通過施加特異性和選擇性電場和電磁場調控活細胞中成纖維細胞生長因子-2(fgf-2)基...的製作方法

2023-05-06 22:21:31 2

專利名稱：通過施加特異性和選擇性電場和電磁場調控活細胞中成纖維細胞生長因子-2(fgf-2)基 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過施加電場和電磁場上調轉化活細胞中的成纖維細胞生長因 子-2(FGF-2)基因表達的方法，所述電場和電磁場通過向線圈、電極或其他場產生裝置施 加特異性和選擇性電和電磁信號來產生，所述方法用於治療受傷或患病的組織和骨骼，本 發明還涉及用於產生這種信號的裝置。
背景技術：
據信存在於各種不同生物組織和細胞中的生物電相互作用和活性，是了解得最少 的生理學過程之一。但是最近，在某些組織和細胞的生長和修複方面對這些相互作用和活 性進行了大量研究。具體來說，有許多研究涉及電場和電磁場的刺激及其對骨骼、軟骨的生 長和修復和各種不同生長因子的影響。研究人員相信，這些研究可能可用於為各種不同的 醫學難題開發新的治療方法。成纖維細胞生長因子-2(FGF_2)是一種生長因子，其對於促進骨骼的形成和維持 是重要的，從前成骨細胞的增殖到前成骨細胞分化成成熟的成骨細胞，再到成骨細胞在其 整個生命期中的維持。已經顯示，FGF-2在整體動物中對骨形成具有陽性同化效應，並在 骨質疏鬆症的實驗模型中減少骨喪失(Fromigue，0.，Modrowski，D.和Marie，P. J =Curr. Pharmaceut. Design, 10 :2593_2603，2004.)。FGF-2 (也稱為基本成纖維細胞生長因子或 bFGF)刺激骨形成，減少破骨細胞表面，並在切除卵巢的大鼠的脛骨骨髓腔中誘導新的骨針 (Liang H.，Pun S.和 ffronski, T. J. =Endocrinology, 140 :5780_88，1999)。FGF-2 通過誘 導骨襯細胞(bone-lining cell)轉化成成骨細胞，在切除卵巢的大鼠中對新骨形成具有強 烈刺激效應(Power, R. A. , Iwaniec, U. Τ. , Magee, K. Α. , Mitova-Caneva, N. G.禾Π Wronski, Τ. J.骨質疏鬆症Int.，15 :716-23，2004)。FGF-2在低更新骨質疏鬆症的鼠類模型中通 過刺激骨祖細胞增殖和分化成成骨細胞而增加骨量的峰值，從而增強了皮質內骨的重塑 (Nagai，H.，Tsukuda，H.和 Mayahara，H. J. Vet. Med. Sci.，61 :869_75，1999)。在另一項研 究中，FGF-2在小動物骨質疏鬆症模型中增加了骨的機械性質(最大失效受力和功)並增加 了骨小梁的數量、厚度和連接點(Yao, W.，Hadi, T.，Jiang, Y.，Lotz, J.，ffronski, T. J.和 Lane, N. Ε. =Osteoporosis Int.，16 1939-47，2005)。因此，FGF-2的上調可用於治療通常稱為骨質疏鬆症的疾病，在該病中，骨失去礦 物質並變得異常稀薄。骨含有細胞和基質的有機成分以及無機或礦物成分。細胞和基質包含有膠原纖維的框架，其中浸滲有礦物成分磷酸鈣(85%)和碳酸鈣(10%)，它們賦予了骨 骼以剛性。在健康骨骼中，骨形成和骨吸收(bone resorption)處於平衡。在骨質疏鬆症 中，骨吸收超過骨形成，導致骨削弱和可能的椎骨體斷裂和塌陷。儘管通常認為骨質疏鬆症 使老年人深受其害，但某些類型的骨質疏鬆症可能影響所有年齡的、其骨骼不受機能性應 力支配的人。在這些情況下，患者可能在較長期的固定過程中經歷皮質骨和松質骨的顯著 喪失。老年患者已知是由於在骨折後固定時的不使用而經歷骨損失，這樣的骨損失最終可 能在已經骨質疏鬆的骨骼中導致二次骨折。骨密度降低可能不僅導致椎骨塌陷，而且導致 髖骨、小臂、腕骨、踝骨的骨折以及造成喪失活動能力的疼痛。用於這種疾病的替代性非外 科手術療法是有需求的。自從在1979年被食品和藥品管理局(Food and Drug Administration)批准以 來，脈衝電磁場(PEMF)和電容耦合(CC)已被廣泛用於治療不癒合性骨折(骨不連合)和 骨癒合中的相關問題。進行這種形式的療法試驗的最初基礎是觀察到作用於骨上的物理應 力導致出現小電流，它們與機械應力一起，被認為是將物理應力轉變成促進骨形成的信號 的基本機制。