自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系及其建立方法

2023-05-06 23:35:21

專利名稱：自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系及其建立方法
技術領域：
本發明屬於動物細胞系領域。具體涉及一種小鼠肺癌自發高轉移傾向細胞系的建 立及其建立方法。背景資料腫瘤的侵襲和轉移是惡性腫瘤的基本生物學特性之一，也是腫瘤患者死亡的重要 原因。然而，有關轉移的確切機制目前尚不十分清楚。因此，腫瘤轉移一直是腫瘤學研究的 一個熱點。目前有關腫瘤轉移的研究還主要局限於手術切除的腫瘤標本和某些有限轉移特 性腫瘤細胞系的轉移相關指標的觀察，而它們均不能精確地反映腫瘤生長轉移的整個臨床 過程，直接影響著腫瘤轉移機制及其幹預治療的深入研究。為此，有必要建立理想的腫瘤轉 移動物模型對腫瘤轉移進行深入的研究。肺癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，而轉移是導致肺癌患者死亡 的最主要原因。因此，對肺癌轉移的研究已成為當前的熱點之一，建立肺癌轉移的動物模型 正是研究腫瘤轉移生物學和抗轉移實驗治療的重要工具。國內外學者在這方面做了大量的 研究和探索，本研究通過首代切除皮下腫瘤獲得肺轉移灶，結合體內反覆篩選的方法，篩選 出一個小鼠肺癌皮下植瘤自發高轉移模型，並建立了相應高轉移細胞系，為研究肺癌轉移 機制和抗轉移實驗治療提供了較為理想的動物模型及細胞系。本發明的技術方案是利用C57BL/6J小鼠肺癌轉移灶作為建系瘤源，作為一種新 的篩選自發高轉移性腫瘤細胞的方法，採用體外原代培養方式，建立了一株具有自發高轉 移傾向的小鼠肺癌細胞系，命名為LLC-F3。本發明的有益結果是1. C57BL/6J小鼠動物模型可以用來篩選自發高轉移傾向腫瘤細胞株；2.獲得的自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系可以用於篩選抗腫瘤轉移的藥物；3.通過與親本細胞的比較，可應用自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系用於篩選腫瘤 轉移相關蛋白；4.可用於研究腫瘤轉移的發病機理；5.可用於研究製備腫瘤轉移的疫苗；6.通過接種動物來檢測抗腫瘤轉移的疫苗的效果。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系及其建系方法，為 肺癌的遺傳學改變規律，肺癌的病因學，腫瘤轉移機制的研究，以及抗轉移的藥物篩選提供 理想的實驗對象。本發明採用小鼠Lewis肺癌(LLC-F0)細胞株作為建系的源細胞，通過C57BL/6J 小鼠體內連續篩選和體外擴增相結合的方法，建立了一種自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞 系，命名為LLC-F3。本發明通過下述方法和步驟建立自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系LLC-F3。1.按常規方法建立小鼠肺癌原位移植瘤模型
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將小鼠Lewis肺癌細胞株(LLC-FO)細胞體外培養，取5 X IO5個狀態良好的生長 期細胞，接種於C57BL/6J小鼠背側皮下，建立小鼠LLC-FO原位移植瘤模型。2.自發高轉移傾向細胞的體外培養在接種後第18天，切除原位瘤，繼續飼養小鼠；過3個星期後斷頸法處死小鼠，用 75%的酒精消毒。於無菌環境中打開胸腔，取出肺，肉眼可見許多轉移灶；用RPMI 1640培 養液衝洗，儘量洗去血塊，後用鑷子小心取出轉移瘤體於另一預加IOmL RPMI 1640培養液 的培養皿中，剝去包膜並儘量撕碎，過篩除去細胞團和間質成分。