一種水貂阿留申病毒的lamp檢測方法
2023-05-06 05:37:01
一種水貂阿留申病毒的lamp檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種水貂阿留申病毒的LAMP檢測方法，包括DNA模板的提取；LAMP反應引物的設計；LAMP反應；LAMP反應結果檢測,經試驗得知，特異性好、靈敏度高、時間快、不需要特殊儀器設備的優點。
【專利說明】—種水貂阿留申病毒的LAMP檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種動物疫病的檢測方法，具體地說，涉及一種水貂阿留申病 毒的LAMP檢測方法，屬於動物檢驗檢疫【技術領域】。
【背景技術】
[0002]水紹阿留申病(Aleutian disease, AD)是由水紹阿留申病毒(Aleutian diseaseparvovirus, ADV)侵害水紹引起的一種慢性、進行性傳染病,一直是危害著世界養紹業健康發展的最重要的疫病之一。該病幾乎存在於所有養貂的國家和地區，呈現世界分布性的特點。從發現AD以來世界各地所報導的與AD研究相關的文章中，我們也可從側面了解AD感染的全球化趨勢。就可查閱到的文獻來看，美洲的美國、加拿大、阿根廷等國家，歐州的丹麥、芬蘭、英國、西班牙、德國等國家，亞洲的中國、日本等國，均有該病的相關研究報導。
[0003]我國水貂的主要養殖區在山東、遼寧和黑龍江三地，現在國際上ADV的流行情況還沒有相關報導，國內根據聞喜軍等2006-2007年的初步調查，在全國送檢的221隻水貂病例中檢出水貂阿留申病貂22隻，佔剖檢總數的約10% ;送檢的阿留申病例以9-11月居多，說明其發病具有明顯的季節性。因為水貂阿留申病潛伏期長，阿留申病貂多不表現明顯的臨床症狀，故養殖戶可能會忽視對阿留申病貂的檢疫和淘汰，而且近年來我國毛皮動物市場的擴大，流通渠道增多，頻繁引種和倒種及其動物產品數量增加，但配套措施不夠健全，不同地區的飼養條件，管理水平參差不齊，一些飼養場疾病防治觀念淡薄，對水貂阿留申病重視不夠所以我國水貂阿留申病毒的感染率應高於10%。以上檢測結果是通過對流免疫電泳(CIEP)檢測得到，該法操作簡便，對試驗條件要求不高，有較高的特異性，但隨著技術的進步和檢測標準的提高， 該方法的結果判定的誤差較大，易散毒，耗時長的缺點已不能適應我國水貂養殖業發展的要求，所以，為了阻斷水貂阿留申病的傳播，淨化水貂養殖環境，亟待更加安全，高效的方法來代替。
[0004]水貂阿留申病毒的LAMP檢測方法的建立，必將為我國水貂阿留申病感染率的降低、經濟效益的提升帶來巨大的幫助。目前，還沒有見到對水貂阿留申病毒LAMP檢測方法的研究報導。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的問題是針對以上不足，提供一種水貂阿留申病毒的LAMP檢測方法，克服了現有檢測方法誤差大、易散毒、耗時長的缺陷，採用本發明的LAMP檢測方法，可以快速診斷水貂是否感染水貂阿留申病毒，具有檢測成本低，檢測效率高的優點。
[0006]LAMP,為 loop-mediated isothermal amplification 的簡稱，中文名稱為環介導等溫擴增。
[0007]為解決以上技術問題，本發明採用的技術方案為:一種水貂阿留申病毒的LAMP檢測方法，其特徵在於:所述LAMP檢測方法包括以下步驟:
a.DNA模板的提取；b.LAMP反應引物的設計；
c.LAMP 反應；
d.LAMP反應結果檢測。
[0008]一種優化方案，所述步驟a包括:利用病毒DNA提取純化試劑盒進行提取水貂阿留申病毒DNA，得樣本DNA。
[0009]進一步地，所述步驟b包括:選擇水貂阿留申病毒VP2基因作為靶基因；
根據LAMP引物設計軟體網址:http://primerexplorer.jp/e/,將待擴增的DNA分為六個獨立的區域，根據這六個區域分別設計LAMP反應所需的引物，所述引物包括內引物FIP和BIP、外引物F3和B3、環引物LB、LF，共設計五套LAMP引物擴增VP2基因。
[0010]進一步地，所述五套LAMP引物擴增VP2基因包括:
第一套為:
【權利要求】
1.一種水貂阿留申病毒的LAMP檢測方法，其特徵在於:所述LAMP檢測方法包括以下步驟: a.DNA模板的提取； b.LAMP反應引物的設計； c.LAMP 反應； d.LAMP反應檢測。
2.如權利要求1所述的LAMP檢測方法，其特徵在於:所述步驟a包括:利用病毒DNA提取純化試劑盒進行提取水貂阿留申病毒DNA，得樣本DNA。
3.如權利要求1所述的LAMP檢測方法，其特徵在於:所述步驟b包括:選擇水貂阿留申病毒VP2基因作為靶基因； 根據LAMP引物設計軟體網址:http://primerexplorer.jp/e/,將待擴增的DNA分為六個獨立的區域，根據這六個區域分別設計LAMP反應所需的引物，所述引物包括內引物FIP和BIP、外引物F3和B3、環引物LB、LF，共設計五套LAMP引物擴增VP2基因。
