一種微生物酶法生產纖維低聚糖新工藝的製作方法

2023-05-06 08:59:16

專利名稱：：一種微生物酶法生產纖維低聚糖新工藝的製作方法
技術領域：
：本發明屬生物化學中的微生物酶解製糖
技術領域：
，具體涉及纖維素廢棄物原料經微生物分泌的酶生物降解後，製備功能性食品或飼料添加劑一纖維低聚糖的技術。二
背景技術：
：低聚糖，是由210個單糖通過糖苷鍵連接而成的低聚合度糖類。低聚糖分普通低聚糖和功能性低聚糖兩類，功能性低聚糖是指具有特殊的生物學功能，尤其能夠顯著促進人或動物腸道內雙歧桿菌增殖，有益於人或動物健康的一類低聚糖，即所謂的雙歧因子。除了能夠促進腸道內雙歧桿菌等有益菌特異性增殖外，功能性低聚糖另一個重要的生物學功能是剌激人或動物體內的免疫系統，從而提高人或動物體的免疫力。功能性低聚糖主要作為添加劑應用於食品或飼料領域，近年來，隨著人們對自身健康和動物食品安全的關注，功能性低聚糖類食品或飼料添加劑的開發和應用越來越受到重視。功能性低聚糖的種類很多，目前進入商業化的品種主要包括低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚殼聚糖、大豆低聚糖、帕拉金糖、低聚木糖等。纖維低聚糖是由2IO個葡萄糖通過|3_1，4-糖苷鍵結合而成的低聚合度糖類，是功能性低聚糖的一種。纖維低聚糖主要通過水解纖維質原料中的纖維素製備得到。纖維質原料的水解主要有兩種方法(1)化學降解法，包括濃酸法和稀酸法；(2)酶降解法。濃酸催化水解幾乎不產生副產物，但是酸消耗大，產物提取費用高，環境汙染大。稀酸水解反應速度不易控制，而且能引起糖的分解和縮合反應，導致純度和得率下降。同時酸水解對設備和技術的要求都比較高。而酶水解法可克服上述缺點。酶降解法具有轉化率高、專一性強、不會對環境造成汙染，並且還具有條件溫和、操作簡單等特點，工業應用前景廣闊。纖維素酶是一種降解纖維素成葡萄糖的複合酶系，該複合酶系主要包括內切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和P-葡萄糖苷酶。纖維素是在這三種酶組分的協同作用下徹底水解成葡萄糖的。纖維素酶水解纖維素成葡萄糖普遍公認的機理為內切葡聚糖酶首先作用於長鏈纖維素的無定形區，隨機切斷纖維素分子鏈中的P-l，4-糖苷鍵，生成不溶的短鏈纖維素和可溶的纖維低聚糖；隨後外切葡聚糖酶主要作用於內切葡聚糖作用於纖維素生成的產物短鏈纖維素和可溶性纖維低聚糖的非還原末端，釋放纖維二糖，部分微生物來源的外切葡聚糖酶也能對纖維素的還原末端有一定的進攻生成纖維二糖；最後可溶的纖維低聚糖尤其是纖維二糖在P-葡萄糖苷酶的作用下被徹底水解成葡萄糖。從纖維素水解機理可看出，纖維低聚糖是纖維素水解成葡萄糖過程的中間產物，因此控制水解過程中中間產物纖維低聚糖的累積，是獲得高得率纖維低聚糖的關鍵。從纖維素水解協同機理不難看出，如果纖維素酶系中P-葡萄糖苷酶的量越低，則纖維素水解過程中中間產物纖維低聚糖進一步水解成葡萄糖的量則越少，纖維素水解成纖維低聚糖的得率就越高，產品中無生理活性的單糖葡萄糖的比例就越少。大多數有工業應用潛力的、能合成纖維素酶的微生物，其分泌的纖維素酶系中都含有一定數量的P-葡萄糖苷酶。而纖維低聚糖的製備，對纖維素酶的要求是其P-葡萄3糖苷酶含量(或活力)越低越好，即要求是低P-葡萄糖苷酶活力的纖維素酶。為了在微生物酶法製備纖維低聚糖的工藝中，儘可能地降低P-葡萄糖苷酶的活力，國內外主要採取以下途徑開展研究並取得了一定的進展(1)採用物理、化學誘變或基因工程的方法改造微生物，以期獲得新的突變株或工程菌，它們可以分泌低P_葡萄糖苷酶含量的纖維素酶系；(2)通過調控發酵的手段改變微生物的培養條件，以降低微生物對13-葡萄糖苷酶的分泌；(3)採用親和層析的方法將纖維素酶系中的P-葡萄糖苷酶分離除去，該法成本高，只適合於實驗室研究，工業應用前景不大。