與在骨不連合治療中成功的直接電場刺激一起，也發現使用PEMF和電容耦合 (其中將電極放置在治療區中的皮膚上)的非侵入性技術是有效的。PEMF在高導電性細胞 外流體中產生小的誘導電流(法拉第電流)，而電容耦合直接在組織中產生電流；因此PEMF 和CC 二者都模擬內源性電流。最初被認為是由於在骨骼中晶體表面處發生的現象的內源性電流，已被顯示主要 是由於含有電解質的流體在含有具有固定負電荷的有機成分的骨的通道中運動，產生了所 謂的「流動電勢」。對骨骼中電現象的研究已經證實了當骨骼被機械壓縮時出現了機械-電 轉換機制，引起流體和電解質在骨細胞表面上的固定負電荷的表面上運動，從而產生了流 動電勢。這些電勢用於骨中的目的，並與機械應力一起產生信號轉換，所述信號轉換能夠刺 激骨細胞合成可鈣化基質，從而刺激骨形成。直流電、電容耦合和PEMF的主要應用是在矯形外科學中治癒骨不連合性骨 折(Brighton 等，J. Bone Joint Surg. 63 2-13,1981 ；Brighton 禾口 Pollack，J. Bone Joint Surg. 67 577-585,1985 ；Bassett 等，Crit. Rev. Biomed. Eng. 17 451-529,1989 ； Bassett等，J. Am. Med. Assoc. 247 :623_628，1982)。在成年人髖骨無血管壞死和兒童 Legg-Perthes，s 疾病中已報導了臨床反應(Bassett 等，Clin. Orthop. 246 172-176，1989 ； Aaron 等，Clin. Orthop. 249 209-218,1989 ；Harrison 等，J. Pediatr. Orthop. 4 579-584, 1984)。也已顯示，PEMF (Mooney，Spine 15 :708_712，1990)和電容耦合(Goodwin, Brighton 等，Spine 24:1349-1356,1999)能夠顯著增加腰椎融合的成功率。還有增加外周神經再生 和功能以及促進血管形成的報導(Bassett，Bioessays 6 :36_42，1987)。患有持久性肩周 炎(rotator cuff tendonitis)、對甾體注射和其他常規措施耐受的患者，與安慰劑治療的 患者相比顯示出顯著的獲益(Binder等，Lancet 695-698，1984)。最後，Brighton等已經 在大鼠中顯示了適合的電容耦合電場防止和逆轉腰椎中椎骨骨質疏鬆症的能力(Brighton 等，J. Orthop. Res. 6 676-684,1988 ；Brighton 等，J. Bone Joint Surg. 71 228-236, 1989)。本領域中的研究集中於刺激對組織和細胞所具有的效應。例如，已經推測，直流 電不穿透細胞膜，並可以通過細胞外基質分化來實現控制(GrodzinSky，Crit. Rev. Biomed.Eng. 9 133-199，1983)。與直流電相反，已經報導PEMF能夠穿透細胞膜，並且也刺激它們或 直接影響細胞內細胞器。PEMF對細胞外基質和體內軟骨內骨化的影響的研究，發現了軟骨 分子的增加的合成和骨小梁的成熟(Aaron等，J. Bone Miner. Res. 4 227-233，1989)。更近 些時候，Lorich等(Clin. Orthop. Related Res. 350 :246_256，1998)和Brighton等(J. Bone Joint Surg. 83-A，1514-1523，2001)報導了電容耦合電信號的信號轉換通過電壓門控鈣通 道進行，而PEMF或組合電磁場的信號轉換通過鈣從細胞內儲存的釋放來進行。在所有三種 類型的電刺激中，存在著胞質鈣的增加以及隨後活化的(細胞骨架)鈣調蛋白的增加。本發明人在1996年報導了循環雙軸0. 17%機械應變在Cooper培養皿中培養 的 MC3T3-E1 骨細胞中產生了 TGF-β 工 mRNA 的顯著增加(Brighton 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 229 =449-453,1996)。隨後在1997年進行了幾項重要研究。在一項研究中， 報導了同樣的循環雙軸0. 