4.如權利要求 3所述的LAMP檢測方法，其特徵在於:所述五套LAMP引物擴增VP2基因包括: 第一套為:
ADV55-F3:CCAACCAAGGTAACGCAT
ADV55-B3:TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV55-FIP:GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTTCAACAATGACTTAACTGCG
ADV55-BIP:CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV55-LF:GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGA ； 第二套為:
ADV8-F3:GTTTGGTTACTTTAGAACAAGAG
ADV8-B3:TGCTCTCCAAGGAACAAAG
ADV8-FIP:TGCTTGGTAGATGCGTTACCTTTTTTATAGACAATGTAACCATAAAGACTG
ADV8-BIP:TAACTGCGTCGTTACAGGTTGCTTTTCCCAGTGTTTCTCCCAAC
ADV8-LB:ACAACATATTGCCATATACTCCAGC ； 第三套為:
ADV21-F3:GATAGACAATGTAACCATAAAGACT
ADV21-B3:TTGGTTTGGTTGCTCTCC
ADV21-FIP:CGACGCAGTTAAGTCATTGTTGATTTTGTAACAGAAACCAACCAAGGTA
ADV21-BIP:TACAGGTTGCTTTAGACACTAACAATTTTAAGGAACAAAGCCCAGTG
ADV21-LB: CATATACTCCAGCTGCGCCGTT ； 第四套為:
ADV37-F3:ACCATAAAGACTGTAACAGAAAC
ADV37-B3:TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV37-FIP:GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGATTTTTAACGCATCTACCAAGCA
ADV37-BIP:CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG ； 第五套為:ADV46-F3:AACCAAGGTAACGCATCT
ADV46-B3:TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV46-FIP:GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTACCAAGCAATTCAACAATGA
ADV46-BIP:CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV46-LF:AACCTGTAACGACGCAGTTAAG。
5.如權利要求1所述的LAMP檢測方法，其特徵在於:所述步驟c包括:根據環介導等溫擴增法FDR螢光檢測試劑盒配製26 μ I反應混合物。
6.如權利要求5所述的LAMP檢測方法，其特徵在於:所述反應混合物包括: 2X反應混合液，用量為12.5μ I ;
引物混合液:40 pmol FIP 和40 pmol BIP, 5 pmol F3 和 5 pmol B3,20 pmol LB和 20 pmolLF，用量為2.6μ I ; 雙蒸水，用量為6.9μ I ; 樣本DNA，用量為2μ I Bst DNA聚合酶，用量為Iy I ; 顯色液，I μ I ； 封閉劑，一 個。
7.如權利要求1所述的LAMP檢測方法，其特徵在於:所述步驟d包括濁度法檢測:採用實時濁度儀檢測，每隔6秒測定反應管的濁度並繪製成曲線來判斷反應的陰陽性。
8.如權利要求1或7所述的LAMP檢測方法，其特徵在於:所述步驟d包括顯色法檢測:基於鈣黃綠素顏色改變檢測，鈣黃綠素是一種金屬離子指示劑，根據反應液中鎂離子的變化而呈現出不同的顏色，陰性時為橙色，陽性時為綠色。
9.如權利要求1所述的LAMP檢測方法，其特徵在於:所述LAMP檢測方法包括步驟e:LAMP方法敏感性； 所述LAMP方法敏感性包括:以含VP2片段的質粒為檢測對象，定量後將總DNA進行10倍稀釋度稀釋，使得最終稀拷貝數為IO5拷貝/μ1、104拷貝/μ1、103拷貝/μ1、102拷貝/μL、IO1拷貝/μ1、10°拷貝/μL，並以雙蒸水作為陰性對照； 然後進行LAMP反應，分別採用濁度法和顯色法來檢測結果。
【文檔編號】C12Q1/68GK103993103SQ201410146568
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】田國寧, 張金玲, 孫軍, 趙晗, 韓亮, 吳偉, 田國華, 丁葵英 申請人:田國寧