烏靈膠囊標準指紋圖譜的建立方法和烏靈膠囊的鑑別方法

2023-05-06 05:11:16

專利名稱：：烏靈膠囊標準指紋圖譜的建立方法和烏靈膠囊的鑑別方法
技術領域：
：本發明涉及烏靈膠囊的鑑別，尤其涉及烏靈膠囊標準指紋圖譜的建立方法和烏靈膠囊的鑑別方法。背條技術烏靈菌粉是浙江佐力藥業股份有限公司利用現代生物發酵技術，從天然烏靈參中分離菌種，經過發酵而得的國家一類新藥，化學成分主要含有腺苷為主的核苷類物質、胺基酸、異黃酮、微量元素、維生素等營養物質。烏靈膠囊是純烏靈菌粉製劑，有補腎健腦、養心安神功效，臨床上用於神經衰弱的心腎不交證，症見心煩焦慮，失眠多夢，入睡困難，多夢驚恐，心悸，健忘，頭暈耳鳴等。烏靈膠囊為浙江佐力藥業股份有限公司獨家生產和享有品種，但隨著烏靈膠囊在臨床的廣泛應用，銷量逐年快速增長，市場上也出現一些假冒烏靈膠囊的產品，由於現行標準所測定的腺苷並非烏靈膠囊特有成分，建立一種在整體上更好控制烏靈膠囊質量並作為鑑別真偽指標的鑑別方法，具有重要意義。
發明內容為了建立一種在整體上更好控制烏靈膠囊質量並作為鑑別真偽指標的鑑別方法。本發明的一個目的是提供烏靈膠囊色譜分析供試溶液和供試溶液配置方法。本發明的第二個目的是提供烏靈膠囊的鑑別方法。為了實現上述的第一個目的，本發明採用了以下的技術方案-烏靈膠囊標準指紋圖譜的建立方法，該方法包括以下的步驟(1)取烏靈膠囊內容物，加入極性小的有機溶劑，加熱回流0.52小時，放冷，濾過，藥渣揮幹溶劑；(2)加甲醇或含水甲醇，稱重，加熱回流或超聲提取0.51小時，放冷，再稱重，加甲醇補足重量，濾過，以續濾液作為供試品溶液；(3)對照品溶液採用取腺苷對照品適量，加甲醇溶液溶解，製成含腺苷溶液，作為對照品溶液；(4)然後分別吸取對照品溶液及供試品溶液，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；(5)以腺苷峰為參照，計算各共有特徵峰的相對保留時間和相對峰面積，建立起標準指紋圖譜。作為優選，上述的有機溶劑選用石油醚、環己垸、正己垸中的任意一種。作為優選，上述的液相色譜條件為檢測波長為240260nm;流速0.6ml/min~0.8ml/min;色譜柱填充劑為十八烷基矽烷鍵合矽膠；流動相為甲醇一0.1%磷酸溶液，梯度洗脫。作為優選，上述的標準指紋圖譜的相對保留時間和峰面積比值如下各峰的相對保留時間為l號峰0.187±20%、2號峰0.468±20%、3號峰0.723±20%、5號峰2.198±20%、6號峰2.232±20%、7號峰2.437±20%，8號峰2.480±20%,參照峰4號峰，為腺苷峰；各峰的峰面積比值2號峰0.60-0.95,3號峰0.480.90;參照峰4號峰，為腺苷峰。為了實現上述的第二個目的，本發明採用了以下的技術方案-烏靈膠囊的鑑別方法，採用上述的任意一種方法建立的標準指紋圖譜，所測定的供試品指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度大於0.9。本發明的優點如下(1)因ds色譜柱對油脂性物質有強保留，易引起色譜柱堵塞，柱效下降，縮短色譜柱使用壽命，本發明供試品溶液是採用石油醚等低極性溶劑脫脂，以保護色譜柱。(2)本發明的供試品溶液是用甲醇或含水甲醇超聲或加熱回流提取，兼顧其水溶性及脂溶性兩部分的化學成分，具有簡便、穩定、精密度高以及重現性好等優點，彌補了烏靈菌粉現行質量標準中只涉及其中單一成分的缺點，使對產品質量的控制更加全面、真實、科學。(3)本發明釆用高效液相色譜法進行檢測，檢測波長為260nm,研究證明，供試品溶液在該波長處色譜峰最多，各峰之間分離度也較好，所以該條件下測定的指紋圖譜更能全面反映烏靈膠囊所含的化學成分。圖l為腺苷對照品圖譜。圖2為烏靈膠囊指紋圖譜。具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明，下述實施僅用於說明本發明而並非對本發明的限制。1儀器與試藥1.1儀器戴安高效液相色譜儀；UVD-340U檢測器；變色龍工作站。1.2試藥腺苷對照品中國藥品生物製品檢定所提供；甲醇色譜純；水重蒸水;其它試劑為分析純。烏靈膠囊浙江佐力藥業股份有限公司生產。2色譜條件色譜柱十八烷基鍵合矽膠(4.6X50mm，5um)kromasil;檢測波長260nm;流動相為甲醇—0.1%磷酸溶液系統梯度洗脫；流速0.6ml/mim;柱溫25°C;進樣量10ul。理論板數以腺苷峰計算，應不低於4000。圖譜記錄時間為95分鐘。梯度洗脫程序tableseeoriginaldocumentpage73指紋圖譜測定3.1烏靈膠囊指紋圖譜的確立供試品溶液的製備取烏靈膠囊內容物l.OOg，加石油醚10ml加熱回流1小時，放冷，濾過，藥渣揮幹石油醚，精密加甲醇25ml，精密稱重，加熱回流提取1小時，放冷，再稱重，加甲醇補足重量，濾過，續濾液作為供試品溶液。