17%機械應變在類似的骨細胞中產生了 PDGF-A mRNA的顯著增 加(Brighton 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 43 :339_346，1997)。也已報導，60kHz 的20mV/cm電容耦合電場在Cooper培養皿中的類似骨細胞中產生了 TGF-β i的顯著增加 (Brighton 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 237 -.225-229,1997)。還報導了軟骨細胞基 質基因和蛋白能夠被特異性和選擇性的電場上調(Wang，W.，Wang，Ζ.，Zhang, G.，Clark, C. C.和 Brighton,C. Τ.，Clin. Orthp. and Related Res.，427S :S163_173，2004 ；Brighton, C. T.，Wang, W.禾口 Clark，CC, Biochem. Biophys. Res. Commun.，342 :556_561，2006)。此夕卜， 已經顯示骨形態發生蛋白(BMP)的基因表達也能夠被特異性和選擇性的電場上調，該電場 在各種不同的信號特點方面與來自對關節軟骨特異性和選擇性的信號的電場不同(Wang， Ζ. ，Clark, C. C.禾口 Brighton，C. Τ. ，J. Bone Joint Surg. ,88 :1053—1065，2006)。在上面引用的題為「通過施加特異性和選擇性的電和電磁信號調控基 因」 (Regulation of Genes Via Application of Specific and Selective Electrical and Electromagnetic Signals)的專利申請中，公開了用於確定特異性和選擇性的電和電 磁信號以用於產生場的方法，用於調控患病或受傷組織的靶基因。本發明建立在其中描述 的技術之上，描述了通過施加由特異性和選擇性電和電磁信號產生的場，來調控一個靶基 因家族的表達、即成纖維細胞生長因子-2 (FGF-2)的基因表達的方法，用於治療骨骼疾病 和損傷，包括骨質疏鬆症、骨質減少、骨壞死、骨缺損、新骨折、骨折風險、骨折遲緩癒合、骨 不連合、骨缺損，以及作為脊柱融合中的輔助手段。發明簡述本發明涉及通過施加特異性和選擇性電場和/或電磁場來調控(例如)骨細胞中 成纖維細胞生長因子_2(FGF-2)基因的表達，所述電場和/或電磁場通過向目標骨或組織 細胞附近的線圈、電極或其他場產生裝置施加特異性和選擇性信號來產生。通過對信號持 續時間、幅度、頻率和佔空因數執行連續劑量響應曲線，在其中測量得到的電場的效能，發 現了用於在骨細胞中上調FGF-2mRNA的最適信號。最適信號產生了電容耦合電場，其幅度 為20-40mV/cm，持續時間為24小時，頻率為60kHz，佔空因數為50-100%。具體來說，本發 明涉及通過施加由這樣的信號產生的場來上調骨細胞中FGF-2基因的表達。在本發明的示例性實施方案中，提供了使用電容耦合電場、電磁場或複合場特異 性和選擇性上調基因表達(正如通過FGF-2mRNA所測量的)的方法。使用電容耦合電場治 療了骨質疏鬆症、骨質減少、骨壞死、新骨折、骨折風險、骨折遲緩癒合、骨不連合性骨折、骨缺損，以及作為脊柱融合中的輔助手段等，所述電容耦合電場為大約20-40mV/cm，場持續時 間為大約24小時，頻率為60kHz，佔空因數為50% -100%，具有正弦波形態，所述電場導致 FGF-2的表達被上調。根據本發明的方法，「特異性和選擇性」信號是具有上調FGF-2基因 表達的預定幅度、持續時間、佔空因數、頻率和波形特徵的信號(特異性)。這允許人們選擇 不同的信號上調FGF-2基因表達，以便獲得給定的生物學或治療響應(選擇性)。本發明還 涉及利用本文描述的方法產生特異性和選擇性信號的裝置，所述信號產生了上調FGF-2基 因表達的電場和/或電磁場。在相關方面，本發明涉及方法和裝置，所述方法和裝置用於治療骨質疏鬆症、骨質 減少、骨壞死、新骨折、骨折風險、骨折遲緩癒合、骨不連合性骨折、骨缺損，以及作為脊柱融 合和治療一種或多種上述病症的其他療法中的輔助手段。本發明的方法還包括通過在方法 學上改變已知增加或懷疑能增加細胞的FGF-2產生的起始信號的持續時間，來確定FGF-2 基因表達的「特異性和選擇性」信號的方法。在發現最適持續時間後，對於通過FGF-2基因 表達所測定的最適持續時間，改變信號的幅度。在保持其他信號特徵恆定的同時，在方法 學上採用同樣的劑量響應方式改變佔空因數、頻率和波形。重複該過程，直到確定了產生 FGF-2表達的最大增加的最適信號。本發明的這些以及其他方面，將在下面本發明的詳細描述中闡明。


