-5℃至-5.5℃範圍內溫和攪拌1至2小時；(6)通過2,300×g的離心除去沉澱，得到含有免疫球蛋白的上清液。
本發明的上述方法可作如下變化，在有機溶劑滅活病毒步驟之前，該樣品可經0.22μm～0.1μm的濾膜預過濾後，再通過35nm的濾膜進行病毒去除過濾。
從免疫球蛋白溶液中將登革病毒滅活和去除的最優選情況如下所述(1)應用辛基酚聚氧乙烯醚和磷酸三正丁酯聯合處理該免疫球蛋白溶液；(2)通過以帶有羧甲基基團的交聯瓊脂糖為樹脂的陽離子交換層析法，在pH4.0±0.1範圍內進行預平衡和上樣、在pH7.0±0.1範圍內進行清洗以及在pH9.0±0.1範圍內應用0.1±0.05M甘氨酸和0.15±0.05M氯化鈉將該免疫球蛋白洗脫，從而將登革病毒與該免疫球蛋白分開。
在此最優選的情況下，辛基酚聚氧乙烯醚和磷酸三正丁酯的重量百分比濃度分別是1±0.1％和0.3±0.1％，而對該免疫球蛋白溶液進行的病毒滅活是在28℃-32℃下處理至少一小時。該病毒滅活也可以進行至少四小時，或更優選的，四至十六小時之間。
另一方面，本發明提供一種不附帶傳染性登革病毒的人血漿白蛋白的生產方法。該方法包括如下順序的步驟(1)將人血漿進行以下pH值和乙醇濃度的低溫沉澱，在pH7.1±0.1範圍內8±0.5％乙醇、在pH5.85±0.05範圍內19±0.5％乙醇、在pH5.86±0.05範圍內40±0.5％乙醇以及在pH4.77±0.05範圍內40±0.5％乙醇；(2)加入0.032M的辛酸鈉，並調節該白蛋白溶液至pH6.8；(3)加熱該混合液，並在59℃-61℃下處理至少一小時。
本發明提供了從生物樣品中將登革病毒滅活和去除的方法。在本說明書以及權利要求書中，「生物樣品」是指生物來源的樣品，非限制性的例子是血製品、尿液提取物和細胞分解液。「血製品」是指源於人或動物的血液或血漿產品。其可包含，但不限於，酶、包括凝血因子的酶原、酶抑制物、免疫球蛋白、白蛋白、纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白原、纖維結合蛋白或血漿。
本發明中，「去除」是指病毒顆粒、蛋白、遺傳物質或其混合物的去除。
本發明中，「對數降低量」是指病毒降低量的對數值(Log10)。
本發明中，單位M表示mol/L。
本發明所提供的將登革病毒滅活和去除的方法是血漿蛋白生產過程中特定的病毒滅活和去除步驟，這些步驟包括免疫球蛋白工藝的病毒過濾、有機溶劑滅活和離子交換層析去除，以及白蛋白工藝的巴斯德(巴氏)消毒法。
通過本發明的方法，可有效地將有活性的登革病毒、滅活的登革病毒以及登革病毒的RNA從生物樣品中去除。這樣，可避免外源病毒或其遺傳物質輸入人體內所可能引發病毒感染或免疫反應的風險。本發明還公開了優選的技術方案，特別是製備不附帶登革病毒的免疫球蛋白的方法。此外本發明還提供了不附帶登革病毒的血漿白蛋白的製備方法。就登革病毒而言，通過本發明方法處理後的生物製品符合人用安全標準。
本發明的離子交換層析步驟是一個簡單、有效而且經濟的工藝，可將病毒、有機溶劑或者有機溶劑和去汙劑的混合物與生物樣品簡單地一步分開。
具體實施例方式
下面實施例用於對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的範圍。
實施例1免疫球蛋白工藝的登革病毒滅活和去除步驟1病毒去除過濾已初步純化的免疫球蛋白溶液經過0.22μm或0.1μm的濾膜(Millipore SteritopTM)預過濾以除去病毒聚合物。該免疫球蛋白溶液在室溫及80kPa的恆壓下，再使用35nm的濾膜(Asahi KaseiPlanova)進行病毒去除過濾。
步驟2有機溶劑與去汙劑處理將經病毒去除過濾的免疫球蛋白溶液升溫至28℃，然後分別加入辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X-100)和磷酸三正丁酯至1％和0.3％的終濃度。對該免疫球蛋白溶液進行的病毒滅活在28℃-30℃下維持處理十六小時。