IOOOrpm離心5min，培養 於含10%新生牛血清的RPMI 1640培養液中，靜置培養；原代培養每3天換液一次，去除已 經漂浮的細胞和殘留的血細胞。3.瘤細胞的體內外交替生長瘤細胞體外培養一段時間後，將培養所得的細胞按步驟1接種於C57BL/6J小鼠背 側皮下，每隻小鼠接種量為5X 105(0.1mL)。待原位瘤長至IOOOmm3大小則做手術切除。按 步驟2，3進行篩選擴增，同法重複3 4輪篩選。4.建立細胞系將篩選所得的肺轉移細胞體外培養，培養條件同上。隔天更換培養液。每4天傳 代1次，常規凍存後，復甦，建立具有高自發性肺轉移的小鼠肺癌細胞系LLC-F3。經常規系列實驗檢測，本發明的細胞系具有以下特點1.能在體外長期生長和穩定傳代。2.經實驗觀察，體外生長的LLC-F3具有典型的腫瘤細胞特徵，接觸性生長抑制喪 失，染色體數目和結構畸變嚴重，符合惡性腫瘤的遺傳學特徵。3.成瘤性檢測表明，IXlO6細胞(0. ImL)接種於C57BL/6J小鼠背側皮下的成瘤 率是100%，成瘤潛伏期小於7天。腫瘤生長迅速，至接種42天後，腫瘤平均體積可以達到 1000mm3。接種4周時，其肺轉移率可達100 %。4. LLC-FO與LLC-F3的蛋白表達差異分析表明，自發高轉移細胞系LLC-F3與親本 LLC-FO相比，具有特異性表達的蛋白。以上結果表明，本發明細胞系具有成瘤率高、轉移時間早、轉移率穩定的特點，是 一種理想的肺癌轉移研究模型，其在揭示肺癌轉移機制和抗轉移藥物篩選的應用中將有著 廣闊的前景。


圖1篩選LLC-F3實驗流程圖。圖2體外培養的LLC-FO和LLC-F3細胞(X 10)。顯微鏡下顯示，相比於LLC-FO細 胞，LLC-F3細胞均呈簇樣生長，形狀不規則，細胞排列緊密，界限清楚，接觸性抑制喪失。圖3LLC-F0與LLC-F3培養上清中細胞因子含量比較圖。圖4LLC-F0 (A)與LLC-F3⑶的蛋白雙向電泳銀染圖比較。圖5LLC-F0與LLC-F3尾靜脈注射後小鼠生存曲線。圖6LLC-F0與LLC-F3尾靜脈注射後小鼠平均存活時間比較。圖7LLC-F3尾靜脈注射後小鼠肺部轉移隨時間變化情況。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。實施例本發明的材料1. C57BL/6J小鼠由南京大學分子醫學研究所提供。2. RPMI 1640細胞培養液和新生牛血清購自Gibico公司。3. pH 3-10 Pharmacia IPG 膠條購自 Bio-Rad 公司。4. VEGF和PlGF測量試劑盒購自R&D Systems公司。一、自發高轉移性的小鼠肺癌細胞系LLC-F3的建立LLC-FO細胞體外培養，取5X IO5個狀態良好的生長期細胞，接種於C57BL/6J小 鼠的背側皮下，正常飼養荷瘤小鼠；在接種後第18天，切除原位瘤，繼續飼養小鼠；過3個 星期後斷頸法處死小鼠，用75%的酒精消毒。於無菌環境中打開胸腔，取出肺，肉眼可見許 多轉移灶；用RPMI 1640培養液衝洗，儘量洗去血塊，後用鑷子小心取出轉移瘤體於另一預 加IOmLRPMI 1640培養液的培養皿中，剝去包膜並儘量撕碎，過篩除去細胞團和間質成分。 IOOOrpm離心5min，培養於含10%新生牛血清的RPMI 1640培養液中。體外傳代3次後再 次接種C57BL/6J小鼠。18天切除，3個星期後處死分離肺轉移灶，並體外培養。這樣的循 環3次，最後一次得到的細胞即為LLC-F3，大量擴增後備用。二、LLC-FO與LLC-F3的細胞形態觀察將LLC-FO細胞與LLC-F3細胞體外培養至50%融合後，在顯微鏡下觀察。三、培養上清中VEGF和PlGF表達量比較在24孔細胞培養板中接種密度為IX 105/mL的LLC-FO和LLC-F3細胞，用含有 10%新生牛血清的培養液培養24h，觀察細胞生長良好，換用無血清培養液繼續培養24h。 