一種裂殖壺菌及其應用的製作方法
2023-05-06 06:15:11
一種裂殖壺菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及微生物發酵工程領域，具體涉及一種裂殖壺菌及其應用。裂殖壺菌，其分類命名為裂殖壺菌(Aurantiochytrium?sp)SD006，已於2013年10月21日保藏於位於北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號為CGMCC?No.8383。所述裂殖壺菌應用於製備二十二碳六烯酸中。本發明所得菌株生長速度快，發酵時間短。利用裂殖壺菌菌株高密度發酵生產二十二碳六烯酸。在上述發酵條件下，60-70小時即能獲得最大產量。經70小時發酵後獲得生物量為180-200g/L，DHA產量為50-65g/L。
【專利說明】一種裂殖壺菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物發酵工程領域，具體涉及一種裂殖壺菌及其應用。
【背景技術】
[0002]二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)是一種人體必需的多不飽和脂肪酸，必須從膳食中補充。DHA是中樞神經系統和視網膜的重要結構脂成分，具有健腦、提高記憶力和視力的功能，尤其是可以促進胎兒和嬰幼兒腦細胞發育生長，提高青少年記憶力，防治老年性痴呆等等。傳統上，DHA主要來源於深海魚油，但由於受過度捕撈、環境汙染、季節變化等的影響很大，逐漸被利用微生物發酵生產所取代。在現階段，工業化發酵生產DHA最
主要的菌種是一種海洋微生物-裂殖壺菌(Aurant1chytrium sp.),其總脂肪酸中DHA
含量高達40% -60%。2010年利用裂殖壺菌生產的DHA藻油已被衛生部批准為新資源食品。然而，目前限制其進一步推廣的主要瓶頸是單位成本上的DHA產量較低。
[0003]目前國內涉及裂殖壺菌菌種篩選及發酵製備DHA油脂的專利主要有二十篇，主要分為三方面內容:(I)優良菌種的選育。如專利CN 1264967 CXN 101892160 BXN 103602591A、CN 101575584 B、CN 102199541 B、CN 102899254 A、CN 102888348 A 以及 CN 102864111B，這些專利通過篩選、培養高生長速率和高DHA含量的裂殖壺菌菌株獲得到生物量最高為120-130g/L，DHA產量最高為25_35g/L ; (2)培養基配方的優化。主要包括的專利有:CN 101993824 A、CN 101831387 B、CN 101886044A、CN 101914581 B 和 CN 103627640 A,這些專利通過改變培養基中的組分，如製備全合成培養基，優化維生素及微量元素含量，降低氯含量和添加外源脂相容性物質如海藻糖、甜菜鹼等方式，達到提高DHA產量的目的；(3)通過優化發酵工藝方式降低生產成本，提高產物得率。此類專利包括CN 101519676 B、CN101812484 B、CN 101824442 B、CN 102972533 A、CN103146584 A 以及 CN 103614427 A。綜合上述專利，裂殖壺菌的最高生物量達到125.2g/L，DHA產量最高為33.5g/L。因此，獲得DHA的高產菌株，並結合優良的發酵工藝，獲得較高的生物量和油脂含量，是DHA的工業化推廣的關鍵所在。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種發酵周期短、生長速度快、並高產二十二碳六烯酸的裂殖壺菌及其應用。
[0005]為實現上述目的本發明採用的技術方案為:
[0006]一種裂殖壺菌,裂殖壺菌,其分類命名為裂殖壺菌(Aurant1chytrium sp) SD006,已於2013年10月21日保藏於位於北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號為CGMCC No:8383。
[0007]裂殖壺菌Aurant1chytrium sp.SD006菌株最適溫度高、生長速度快。其最適生長溫度為28°C _35°C，發酵70小時後能獲得最大的生物量與DHA產量。
[0008] 一種裂殖壺菌的應用，所述裂殖壺菌應用於製備二十二碳六烯酸中。具體，以所述裂殖壺菌為出發菌株，在發酵培養基中高密度發酵獲得製備DHA油脂。