圖1是當骨細胞暴露於各種不同的電容耦合電場幅度時，FGF-2的mRNA表達的圖 示。正如所示，使用20mV/cm到40mV/cm的信號時發生了 FGF_2mRNA的最大表達。圖2是當骨細胞暴露於幅度為20mV/cm的電容耦合電場不同的持續時間時，FGF-2 的mRNA表達的圖示。正如所示，使用24小時的持續時間時發生了 FGF_2mRNA的最大表達。圖3是當骨細胞暴露於場幅度為20mV/cm、信號持續時間為24小時的不同電 容耦合電場頻率時，FGF-2的mRNA表達的圖示。正如所示，使用60kHz的頻率時發生了 FGF-2mRNA的最大表達。圖4是當骨細胞暴露於頻率為60kHz、場幅度為20mV/cm、信號持續時間為24小時 的不同電容耦合電場佔空因數時，FGF-2的mRNA表達的圖示。正如所示，使用具有正弦波 形態的50%到100%的佔空因數時發生了 FGF-2mRNA的最大表達。圖5是當骨細胞暴露於50%佔空因數、具有10到40mV/cm的場幅度、60kHz的頻率 和正弦波形態的電容耦合電場中24小時時，FGF-2蛋白產生的圖示。如圖所示，使用20mV/ cm到40mV/cm的場時FGF-2蛋白增加的量最大。圖6是圖解，說明了按照本發明的示例性應用，用於治療例如膝蓋的骨質疏鬆症 的裝置。說明件實施方案的詳細描述下面將參考圖1-6對本發明進行詳細描述。本領域技術人員將會認識到，在本文 中參考這些圖給出的描述僅僅是出於示例的目的，不打算以任何方式限制本發明的範圍。 所有與發明的範圍有關的問題可以通過參考隨附的權利要求書來解決。本發明是基於下述發現，即某些基因的表達能夠通過施加場來調控，所述場由施 加於基因附近的線圈、電極或其他場產生裝置上的特異性和選擇性電和/或電磁信號所產生。換句話說，本發明人已經發現，存在有特異性電和/或電磁信號，所述信號產生調控骨、 軟骨和其他組織細胞中的每種基因的場，並且這些特異性信號能夠特異性和選擇性調控這 些細胞中的基因。具體來說，根據本發明，通過施加由向場產生裝置施加特異性和選擇性電 和/或電磁信號而產生的場，可以調控控制組織或細胞的生長、維持、修復和變性或退化的 基因表達，從而產生有益的臨床效果。這些發現可用於開發靶向某些醫學病症的治療方法， 所述病症包括骨質疏鬆症、骨質減少、骨壞死、新骨折、骨折風險、骨折遲緩癒合、骨不連合、 骨缺損，脊柱融合，以及作為任一種或多種上述病症的治療中的輔助手段。本文中使用的詞組「信號」用於指稱由裝置輸出的各種不同的信號，包括機械信 號、超聲信號、電磁信號和電信號。應該理解，本文中使用的術語「場」是指靶組織中的電場， 不論它是複合場或脈衝電磁場，還是由直流電、電容耦合或電感耦合產生的。詞組「遠程」用於表示從遠處作用、被作用或控制。「遠程」調控是指從遠處控制基 因的表達。「遠程」提供是指從遠處提供。例如，從遠程的源提供特異性和選擇性信號，可以 是指從遠離組織或細胞的源或身體外部或以外的源提供信號。詞組「特異性和選擇性」信號是指信號產生的電場具有預定的幅度、持續時間、佔 空因數、頻率和波形特徵，所述特徵上調或下調靶基因或靶功能互補基因(特異性)。這允 許人們選擇不同的「特異性和選擇性」信號來上調或下調各種不同基因的表達，以便獲得給 定的生物學或治療響應(選擇性)。術語「調控」是指控制基因的表達。調控被理解為包括上調和下調。上調是指增 加基因的表達，而下調是指抑制或阻止基因的表達。「功能互補的」是指兩個或多個基因的表達在給定細胞或組織中是互補的或協同 的。「組織」是指形成患者的結構材料之一的細胞與其細胞外物質的集合體。本文中使 用的術語「組織」打算包括身體的任何組織，包括肌肉和器官組織、腫瘤組織以及骨或軟骨 組織。此外，本文中使用的術語「組織」也可以是指單個細胞。「患者」是指動物，優選為哺乳動物，更優選為人類。本發明提供了靶向某些組織、細胞或疾病的治療方法和裝置。具體來說，在受傷或 患病組織或細胞中與修復過程相關的基因表達，可以通過施加由電信號產生的場來調控， 所述電信號對於靶組織或細胞中待調控的基因是特異性和選擇性的。可以通過施加對每個 基因或每組互補基因特異性和選擇性的信號來上調或下調基因的表達，以便產生有益的臨 床效果。