步驟3離子交換層析將經免疫球蛋白工藝循環使用了476次的帶有羧甲基基團的交聯瓊脂糖樹脂(Pharmacia CM SepharoseFast Flow)填充到直徑為10毫米的層析柱，並使柱床高度為11釐米。該層析柱以0.02M乙酸鈉(pH4.0)進行預平衡。以1M鹽酸和純化水分別調節經有機溶劑與去汙劑處理的免疫球蛋白溶液至pH4.0及離子強度至1.40mS/cm，然後將該溶液在室溫下以40cm/h的線性流速加入到該層析柱。該層析柱在上樣後以10倍體積的0.01M甘氨酸(pH7.0)進行清洗。緊接著，應用含有0.1M甘氨酸和0.15M氯化鈉的緩衝液(pH9.0)將免疫球蛋白從該層析柱上洗脫下來。
本發明將登革病毒從生物樣品中滅活和去除的優選實驗已在此完全描述。雖然這裡描述的是特定的實驗，但是，對於熟練本行業技術的人，本發明的特定細節是可以作多種變化。因而，本發明不得被解釋為受這些優選條件所限制。
實施例1中登革病毒的定量應用上述工藝，以下數據表明了本發明的方法成功地滅活和去除了登革病毒。
在實施例1的每一個工藝步驟前，含有人血漿免疫球蛋白的樣品加入了體積比為1∶9-1∶49的登革病毒(由TCID50法所滴定的病毒含量的對數值為7.17～7.61)或者體積比為1∶20-1∶100的豬細小病毒(由TCID50法所滴定的病毒含量的對數值為8.63～9.76)。經過工藝處理後，取樣做病毒含量滴定，結果顯示在表1。
表1.免疫球蛋白工藝的病毒清除
#附註病毒降低量低於1時不被計算入「總病毒降低量」在有機溶劑與去汙劑處理步驟，加入了體積比為1∶9登革病毒的免疫球蛋白溶液在16小時病毒滅活的不同時段，取樣做病毒含量滴定。結果如表2所示，有機溶劑與去汙劑處理能迅速滅活登革病毒，該步驟處理1分鐘後，已經檢測不到活性的登革病毒。
表2.有機溶劑與去汙劑滅活登革病毒
附註經有機溶劑與去汙劑處理，已經檢測不到活性的登革病毒；病毒降低量的不同是由於病毒滴定樣品體積的不同。
如表1和表2數據所示，登革病毒被成功地滅活。然而，即使被滅活，登革病毒仍然存在於樣品中。因此，該免疫球蛋白溶液仍含有非活性的登革病毒顆粒以及其RNA。下述的陽離子交換層析步驟可將非活性的登革病毒顆粒以及其RNA從生物樣品中去除。
加入了體積比為1∶20牛腹瀉病毒(BVDV，由TCID50法所滴定的病毒含量的對數值為7.22)、登革病毒(DV)、A型肝炎病毒(HAV，由TCID50法所滴定的病毒含量的對數值為7.25)、愛滋病毒(HIV，由TCID50法所滴定的病毒含量的對數值為7.66)或豬細小病毒(PPV)的免疫球蛋白溶液經陽離子交換層析法處理。在層析柱上樣液、流過液和洗脫液中，病毒含量滴定採取細胞病變50％(TCID50)或逆轉錄定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法，結果如表3和表4所示。
在用於定量檢測牛腹瀉病毒的TCID50法中，150微升的MDBK細胞利用96孔板培養，加入50微升的每一稀釋倍數的樣品後，在36±2℃及5％二氧化碳的環境中進行孵放。TCID50法基於陽性對照的細胞病變，應用Spearman Krber方法計算。
至於登革病毒的定量檢測，100微升的Vero E6細胞利用96孔板培養一天，加入各50微升的培養液和每一稀釋倍數的樣品後，在36±2℃及5％二氧化碳的環境中進行孵放。TCID50法基於第五天的陽性對照的細胞病變，應用Spearman Krber方法計算。
而A型肝炎病毒和豬細小病毒的定量檢測，FRHL-4細胞和PK-13細胞分別利用96孔板培養，加入25微升的每一稀釋倍數的樣品後，在36±2℃及5％二氧化碳的環境中孵放60至80分鐘，再加入175微升的培養液。TCID50法基於陽性對照的細胞病變，應用Spearman Krber方法計算。
至於愛滋病毒的定量檢測，50微升的C8166細胞利用96孔板培養，加入50微升的每一稀釋倍數的樣品後，在36±2℃及5％二氧化碳的環境中孵放的十天期間，再分兩次加入各50微升的培養液。TCID50法基於第十天的陽性對照的細胞病變，應用Spearman Krber方法計算。