[0009]所述發酵溫度為28°C _35°C，發酵時間為60-80小時，發酵過程中，採用了補氮操作，在發酵的24-48小時區間內流加50% (w/v)的玉米漿溶液。整個發酵過程中採用了補糖操作，控制體系中葡萄糖濃度在20-60g/L之間，發酵結束時葡萄糖濃度不高於10g/L。
[0010]所述發酵培養基為葡萄糖60-120g/L，酵母提取物5-30g/L，玉米漿5_20g/L，磷酸二氫鉀0.5-8g/L，硫酸鎂0.5-5g/L，檸檬酸鈉0.5_5g/L，海水晶5_30g/L，維生素B^O^OOmg/L,維生素B630-200mg/L，維生素B125_50mg/L和生物素2_50mg/L，用水定容至IL0
[0011]一種製備生產二十二碳六烯酸的方法:以所述裂殖壺菌為出發菌株，在發酵培養基中高密度發酵獲得製備二十二碳六烯酸。
[0012]所述發酵溫度為28°C _35°C，發酵時間為60-80小時，發酵過程中，採用了補氮操作，在發酵的24-48小時區間內流加50% (w/v)的玉米漿溶液。整個發酵過程中採用了補糖操作，控制體系中葡萄糖濃度在20-60g/L之間，發酵結束時葡萄糖濃度不高於10g/L。
[0013]所述發酵培養基為葡萄糖60_120g/L，酵母提取物5_30g/L，玉米漿5_20g/L，磷酸二氫鉀0.5-8g/L，硫酸鎂0.5-5g/L，檸檬酸鈉0.5_5g/L，海水晶5_30g/L，維生素B^O^OOmg/L,維生素B630-200mg/L，維生素B125_50mg/L和生物素2_50mg/L，用水定容至IL0
[0014]本發明與已有技術相比具有以下顯著特點和積極效果: [0015]1.本發明篩選得到一株在較高溫度下高產DHA的裂殖壺菌菌株，該菌株能在280C _35°C條件下快速生長，並大量積累二十二碳六烯酸。
[0016]2.本發明所得菌株生長速度快，發酵時間短。利用裂殖壺菌菌株高密度發酵生產二十二碳六烯酸。在上述發酵條件下，60-70小時即能獲得最大產量。經70小時發酵後獲得生物量為180-200g/L，DHA產量為50_65g/L。
[0017]3.本發明所得菌株從廣東省湛江市紅樹林水域中篩選得到可高產二十二碳六烯酸的裂殖壺菌Aurant1chytrium sp.SD006菌株,具有很好的工業應用價值。所篩選能高產DHA的裂殖壺菌，以及利用其高密度發酵生產DHA油脂的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為本發明實施例提供的裂殖壺菌SD006菌株在顯微鏡下的形態，a為光學顯微鏡下觀察，b為透射電鏡觀察，c為掃描電鏡觀察。
[0019]圖2為本發明實施例提供的利用MEGA5軟體得到的裂殖壺菌SD006菌株18S rRNA基因的進化樹。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
[0021]裂殖壺菌,其分類命名為裂殖壺菌(Aurant1chytrium sp) SD006,已於2013年10月21日保藏於位於北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號為CGMCCNo:8383。
[0022]所述裂殖壺菌菌株是從廣東省湛江市紅樹林水域收集的腐葉上採用松花粉垂釣法分離得到。在光學顯微鏡下觀察:菌體為圓球形或橢球形，直徑在10-20微米，主要採用分裂方式進行繁殖。有側生不等長的雙鞭毛(參見圖1)。胞內脂肪酸組成主要為十四烷酸、十六烷酸、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，其中DHA含量佔總脂肪酸的55%以上。用分子生物學手段對其18S rDNA序列進行比對，發現該菌株與裂殖壺菌的18SrDNA序列的同源性大於99%，因此判定本菌株屬於裂殖壺菌，該序列記作SEQ ID N0.1 (參見圖2)。
[0023]SEQ ID N0.1
[0024]ccaacctggt tgatcctgcc agtagtcata tcctcgtctc aaagattaag ccatgcatgt 60
[0025]gtaagtataa gcgattgtac tgtgagactg cgaacggctc attatatcag taataatttc 120
[0026]ttcggtagtt tcttttatat ggatacctgc agtaattctg gaaataatac atgctgtaag 180
[0027]agccctgtat ggggctgcac ttattagatt gaaggcgatt ttattggtga atcatgataa 240