例如，特定的特異性和選擇性信號可以產生上調某種目標基因表達的電場，而同樣 的或另一種特定的特異性和選擇性信號可以產生下調某種不需要的基因表達的電場。某種 基因可以被一種特定的特異性和選擇性信號所產生的場上調，並被另一種特異性和選擇性 信號所產生的場下調。本領域技術人員將會認識到，通過調控那些控制組織的生長、維持、 修復和變性或退化的基因，可以定向治療某些患病或受傷的組織。本發明的方法和裝置是基於鑑定產生對於與某些被靶向的患病或受傷組織相關 的基因表達來說是特異性和選擇性的場的信號。例如，通過改變施加於場產生裝置的信號 的頻率、幅度、波形或佔空因數，以各種不同形式施加的電場(例如電容耦合、電感耦合或 複合場)能夠特異性和選擇性調控患者身體中靶組織或細胞中的基因表達，所述場產生裝 置用於產生對於每個所選基因施加的場。暴露於電場的持續時間也能影響電場特異性和選擇性調控患者體內靶組織或細胞中的基因表達的能力。特異性和選擇性信號可以產生系統 性施加到每個基因的電場，直到發現對基因表達提供所需效應的頻率、幅度、波形、佔空因 數和持續時間的適當組合。應該理解，因為用於某種基因表達的電場的特異性和選擇性能夠受到幾種因素的 影響，因此可以定向治療各種不同的患病或受傷組織或疾病狀態。具體來說，從具有適合的 頻率、幅度、波形和/或佔空因數的電信號產生的電場，對於某些基因的表達可以是特異性 和選擇性的，因此提供了定向治療。時間因素(例如暴露於電場的持續時間)也能影響電場 對特定基因表達的特異性和選擇性。通過以特定的持續時間施加電場，基因表達的調控可 能更加有效(或成為可能)。因此，本領域技術人員將會理解，本發明提供了改變產生電場 的電信號施加的頻率、幅度、波形、佔空因數和/或持續時間，直到發現對某些基因表達來 說是特異性和選擇性的電場，以便提供定向於各種不同的患病或受傷組織或疾病的治療。因此，本發明能夠提供定向治療，因為通過以適合的持續時間施加由適合頻率、幅 度、波形/或佔空因數的特異性和選擇性信號產生的電場，有可能調控與特定患病或受傷 組織相關的某些基因的表達。因此，可以影響產生電場的信號的特異性和選擇性以調控某 些基因的表達，以便對某些患病或受傷組織或疾病狀態進行定向治療。具體來說，本發明提 供了對骨質疏鬆症、骨質減少、骨壞死、新骨折、骨折風險、骨不連合、骨缺損，脊柱融合的定 向治療，以及作為一種或任何上述病症的治療中的輔助手段。本發明的裝置能夠向場產生裝置施加特異性和選擇性信號，用於產生直接施加於 患者的患病或受傷組織和/或皮膚上的特異性和選擇性場。本發明的裝置也可以提供特異 性和選擇性場的遠程施加(例如在遠離患病或受傷組織處施加場，但其還是在靶細胞內產 生了目標效應)，儘管將認識到電容耦合裝置必須接觸對象的皮膚。在電容耦合的情況下， 本發明的裝置可以包含用於將電極附著於患者身體上受傷或患病組織附近的機構。例如， 自粘附導電電極可以附著於患者斷骨兩側的皮膚上。如圖6中所示，本發明的裝置10可以 包括用於將裝置附著於患者身體上的自粘附電極12。例如，本發明的裝置10可以包括與動 力單元14相連的電極，其在反面上具有VELCR0 貼片16，以便動力單元14能夠附著於固定 在患者的石膏周圍的VELCR0 帶上(未顯示)。在電感耦合情況下，本發明的裝置可以包括 與動力單元相連的線圈以代替電極。自粘附條狀電極也可以附著於患者的背部，使電極對 的每個電極與脊柱平行排列，電極對的一根電極縱向放置在脊柱一側，電極對的另一根電 極縱向放置在脊柱的相反一側。在這種情況下，VELCR0 貼片可以是患者穿著的衣服的一 部分。本發明的裝置10可以以各種不同的方式使用。裝置10可以是便攜的，或可以暫 時或永久地附著於患者的身體。本發明的裝置10優選為非侵入性的。例如，本發明的裝置 10可以通過施用適合於與患者皮膚接觸的電極而施加到患者皮膚上，用於施加由預定的特 異性和選擇性電信號所產生的電場。這樣的信號也可以通過線圈施加，隨時間變化的電流 流過其中，從而產生了穿透組織並在靶組織中產生特異性和選擇性電場的特異性和選擇性 電磁場。例如，線圈可以包含在患者的衣服中，並放置在患者的脊柱和/或髖骨附近，正如 在美國專利No. 7，158,835中描述的。本發明的裝置10也可能能夠植入到患者中，包括植 入到患者皮膚下。本領域技術人員將會理解，本發明的裝置可以以各種不同的形式提供，包括具有編程的多路可切換的特異性和選擇性信號的電容耦合動力單元，所述信號用於施加到與具 有可切換的多路特異性和選擇性信號的動力單元相連的一對或多對電極、電磁線圈或螺線 管上，以及具有電源、用於產生特異性和選擇性信號的超聲激發器。總的來說，裝置的優選 性是基於患者的接受性和患者的順從性。目前在本技術領域中可用的最小、最便攜的裝置 是電容耦合裝置；但是，具有極端敏感皮膚的患者可能優選使用電感耦合裝置。另一方面， 超聲裝置需要患者最大的合作，但是可以被某些患者理想地使用。