qRT-PCR法的定量檢測，首先應用Qiagen公司的QIAampViralRNA Mini試劑盒從樣品中提取各雙份的牛腹瀉病毒、登革病毒和愛滋病毒的RNA。然後就樣品和適當的對照，利用病毒特異性的引物和螢光探針進行基於Applied Biosystems公司開發的TaqMan技術的定量逆轉錄聚合酶鏈反應。每一樣品均進行一式三份的反應，而條件已經優化至可檢測50拷貝的牛腹瀉病毒和愛滋病毒，以及4.67拷貝的登革病毒。
表3.陽離子交換層析法的病毒降低量
#附註表示檢測不到活性的病毒；病毒量通過Poisson分布法計算。
本發明詳細的qRT-PCR數據在表4顯示，這些結果清晰地表明，對比於牛腹瀉病毒和愛滋病毒，本發明的陽離子交換層析法可更顯著而有效地清除登革病毒。
表4.陽離子交換層析法的病毒降低量
#附註表示檢測不到病毒；病毒量以檢測靈敏度限值(4.67拷貝)計算。
通過上述的檢測結果可以看出，免疫球蛋白工藝的各步驟非常有效地滅活和去除登革病毒，累積病毒降低量的對數值不低於19.93。而該工藝僅相當溫和地清除豬細小病毒，累積病毒降低量的對數值為1.04。
在上述實施例中，該生物樣品是源自人血漿的已初步純化的免疫球蛋白溶液。下面的實施例描述本發明人如何將該免疫球蛋白從冰凍人血漿中純化出來。
實施例2免疫球蛋白的初步純化血漿組分II+III是通過冷凍乙醇沉澱法(Cohn et a1.，J.Am.Chem.Soc.1946；68459-475)從人的冰凍血漿中得到的。首先在pH7.1將人血漿進行8.0％的乙醇沉澱，將所得的上清液在pH5.85進行19.0％的乙醇沉澱，通過2,300×g的離心得到組分II+III。向溶解的組分II+III加入0.8M乙酸鈉/4.0M乙酸緩衝液(pH3.9)調節至pH5.1，再加入95％乙醇至終濃度15.0％，並且在-5℃至-5.5℃範圍內溫和攪拌1.5小時。通過2,300×g的離心除去沉澱，得到含有免疫球蛋白的上清液。
實施例3不附帶傳染性登革病毒的人血漿白蛋白的純化步驟1組分IV沉澱如實施例2所述，上清液II+III通過連續兩步的乙醇沉澱(8.0％和19.0％)獲得。接著將95％乙醇加入該上清液至終濃度40.0％，並且在-5℃至-5.5℃範圍內溫和攪拌1小時。通過2,300×g的離心除去組分IV，得到含有白蛋白的上清液IV。
步驟2巴氏消毒法應用Millipore公司的30kD超濾膜包將純化的白蛋白溶液以8體積的純化水進行滲濾，然後濃縮至白蛋白終濃度為22％。將醫藥級的辛酸鈉加入到該濃縮的白蛋白至終濃度為0.032M，然後調節pH6.8以及白蛋白終濃度為20％。接著，該20％白蛋白溶液以及經無菌過濾並且分裝的白蛋白產品在水浴箱內加熱至59℃，在59℃至60℃範圍內分別作10小時的大體積巴氏消毒和最終巴氏消毒。進行大體積巴氏消毒時，應用不鏽鋼的機械攪拌器作溫和的攪拌。
本發明的另一方面，不附帶傳染性登革病毒的白蛋白純化的優選實驗已在此完全描述。雖然這裡描述的是特定的實驗，但是，對於熟練本行業技術的人，本發明的特定細節是可以作多種變化。因而，本發明不得被解釋為受這些優選條件所限制。
實施例3中登革病毒的定量在實施例3的每一個工藝步驟前，將體積比為1∶10-1∶25的登革病毒加入到從冰凍人血漿中所得到的白蛋白溶液。經過工藝處理後，取樣做病毒含量滴定，結果顯示在表5。在10小時巴氏消毒處理的不同時段，取樣做登革病毒含量滴定。
如表5所示，白蛋白工藝的各步驟非常有效地滅活登革病毒，累積病毒降低量的對數值不低於10.12。
表5.白蛋白工藝的登革病毒清除
*附註由於「大體積巴氏消毒」在機理上與「最終巴氏消毒」相似，因而只有後者才被計算入「總病毒降低量」。
巴氏消毒法能迅速滅活登革病毒，該步驟處理5分鐘後，已經檢測不到活性的登革病毒。表6顯示，在巴氏消毒處理的不同時段，登革病毒降低量的數據。
表6.巴氏消毒法滅活登革病毒
附註經巴氏消毒處理，已經檢測不到活性的登革病毒；病毒降低量的不同是由於病毒滴定樣品體積的不同。
權利要求