收穫上清，4°C 13200rpm離心15min，取上清用於細胞因子的測量。採用購自R&D Systems的ELISA試劑盒進行測量，測量時嚴格按照試劑盒說明書 所述進行。四、LLC-FO與LLC-F3蛋白組學比較(1)蛋白樣品準備LLC-FO與LLC-F3細胞等密度接種於55cm2的培養瓶中，置於37°C孵箱培養24h， 無血清培養12h後，收穫細胞。用預冷的PBS洗滌細胞3次。最後，將細胞團加入裂解液 (8M 尿素，4% CHAPS, 65mM DTT,40mM Tris-HCl，35 μ g/mL 蛋白酶抑制劑混合液)，在 4°C裂 解lh，13200rpm離心30min，取上清，用BCA方法測量好蛋白濃度，保存於_80°C。(2)雙向電泳將準備好的樣品等蛋白濃度上樣，上樣量為300yg。用長度為13cm的pH 3-10PharmaciaIPG 膠條，在電泳儀(Amersham Pharmacia Biotech)聚焦，聚焦完成後， 將膠條放於平衡液(50mM Tris-HCl，6M尿素，2% SDS，30%甘油和DTT，pH 8.8)平衡 3X 15min，將平衡好的膠條放在12. 5% SDS-PAGE電泳上方，用1 %瓊脂封好，30mA恆流電泳 至溴酚藍到底部，大約5h。(3)銀染取下膠，銀染後觀察兩種細胞系的蛋白組學上的差別。具體方法如下取下膠，用去離子水洗3次，每次5min;用固定液(40%甲醇，10%冰醋酸)固定Ih ；用去離子水洗3次，每次5min ；用5%戊二醛溶液固定增明Ih ；用去離子水洗3次，每次 5min ；放入銀染溶液(0. 02N NaOH, 0. 5%氨水，0. 4gAgN03)中，染色30min ；用去離子水洗3 次，每次5min ；放於顯影液(0.005%檸檬酸溶液，2%甲醛溶液)中，顯影IOmin ；用5% HAc 終止反應；用去離子水洗3次，每次5min ；用掃描儀完成掃描工作。五、LLC-FO與LLC-F3轉移能力的比較1. 5 X IO6細胞量的LLC-FO與等細胞量的LLC-F3尾靜脈注射C57BL/6J小鼠，記錄 小鼠的存活時間，死亡當天，解剖屍體查看肺轉移情況。實驗結果( 一 ) LLC-FO與LLC-F3的細胞形態觀察LLC_F0和LLC-F3在相同的培養調節下， LLC-FO較為分散，細胞之間較不易成團。兩種細胞均貼壁不緊密，容易消化(圖2)。( 二)培養上清中VEGF和PlGF表達量比較LLC_F0和LLC-F3在無血清條件下培 養24h，LLC-F3分泌到培養上清中的VEGF與PlGF的含量顯著比LLC-FO顯著高(圖3)。(三)LLC-FO與LLC-F3蛋白組學比較從LLC-FO和LLC-F3的雙向電泳圖譜可以 看出，大量的蛋白點是一致的，有某些蛋白點的表達量有顯著差異(圖4圓圈)，可以說明， LLC-FO與LLC-F3是同一來源的，在蛋白水平上大部分是一致的，但是它們又有明顯的區 別，可能就是這些區別造成了兩者行為上的差別。(四)LLC-FO與LLC-F3轉移能力的比較1)相同細胞量尾靜脈注射後，LLC-FO的生存曲線顯著比LLC-F3後延緩(圖5)， LLC-F3組小鼠平均存活時間為兩周，而LLC-FO組小鼠平均存活時間為三周，延長了一個星 期(圖6)。2)取不同的時間解剖小鼠，可以觀察到小鼠肺部被腫瘤細胞侵襲，形成轉移灶，轉 移灶發展成腫瘤的情況(圖7)。死亡後解剖屍體發現小鼠有嚴重的肺轉移和胸腔積血，說 明小鼠死於肺轉移。LLC-F3組小鼠存活時間短於LLC-FO組說明了 LLC-F3比LLC-FO轉移 性更高。因而我們獲得了比LLC-FO有更高轉移性的LLC-F3細胞系。
權利要求
一種自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系LLC F3，具有生物學特徵，還具備特殊的轉移表型。