實施例本發明在下述實施例中得到證實，這些實施例是出於說明的目的，不打算對本發 明的範圍進行限制。材料與方法將MC3T3-E1骨細胞(5X IO5個細胞/cm2)鋪於具體修改的Cooper培養皿上。將 細胞生長7天，在即將開始實驗條件之前更換培養基。在這些研究過程中，實驗細胞培養物 經受了 60kHz電容耦合正弦波信號，其峰峰之間的輸出為44. 81V。這在培養皿中的培養基 中產生的計算場強為20mV/cm，電流密度為300 μ A/cm2。除了電極沒有與函數發生器相連 之外，對照細胞培養物的培養皿與被刺激的培養皿相同。在實驗結束時，使用TRIzoI按照製造商的說明書分離總RNA，使用SuperScript II反轉錄酶進行反轉錄(RT)。在實時RT-PCR技術中使用的寡核苷酸引物選自已發表的 cDNA序列，或使用Primer Express軟體程序來設計。RT-PCR產物的定量實時分析使用ABI Prism 7000序列檢測系統來進行。如下所述系統地發現了用於尤其是FGF-2基因的所需上調的最適信號。使用已知 導致產生增加(或甚至僅僅是懷疑增加)給定蛋白的細胞產生的電場的電信號作為起始信 號，用於確定在靶組織中產生電場、用於該蛋白的基因表達(mRNA)的具體信號。在保持所 有其他信號特徵恆定(持續時間、佔空因數、頻率和波形)的同時，首先通過改變信號的幅 度執行劑量響應曲線(圖1)。這確定了用於該蛋白基因表達的起始信號的最適幅度。然後 執行第二個劑量響應曲線，這次改變靶組織中電場的持續時間(單位為mV/cm)，同時保持 最適幅度和其他信號特徵恆定(圖2)。執行第三個劑量響應曲線，這次改變信號頻率，同時 保持前面發現的最適幅度和最適持續時間恆定(圖3)。將佔空因數從100% (恆定)改變 到10%或以下，同時保持前面發現的最適幅度、持續時間和頻率恆定，執行了第四個劑量響 應曲線(圖4)。通過該方法，確定了用於產生FGF-2基因表達的最大增加的最適信號。當 然，正如圖所顯示的，其他信號也誘導了 FGF-2基因表達的增加；但是，這樣的信號是不太 優選的，因為它們沒有誘導鑑定到的優化響應。第五個實驗使用連續的50%佔空因數來進行(電容耦合，60kHz，正弦波)，比較了 靶組織中10mV/cm場與20mV/cm場與40mV/cm場的TOF-2蛋白的產生。正如所顯示的，在 20mV/cm和40mV/cm場中FGF-2蛋白顯著增加，但是在10mV/cm場中沒有顯著增加(圖5)。本發明清楚地顯示了在實施例中描述的最適電場能夠非常顯著地上調 FGF-2mRNA，因此在骨質疏鬆症、骨質減少、骨壞死、新骨折、骨折風險、骨不連合、骨缺損、脊 柱融合中，以及作為上述一種或任何病症的治療中的輔助手段，增加了骨形成。本領域技術 人員將會認識到，適合的電場，儘管如本文所述是電容耦合的，但使用電感耦合或所有產生等同和幾乎等同的電場特徵的電磁系統時，也同樣有效。本領域技術人員還將認識到，通過 更多的實驗、使用更多的數據點(例如佔空因數為100士3%，為時30士3分鐘)，可以發現 更加獨特的信號特徵，但在給予本文的教導後，每種信號特徵中這種相對小的改變據信在 本領域技術人員的技術水平之內。 本領域技術人員還將認識到，在本發明的範圍內可以對本發明進行大量的其他修 改。例如，本文描述的最適場可以通過兩個或多個適合的表面電極施加到任何骨骼，這些電 極成對或成條，併入在支架、包紮物或石膏中，並利用電容耦合供電。此外，本文描述的最適 場可以通過線圈或螺線管施加到任何骨骼，所述線圈或螺線管併入支架、包紮物或石膏模 子中，並利用電感耦合供電。因此，本發明的範圍不打算限於上面描述的優選實施方案，而 是只受隨附的權利要求書的限制。
權利要求