1.一種從含有至少一種目標生物分子的樣品中將登革病毒滅活和去除的方法，其包括步驟(1)單獨使用有機溶劑或與非離子去汙劑聯用，滅活登革病毒；(2)通過陽離子交換樹脂將登革病毒與目標生物分子分開。
2.如權利要求1所述的方法，其中步驟(2)包括在pH 4.0±0.5範圍內進行層析柱的預平衡和上樣、在pH 7.0±0.5範圍內進行層析柱的清洗以及在pH 9.0±0.5範圍內應用含有0.1±0.05M甘氨酸和0.15±0.1M氯化鈉的緩衝液將目標生物分子從層析柱上洗脫下來。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述滅活的溫度是28～32℃。
4.如權利要求1所述的方法，其還包括在滅活前將樣品經0.22μm～0.1μm的濾膜預過濾，再通過35nm的濾膜進行病毒去除過濾。
5.如權利要求1～4任一項所述的方法，其中所述的陽離子交換樹脂選自矽膠、氧化鋁、鈦多聚陽離子、交聯葡聚糖、瓊脂糖、交聯瓊脂糖以及帶陽離子基團的多聚體。
6.如權利要求1～4任一項所述的方法，其中所述的有機溶劑選自二烴基磷酸鹽、三烴基磷酸鹽、磷酸三正丁酯、磷酸三叔丁酯、磷酸三正己酯、磷酸三乙基己酯和磷酸三正癸酯中的一種或多種。
7.如權利要求1～4任一項所述的方法，其中所述的非離子型去汙劑選自辛基酚聚氧乙烯醚、辛基-β-硫代毗喃葡萄糖苷和聚氧乙烯山梨醇單油酸酯。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述的樣品是選自血漿、血清、血漿的沉澱物、血清的沉澱物、血漿的冷沉澱物以及血清的冷沉澱物。
9.如權利要求1所述的方法，其中步驟(1)使用磷酸三正丁酯和辛基酚聚氧乙烯醚滅活登革病毒。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述的磷酸三正丁酯的重量百分比濃度是0.3±0.1％，所述的辛基酚聚氧乙烯醚的重量百分比濃度是1±0.1％。
11.如權利要求1、2、4、9或10所述的方法，其特徵在於目標生物分子為免疫球蛋白。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述的目標生物分子為人源的免疫球蛋白。
13.如權利要求9所述的方法，其特徵在於病毒滅活的條件是在28-32℃下處理至少一小時。
14.如權利要求13所述的方法，所述病毒滅活處理時間不少於4個小時。
15.如權利要求14所述的方法，所述病毒滅活處理時間為4～16個小時。
16.一種基本上不附帶傳染性登革病毒的人血漿白蛋白的生產方法，其特徵在於包括如下順序的步驟(1)在pH 7.1±0.1範圍內將人血漿進行8±0.5％的乙醇沉澱；(2)將所得到的上清液在pH 5.85±0.05範圍內進行19±0.5％的乙醇沉澱；(3)將所得到的上清液在pH 5.86±0.05範圍內進行40±0.5％的乙醇沉澱；(4)將所得到的上清液在pH 4.77±0.05範圍內進行40±0.5％的乙醇沉澱；(5)將所得到的沉澱溶解並通過滲濾得到20％的白蛋白溶液；(6)加入0.032M的辛酸鈉，並調節該白蛋白溶液至pH 6.8；(7)加熱該混合液，並在59-61℃下處理至少一小時。
17.如權利要求16所述的方法，其中步驟(7)的處理時間為10小時。
18.如權利要求16所述的方法，其中所述的滲濾為超濾。
全文摘要
本發明涉及一種從含有登革病毒和至少一種目標生物分子的樣品中將登革病毒滅活和去除的方法。其主要特徵在於單獨使用有機溶劑或與非離子去汙劑聯用，進行登革病毒的滅活處理，然後通過陽離子交換層析法將登革病毒與目標生物分子實際上分開。另一方面，本發明還提供了一種基本上不附帶傳染性登革病毒的人血漿白蛋白的生產方法。本發明的方法可有效地去除登革病毒，以避免外源病毒或其遺傳物質輸入人體內所可能引發病毒感染或免疫反應的風險。本發明方法簡單、經濟、高效。
文檔編號C07K1/14GK101024824SQ20061015005
公開日2007年8月29日 申請日期2006年10月25日 優先權日2005年12月6日
發明者黃炳鏐, 謝亦武 申請人:愛華生物科技有限公司