[0028]ttgagcagat tgacttttta gtcgatgaat cgtttgagtt tctgccccat cagttgtcga 300
[0029]cggtagtgta ttggactacg gtgactataa cgggtgacgg agagttaggg ctcgactccg 360
[0030]gagagggagc ctgagagacg gctaccatat ccaaggatag cagcaggcgc gtaaattacc 420
[0031]cactgtggac tccacgaggt agtgacgaga aatatcgatg cgaagcgtgt atgtgttttg 480
[0032]ctatcggaat gagagcaatg taaaaccctc atcgaggatc aactggaggg caagtctggt 540
[0033]gccagcagcc gcggtaattc cagctccaga agcatatgct aaagttgtcg cagttaaaaa 600
[0034]gctcgtagtt gaatttctgg catgggcgac cggtgctttc cctgaatggg gattgattgt 660
[0035]ctgtgttgcc ttggccatct ttttcttttc tttattgggg agaaatcttt cactgtaatc 720
[0036]aaagcagagt gttccaagca ggtcgtatga ccggtatgtt tattatggga tgataagata 780
[0037]ggacttgggt gctatttttg ttggtttgca cgcctgagta atggttaata ggaacagttg 840
[0038]ggggtattcg tatttaggag ctagaggtga aattcttgga tttccgaaag acgaactaga 900
[0039]gcgaaggcat ttaccaagca tgttttcatt aatcaagaac gaaagtctgg ggatcgaaga 960
[0040]tgattagata ccatcgtagt ctagaccgta aacgatgccg acttgcgatt gttgggtgct 1020
[0041]ttattaatgg gcctcagcag cagcacatga gaaatcaaag tctttgggtt ccggggggag 1080
[0042]tatggtcgca aggctgaaac ttaaaggaat tgacggaagg gcaccaccag gagtggagcc 1140
[0043]tgcggcttaa tttgactcaa cacgggaaaa cttaccaggt ccagacatag gtaggattga 1200
[0044]cagattgaga gctctttcat gattctatgg gtggtggtgc atggccgttc ttagttggtg 1260
[0045]gagtgatttg tctggttaat tccgttaacg aacgagacct cggcctacta aatagtgcgt 1320
[0046]ggtatggcaa catagtgcgt tttaacttct tagagggaca tgtccggttt acgggcagga 1380
[0047]agttcgaggc aataacaggt ctgtgatgcc cttagatgtt ctgggccgca cgcgcgctac 1440
[0048]actgatgggt tcatcgggtt ttaattctaa tttttggaat tgagtgcttg gtcggaaggc 1500
[0049]ctggctaatc cttggaacgc tcatcgtgct ggggctagat ttttgcgatt attaatctcc 1560
[0050]agcgaggaat tcctagtaaa cgcaagtcat cagcttgcat tgaatacgtc cctgcccttt 1620
[0051]gtacacaccg cccgtcgcac ctaccgattg aacggtccga tgaaaccatg ggatgtttct 1680
[0052]gtttggattc atttttggac agaggcagaa ctcgggtgaa tcttattgtt tagaggaagg 1740
[0053]tgaagtcgta acaagg1756