發明內容本技術的發明目的是針對一般的真菌木黴(Trichoderma)和麴黴(Aspergillus)分泌的纖維素酶在製備纖維低聚糖時的不足，尋找一種微生物酶法生產纖維低聚糖的新工藝。研究發現，不同聚合度的葡聚糖分子對纖維素酶系中內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和P-葡萄糖苷酶的親和作用不同。長鏈纖維素和不溶性短鏈纖維素對內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的親和力強，而對P-葡萄糖苷酶的親和力弱。在纖維質原料和纖維素酶的混合體系中，如果控制適當的吸附條件，則可控制纖維素酶組分中內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和P-葡萄糖苷酶在底物纖維素上的吸附行為。內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶主要吸附在底物纖維素上，13-葡萄糖苷酶由於與纖維素的親和力弱，主要溶解在液相中。如果能夠選擇在適當的時候進行固液分離，將溶解在液相中的P-葡萄糖苷酶除去，即可實現纖維素酶系中大量P-葡萄糖苷酶的拆分。將固液分離後獲得的固體渣繼續水解，即可實現高效、優質生產功能性纖維低聚糖的目標。本發明的技術解決方案為一種微生物酶法生產纖維低聚糖新工藝，以經過預處理的纖維素為原料、真菌纖維素酶為初始酶製劑，其特徵如下a.底物原位吸附一將纖維素原料與真菌纖維素酶混合，加入水，pH緩衝液或酸、鹼，混合至固液重量比為l:750，pH值為68，每克纖維素的纖維素酶用量為525FPIU/g，於525t:條件下搖或機械攪拌1060min;b.固液分離拆分，棄去上清液；c.定向水解一在上述固液分離得到的渣中補加水，pH緩衝液或酸、鹼，控制固液重量比為1:750，pH值為46，在4555°C的條件下搖或機械攪拌1236h;將定向水解物再次進行固液分離，所獲得的上清液即為葡萄糖含量低的纖維低聚糖溶液。上述方法中，纖維素原料可以是木聚糖生產廢渣、低聚木糖生產廢渣、木糖渣、糠醛渣，或經過適當預處理的其他纖維質原料。預處理的目的是提高纖維質原料中纖維素對纖維素酶的可及度，可以採用物理、化學、生物或以上幾種方法聯合應用的預處理方法。真菌纖維素酶是裡氏木黴(Trichodermareesei)或黑麴黴(Aspergillusniger)、綠色木黴(Trichodermaviride)、康氏木黴(Trichodermakoningii)分泌的纖維素酶。所使用的pH緩衝液或酸、鹼，可以是磷酸/磷酸鈉緩衝液、醋酸/醋酸鈉緩衝液、檸檬酸/檸檬酸鈉緩衝液或硫酸，氫氧化鈉、氫氧化鉀，。固液分離可以採用離心法或板框過濾法等。本發明的有益效果採用底物原位吸附-固液分離拆分纖維素酶系中的P-葡萄糖苷酶以後，由於水解體系中的P_葡萄糖苷酶大大降低，降解纖維素成纖維低聚糖的選擇性大大增加，從而提高了纖維素降解成纖維低聚糖的得率和降解產物中纖維低聚糖的含量，降低了產物中無生理活性的單糖葡萄糖的含量。採用纖維素"底物原位吸附-固液分離拆分-定向水解"法酶解製備纖維低聚糖，與未拆分處理的普通纖維素酶解工藝相比，水解產物中纖維低聚糖佔總糖的百分數可以提高1倍左右。為微生物酶法纖維低聚糖製備工藝提供了一個低成本的新途徑。四圖1為溫度對底物吸附內切葡聚糖酶和13-葡萄糖苷酶的影響曲線，其實驗條件為底物濃度固液比1:20，酶用量15FPIU/g纖維素，pH值4.8，吸附時間2h;圖2為pH值對底物吸附內切葡聚糖酶和13-葡萄糖苷酶的影響曲線，其實驗條件為底物濃度固液比1:20，酶用量15FPIU/g纖維素，溫度l(TC，吸附時間2h;圖3為吸附時間對底物吸附內切葡聚糖酶和P-葡萄糖苷酶的影響曲線，其實驗條件為底物濃度固液比l:20，酶用量15FPIU/g纖維素，溫度1(TC，pH值7.0。