2.根據權利要求1所述的自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系LLC-F3，其生物學特徵是1)能在體外長期生長和穩定傳代2)接觸性生長抑制喪失3)可無限繼代培養。
3.根據權利要求1所述的自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系LLC-F3，其特殊轉移表型病 理學特徵是C57BL/6J小鼠接種成瘤率和皮下接種轉移率為100%。
4.一種自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系的建立方法，其特徵在於用LLC-FO接種 C57BL/6J小鼠；確認轉移部位；篩選自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系；細胞體內成瘤。
5.根據權利要求4所述的一種自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系的建立方法，其特徵在 於取肺癌親本LLC-FO細胞懸液，用濃度為5X 105/0. ImL接種於C57BL/6J小鼠背側皮下， C57BL/6J小鼠由南京大學分子醫學研究所提供。
6.根據權利要求4所述的一種自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系的建立方法，其特徵在 於將C57BL/6J小鼠斷頸處死，對各個組織進行肉眼觀察，確立其轉移灶的部位為肺臟、肝 髒。
7.根據權利要求4所述的一種自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系的建立方法，獲得自發 高轉移傾向小鼠肺癌細胞系，其特徵在於取5 X IO5個體外培養的狀態良好的生長期LLC-FO 細胞，接種於C57BL/6J小鼠的背側皮下，正常飼養荷瘤小鼠；在接種後第18天，切除原位 瘤，繼續飼養小鼠；過3個星期後斷頸法處死小鼠，用75%的酒精消毒。於無菌環境中打開 胸腔，取出肺，肉眼可見許多轉移灶；用無血清的RPMI 1640培養液衝洗，儘量洗去血塊，後 用鑷子小心取出轉移瘤體於另一預加IOmL RPMI 1640培養液的培養皿中，剝去包膜並儘量 撕碎，過篩除去細胞團和間質成分。IOOOrpm離心5min，培養於含10%新生牛血清的RPMI 1640培養液中，靜置培養；原代培養每3天換液一次，去除已經漂浮的細胞和殘留的血細 胞；體外傳代3次後再次接種C57BL/6J小鼠。18天切除，3個星期後處死分離肺轉移灶，並 體外培養。這樣的循環3次，最後一次得到的細胞即為LLC-F3，大量擴增後備用。
8.根據權利要求4所述的一種自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系的建立方法，LLC-F3細 胞體內成瘤實驗，其特徵在於當LLC-F3細胞體外培養穩定後，將細胞再回注到C57BL/6J 小鼠皮下，方法同前，成瘤率達到100%，並且在C57BL/6J小鼠的肺臟和肝臟出現轉移灶。
9.一種自發高轉移傾向小鼠肺癌細胞系的用途，其特徵在於，用於篩選抗腫瘤轉移藥 物；或用於體外腫瘤轉移的研究。
全文摘要
本發明屬於動物細胞系領域。本發明採用小鼠肺癌LLC-F0細胞株作為源細胞，通過C57BL/6J體內篩選和體外培養相結合的方法，建立了具有自發性肺轉移表形的小鼠肺癌高轉移細胞系LLC-F3。所述的鼠肺癌自發高轉移傾向細胞亞系具有肺癌轉移率高且惡性程度高的特點，是一種理想的研究腫瘤轉移的模型，在揭示肺癌的轉移機制和抗轉移藥物的篩選的應用中將有著廣闊的前景。
文檔編號C12Q1/02GK101906400SQ200910032910
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月8日 優先權日2009年6月8日
發明者劉建寧, 張菁, 蘇藝晶 申請人:南京大學