[0054]裂殖壺菌Aurant1chytrium sp.SD006菌株可利用的碳源包括葡萄糖，甘油，果糖，糖蜜，澱粉糖化液及木質纖維素糖化液。最適碳源為葡萄糖，濃度為60g/L-120g/L ;對有機氮源和無機氮源均可利用，其中有機氮源包括酵母提取物，蛋白腖，胰蛋白腖，玉米漿，尿素；無機氮源包括無機銨鹽與無機硝酸鹽。最適氮源為酵母提取物，濃度為10g/L-30g/L。另外，玉米漿也是較合適的氮源，濃度為2g/L-10g/L。
[0055]將保存在甘油管的菌株接入裝有50ml種子培養基的250ml搖瓶中，在30°C的搖床中，以200rpm的轉速，培養24h，獲得一級種子；將一級種子接入裝有10ml種子培養基的500ml搖瓶中，在30°C的搖床中，以200rpm的轉速，培養12h，獲得二級種子；向3L生物反應器中加入1.2L發酵培養基，接入活化的二級種子液。發酵過程中，溫度控制在28°C。發酵過程中，採用了補氮操作，發酵的24-48小時內流加50% (w/v)的玉米漿溶液。自動添加2M NaOH或14%檸檬酸使pH值保持在6.5。發酵時間80小時。
[0056]發酵結束後，3L發酵罐獲得裂殖壺菌的產量(參見表1)為180.43g/L，獲得生物油脂 94.lg/L，DHA 產量為 53.5g/L。
[0057]種子培養基為葡萄糖60g/L,酵母提取物5g/L,玉米眾5g/L,磷酸二氫鉀0.5g/L,硫酸鎂0.5g/L,檸檬酸鈉0.5g/L,海水晶5g/L,維生素BJOmg/L,維生素B630mg/L,維生素B125mg/L 和生物素 2mg/L。
[0058]發酵培養基為葡萄糖120g/L，酵母提取物30g/L，玉米漿20g/L，磷酸二氫鉀Sg/L，硫酸鎂5g/L，檸檬酸鈉5g/L，海水晶30g/L，維生素BfOOmg/L，維生素B6200mg/L，維生素B1250mg/L 和生物素 50mg/L。
[0059]表1發酵後裂殖壺菌SD006胞內脂肪酸組成情況
【權利要求】
1.一種裂殖壺菌，其特徵在於:裂殖壺菌，其分類命名為裂殖壺菌(Aurant1chytriumsp) SD006,已於2013年10月21日保藏於位於北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號為CGMCCNo:8383。
2.—種權利要求1所述的裂殖壺菌的應用，其特徵在於:所述裂殖壺菌應用於製備二十二碳六烯酸中。
3.按權利要求2所述的裂殖壺菌的應用，其特徵在於:以所述裂殖壺菌為出發菌株，在發酵培養基中高密度發酵獲得製備DHA油脂。
4.按權利要求2或3所述的裂殖壺菌的應用，其特徵在於:所述發酵溫度為280C _35°C，發酵時間為60-80小時，發酵過程中，採用了補氮操作，在發酵的24-48小時區間內流加50 % (w/V)的玉米眾溶液。
5.按權利要求2或3所述的裂殖壺菌的應用，其特徵在於:所述發酵培養基為葡萄糖60-120g/L,酵母提取物5-30g/L，玉米漿5_20g/L，磷酸二氫鉀0.5_8g/L，硫酸鎂0.5_5g/L，檸檬酸鈉0.5-5g/L，海水晶5-30g/L，維生素BJO10mg/L，維生素B630_200mg/L，維生素B125-50mg/L 和生物素 2_50mg/L。
6.一種製備生產二十二碳六烯酸的方法，其特徵在於:以所述裂殖壺菌為出發菌株，在發酵培養基中高密度發酵獲得製備二十二碳六烯酸。
7.按權利要求6所述的製備生產二十二碳六烯酸的方法，其特徵在於:所述發酵溫度為28°C -35°C，發酵時間為60-80小時，發酵過程中，採用了補氮操作，在發酵的24-48小時區間內流加50% (w/v)的玉米眾溶液。
8.按權利要求6所述的製備生產二十二碳六烯酸的方法，其特徵在於:所述發酵培養基為葡萄糖60-120g/L，酵母提取物5-30g/L，玉米漿5_20g/L，磷酸二氫鉀0.5_8g/L,硫酸鎂0.5-5g/L，檸檬酸鈉0.5-5g/L，海水晶5_30g/L，維生素BJO10mg/L，維生素B630-200mg/L,維生素 B125_50mg/L 和生物素 2_50mg/L。
【文檔編號】C12N1/14GK104031843SQ201410203041
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月14日 優先權日:2014年5月14日
【發明者】崔球, 宋曉金, 譚延振, 馮銀剛 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所