對照品溶液的製備取腺苷對照品適量，加10%甲醇溶液溶解，製成每lml含腺苷20ug的溶液，作為對照品溶液。參照物選用腺苷為參照物(S)。測定精密吸取供試品溶液及對照品溶液10Ul，分別注入高效液相色譜儀，按照液相色譜法測定，以參照物的色譜峰相對保留時間和相對峰面積為1，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，即得到烏靈膠囊標準指紋圖譜。3.2共有峰的確定通過10批烏靈膠囊指紋圖譜的測定，比較其色譜圖，確定共有峰8個，以4號峰(腺苷峰)為參照物，相對峰面積超過0.5的共有峰為2號峰(RT0.468)和3號峰(RT0.723),其餘均小於0.5。10批烏靈膠囊共有峰相對保留時間和相對峰面積統計結果見表3和表4。表3IO批烏靈膠囊指紋圖譜相對保留時間統計結果tableseeoriginaldocumentpage8表410批烏靈膠囊指紋圖譜相對峰面積統計結果tableseeoriginaldocumentpage83.3指紋圖譜精密度考察按照指紋圖譜精密度考察要求，以l批烏靈膠囊為供試品，連續進樣5次，分別對共有峰相對保留時間及規定的共有峰(有規定的共有峰即為與參照峰相比，相對峰面積超過0.5的指紋峰)的相對峰面積進行統計，RSDQ/。不超過3M。3.3指紋圖譜重現性考察以1批烏靈膠囊為供試品(N:5)，按照指紋圖譜重現性規定方法操作，分別對共有峰相對保留時間及規定的共有峰的相對峰面積進行統計，RSD。/。不超過3%。3.3指紋圖譜穩定性試驗按照指紋圖譜穩定性測定方法操作，以l批烏靈膠囊為供試品，連續進樣5次，考察24小時溶液穩定，分別對共有峰相對保留時間及規定的共有峰的峰面積進行統計，RSDy。不超過3Q/。。供試品24小時穩定。以上試驗結果表明，該測定方法穩定可靠，可作為控制烏靈膠囊質量的指標之一，並可作為鑑別烏靈膠囊真偽的鑑別方法。權利要求1.烏靈膠囊標準指紋圖譜的建立方法，其特徵在於該方法包括以下的步驟(1)取烏靈膠囊內容物，加入極性小的有機溶劑，加熱回流0.5～2小時，放冷，濾過，藥渣揮幹溶劑；(2)加甲醇或含水甲醇，稱重，加熱回流或超聲提取0.5～1小時，放冷，再稱重，加甲醇補足重量，濾過，以續濾液作為供試品溶液；(3)對照品溶液採用取腺苷對照品適量，加甲醇溶液溶解，製成含腺苷溶液，作為對照品溶液；(4)吸取上述對照品溶液及供試品溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；(5)以腺苷峰為參照，計算各共有特徵峰的相對保留時間和相對峰面積，建立起標準指紋圖譜。2.根據權利要求1所述的烏靈膠囊標準指紋圖譜的建立方法，其特徵在於有機溶劑選用石油醚、環己烷、正己烷中的任意一種。3.根據權利要求1所述的烏靈膠囊標準指紋圖譜的建立方法，其特徵在於液相色譜條件為檢測波長為240~260證；流速0.6ml/min~0.8ml/min;色譜柱填充劑為十八垸基矽烷鍵合矽膠；流動相為甲醇一0.1%磷酸溶液，梯度洗脫。4.根據權利要求3所述的烏靈膠囊標準指紋圖譜的建立方法，其特徵在於標準指紋圖譜的相對保留時間和峰面積比值如下各峰的相對保留時間為l號峰:0.187±20%、2號峰:0.468±20%、3號峰0.723±20%、5號峰2.198±20%、6號峰2.232±20%、7號峰2.437±20%，8號峰2.480±20%，參照峰4號峰，為腺苷峰；各峰的峰面積比值2號峰0.60-0.95，3號峰0.48-0.90;參照峰4號峰，為腺苷峰。5.烏靈膠囊的鑑別方法，其特徵在於採用如權利要求14任意一項權利要求的方法建立的標準指紋圖譜，所測定的供試品指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度大於0.9。全文摘要本發明涉及烏靈膠囊的鑑別，尤其涉及烏靈膠囊標準指紋圖譜的建立方法和烏靈膠囊的鑑別方法。烏靈膠囊標準指紋圖譜的建立方法，該方法包括供試品溶液的製備；對照品溶液的製備；然後分別吸取對照品溶液及供試品溶液，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；以腺苷峰為參照，計算各共有特徵峰的相對保留時間和相對峰面積，建立起標準指紋圖譜。本發明另外公開了採用上述標準指紋圖譜的烏靈膠囊的鑑別方法。本發明方法簡便、穩定、精密度高、重現性好，整體上更好的控制烏靈菌粉和烏靈膠囊的質量，可作為烏靈膠囊質量控制以及鑑別真偽的指標之一。文檔編號G01N30/86GK101387620SQ20081006272公開日2009年3月18日申請日期2008年7月1日優先權日2008年7月1日發明者俞有強,朱方劍,羅豔萍,建陳,陳文祥申請人:浙江佐力藥業股份有限公司