一種在靶組織中上調成纖維細胞生長因子 2(FGF 2mRNA)的基因表達或FGF 2蛋白的產生的方法，所述方法包括產生至少一種頻率為大約60kHz的特異性和選擇性信號，所述信號當施加於相對於所述靶組織可操作放置的電極、一個或多個線圈或其他場產生裝置時，導致在靶組織中產生了幅度為大約20到40mV/cm的電場和/或電磁場，當所述場施加於含有所述FGF 2的靶組織時，在所述靶組織中特異性和選擇性上調由mRNA所測量的FGF 2的基因表達和/或上調由mRNA所測量的FGF 2蛋白；以及將所述靶組織暴露於由在向所述電極、一個或多個線圈或其他場產生裝置施加50％到100％的預定佔空因數，每24小時時間內大約24小時的持續時間的所述至少一種特異性和選擇性信號後由所述電極、一個或多個線圈或其他場產生裝置產生的特異性和選擇性場，以便在所述靶組織中選擇性上調由mRNA所測量的FGF 2的基因表達和/或上調FGF 2蛋白。
2.權利要求1的方法，其中的產生步驟包含下述步驟選擇性改變施加的特異性和選 擇性信號的幅度、持續時間、佔空因數、頻率和波形，直到作為暴露於靶組織中得到的特異 性和選擇性場的結果，所述靶組織中由mRNA測量到的FGF-2的基因表達和/或所述靶組織 中的FGF-2蛋白顯著增加。
3.權利要求1的方法，其中的產生步驟包含產生具有正弦波形態的電信號的步驟，其 中在靶組織中得到的特異性和選擇性場具有大約20到40mV/cm的幅度。
4.權利要求1的方法，其中所述的產生步驟包含在遠程源處產生特異性和選擇性信號 的步驟，並且所述的暴露步驟包含向靶骨組織施加特異性和選擇性場的步驟。
5.權利要求4的方法，其中的暴露步驟包含通過電容耦合或電感耦合向靶骨組織施加 特異性和選擇性場的步驟，所述場在靶組織中在向電極、一個或多個線圈或其他場產生裝 置施加所述至少一種特異性和選擇性信號後由所述電極、一個或多個線圈或其他場產生裝 置產生。
6.權利要求5的方法，其中施加於所述電極的特異性和選擇性信號導致電極產生電容 耦合電場，施加於所述一個或多個線圈的特異性和選擇性信號導致所述一個或多個線圈產 生電磁場或複合場。
7.一種方法，所述方法用於治療病症，所述病症包括骨質疏鬆症、骨質減少、骨壞死、新 骨折、骨折風險、骨不連合、骨缺損、脊柱融合，以及作為一種或任一所述病症的治療中的輔 助手段，以便為其中在患者中涉及到FGF-2mRNA和/或FGF-2蛋白的病症增加骨形成，所述 方法包括產生至少一種頻率為大約60kHz的特異性和選擇性信號，所述信號當施加於相對於所 述靶組織可操作放置的電極、一個或多個線圈或其他場產生裝置時，導致在靶組織中產生 幅度為大約20到40mV/cm的電場和/或電磁場，當所述場施加於含有所述FGF-2的靶組織 時，在靶組織中特異性和選擇性上調由mRNA所測量的FGF-2的基因表達和/或上調由mRNA 所測量的FGF-2蛋白；以及將所述靶組織暴露於在向所述電極、一個或多個線圈或其他場產生裝置施加50 %到 100%的預定佔空因數，每24小時時間內大約24小時的持續時間的所述至少一種特異性和 選擇性信號後由所述電極、一個或多個線圈或其他場產生裝置產生的特異性和選擇性場，以便在所述靶組織中選擇性上調由mRNA所測量的FGF-2的基因表達和/或上調FGF-2蛋白。
8.權利要求7的方法，其中的暴露步驟包含將特異性和選擇性場與靶組織電容耦合或 電感耦合的步驟。
9.權利要求7的方法，其中的暴露步驟包含向靶組織施加電磁場或複合場的步驟。
10.權利要求7的方法，其中的產生步驟包含產生具有正弦波形態的電信號的步驟，由 此在靶組織中得到的特異性和選擇性場具有大約20到40mV/cm的幅度。
11.權利要求7的方法，其中的產生步驟包含下述步驟從任何電信號開始，所述電信 號當施加於所述電極、一個或多個線圈或其他場產生裝置時產生已知或據認為對活細胞有 效的電場和/或電磁場，對場刺激的持續時間執行第一個劑量響應曲線以確定最適持續時 間；使用前面發現的最適持續時間，對施加的電信號的幅度執行第二個劑量響應曲線以確 定最適幅度；保持前面發現的最適持續時間和最適幅度，對施加的電信號的頻率執行第三 個劑量響應曲線以確定最適頻率；改變施加的電信號的佔空因數並保持前面發現的最適 持續時間、幅度和頻率執行第四個劑量響應曲線，以確定最適佔空因數，以及保持最適持續 時間、幅度、頻率和佔空因數恆定，同時改變波形，直到在組織中發現上調由mRNA所測量的 FGF-2的基因表達和上調FGF-2蛋白的最適波形。
12.—種治療裝置，用於在骨質疏鬆症、骨質減少、骨壞死、新骨折、骨折風險、骨不連 合、骨缺損、脊柱融合中增加骨形成，並在骨質疏鬆症、骨質減少、骨壞死、新骨折、骨折風 險、骨不連合、骨缺損、脊柱融合和/或其中在患者中涉及到FGF-2mRNA和/或FGF-2蛋白 的其他病症的治療中用作輔助手段，所述裝置包含信號源，該信號源產生至少一種頻率為大約60kHz的特異性和選擇性信號，所述信號 源以50%到100%的預定佔空因數，每24小時時間大約24小時的持續時間，控制並改變施 加所述至少一種特異性和選擇性信號的持續時間；以及電極、一個或多個線圈或其他場產生裝置，所述電極、一個或多個線圈或其他場產生裝 置與信號源相連以便接收所述至少一種特異性和選擇性信號，並相對於靶組織可操作地放 置，所述電極、一個或多個線圈或其他場產生裝置在接受所述至少一種特異性和選擇性信 號後，導致在靶組織中產生幅度為大約20到40mV/cm的特異性和選擇性電場和/或電磁 場，當所述場施加於含有所述FGF-2的靶組織時，所述場特異性和選擇性上調靶組織中由 mRNA所測量的FGF-2的基因表達和/或上調靶組織中由mRNA所測量的FGF-2蛋白。
13.權利要求12的裝置，還包含驅動所述信號源的可攜式動力單元。
14.權利要求12的裝置，還包含用於將場產生裝置附著於患者靶骨組織附近的身體上 的機構。
15.權利要求12的裝置，還包含用於將信號源附著於患者身體上的機構。
16.權利要求12的裝置，其中通過將所述至少一種特異性和選擇性信號施加於電極、 線圈或其他場產生裝置而產生的場，通過電容耦合或電感耦合施加到所述靶組織上。
17.權利要求16的裝置，其中特異性和選擇性信號具有正弦波形態。
18.一種方法，用於在患有病症的患者中增加骨形成，所述病症包括骨質疏鬆症、骨質 減少、骨壞死、新骨折、骨折風險、骨不連合、骨缺損、脊柱融合，並在一種或任一種其中在患 者中涉及到FGF-2蛋白的這樣的病症的治療中用作輔助手段，所述方法包含將靶骨組織暴露於由權利要求12的裝置產生的特異性和選擇性場，以便在靶骨組織中上調由測量mRNA 所確定的FGF-2的基因表達並在靶骨組織中增加FGF-2蛋白的步驟。
19.一種確定特異性和選擇性信號的方法，所述信號當施加於電極、一個或多個線圈 或其他場產生裝置時，導致在靶組織中產生了場，所述場在靶組織中上調FGF-2mRNA和 FGF-2蛋白，所述方法包括下列步驟從具有信號形狀和頻率的起始電信號開始，所述電信 號當施加於所述電極、一個或多個線圈或其他場產生裝置時產生已知或據認為影響細胞的 FGF-2mRNA和/或FGF-2蛋白產生的電場和/或電磁場；選擇性改變施加所述起始信號的 持續時間，直到發現提供FGF-2mRNA和/或FGF-2蛋白產生的最顯著增加的持續時間；選擇 性改變起始信號的幅度，直到發現提供FGF-2mRNA和/或FGF-2蛋白產生的最顯著增加的 幅度；選擇性改變起始信號的佔空因數，直到發現提供FGF-2mRNA和/或FGF-2蛋白產生的 最顯著增加的佔空因數；以及選擇性改變信號佔空因數的接通斷開間隔時間，直到發現提 供FGF-2mRNA和/或FGF-2蛋白產生的最顯著增加的接通斷開間隔時間。
20.權利要求19中的方法，還包含下列步驟選擇性改變所述起始信號的頻率和波形， 保持其他信號特徵恆定，直到發現FGF-2mRNA和/或FGF-2蛋白產生的最顯著增加。
全文摘要
本發明描述了方法和裝置，所述方法和裝置通過將特異性和選擇性電場和/或電磁場與骨細胞或其他組織電容耦合或電感耦合，用於調控骨細胞和其他組織中的成纖維細胞生長因子-2mRNA和/或FGF-2蛋白，以便促進患病或受傷的骨和其他組織的治療，其中特異性和選擇性場是通過向相對於骨細胞或其他組織放置的電極或一個或多個線圈或其他場產生裝置施加特異性和選擇性信號來產生的。基因表達是指人類基因組(DNA)的特定部分(基因)轉錄成mRNA並隨後翻譯成蛋白這個過程的上調或下調。本發明提供了用於定向治療受傷或患病的骨和其他組織的方法和裝置，包括產生特異性和選擇性信號，所述信號在靶組織中產生了優化過以增加FGF-2蛋白基因的表達的電場和/或電磁場，以及將骨和其他組織暴露於由特異性和選擇性信號所產生的場，以便在該組織中調控FGF-2蛋白基因的表達。得到的方法和裝置可用於定向治療骨質疏鬆症、骨質減少、骨壞死、新骨折、骨折風險、骨不連合、骨缺損、脊柱融合，和/或其中涉及FGF-2蛋白的其他病症。
文檔編號C12M3/00GK101939409SQ200980104589
公開日2011年1月5日 申請日期2009年2月3日 優先權日2008年2月8日
發明者卡爾·T·布萊頓 申請人:賓夕法尼亞大學理事會