五具體實施例方式實施例提及的產纖維素酶微生物及由產纖維素酶微生物發酵製備纖維素酶的方法均為本領域技術人員公知的技術。實施例1:用裡氏木黴製備獲取纖維素酶1.裡氏木黴(T.reesei)菌絲體培養基成分(g/L):葡萄糖10.0;蛋白腖1.0;硫酸銨1.4;尿素0.3;磷酸二氫鉀2.0;無水氯化鈣0.3;七水硫酸鎂0.3;七水硫酸亞鐵0.005;七水硫酸錳0.0016;七水硫酸鋅0.0014;氯化鈷0.002。培養基用0.05mol/L的檸檬酸鈉緩衝液調節pH值4.8。2.裡氏木黴纖維素酶合成培養基成分(g/L):葡萄糖1.0;紙漿10.0;蛋白腖1.0;硫酸銨1.4;尿素0.3;磷酸二氫鉀2.0;無水氯化鈣0.3;七水硫酸鎂0.3;七水硫酸亞鐵0.005;七水硫酸錳0.0016;七水硫酸鋅0.0014;氯化鈷0.002。培養基用0.05mol/L的檸檬酸鈉緩衝液調節pH值4.8。3.裡氏木黴菌絲體的培養50ml菌絲體培養基置於250ml三角瓶中，於121。C下滅菌30min，冷卻至室溫，接入適量保藏於試管斜面的裡氏木黴孢子，搖瓶置於恆溫搖床中於30±1°C、170轉/分條件下培養36h後備用。4.裡氏木黴纖維素酶的製備培養基於12rC下滅菌30min，冷卻至室溫，接入上述培養36h的裡氏木黴菌絲體，置於恆溫搖床中於170轉/分條件下培養，培養溫度第一天控制在30±rc，以後控制在28±rc。5.培養4天，用離心機在3000轉/分條件下離心10min將培養液中的固體物質(菌體和未被利用的紙漿纖維)分離除去，即得纖維素酶液。5濾紙酶活力的測定採用國際理論和應用化學協會(IUPAC)推薦的標準方法測定。實驗條件底物Whatman濾紙50mg，加入適當稀釋倍數的酶液和緩衝液，使反應體系pH值為4.8，於5(TC、振蕩頻率80次/分的往復式恆溫振蕩器中反應60min，測定反應生成的葡萄糖量。一個濾紙酶活力的單位(FPIU)定義為標準反應條件下每分鐘生成lymol葡萄糖的酶量。內切葡聚糖酶活力的測定內切葡聚糖酶活力通常用羧甲基纖維素酶活力表示。實驗條件底物1%(w/v)的羧甲基纖維素懸浮液，加入適當稀釋倍數的酶液和緩衝液，使反應體系pH值為4.8，於50°C、振蕩頻率80次/分的往復式恆溫振蕩器中反應30min，測定反應生成的葡萄糖量。一個羧甲基纖維素酶活力的單位(IU)定義為標準反應條件下每分鐘生成lymol葡萄糖的酶量。|3-葡萄糖苷酶活力的測定採用對硝基苯基-13-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物測定。0.lml適當稀釋的酶液與0.9ml5mmol/L的pNPG溶液(由0.05mol/L、pH值為4.8的檸檬酸_磷酸氫二鈉緩衝液配製)混合後，於50°C、振蕩頻率80次/分的往復式恆溫振蕩器中反應10min後立即加入2mllmol/L的Na2C03溶液終止反應，再加入10ml蒸餾水，搖勻。於400nm下測定吸光度。以0.lml蒸餾水代替酶液作空白對照。每個樣品做23個平行樣，取平均值。一個e-葡萄糖苷酶活力單位(IU)定義為標準反應條件下每分鐘生成1Pmol對硝基苯酚所需的酶量。結果表明，裡氏木黴以紙漿為碳源合成纖維素酶，培養4天，濾紙酶活力為2.57FPIU/ml，羧甲基纖維素酶活力為3.42IU/ml，P-葡萄糖苷酶活力為1.09IU/ml。也可以用黑麴黴(A.niger)或綠色木黴(T.viride)、康氏木黴(T.koningii)採用相似的方法製備獲取纖維素酶。實施例2:纖維素原料的獲取玉米芯提取木聚糖後的殘渣，主要成分為纖維素，其含量為79.21%(幹基)，水分含量為59.92%，是一種很好的纖維素資源。同時，玉米芯鹼抽提木聚糖的過程實際上也是一個纖維質原料鹼預處理的過程。因此，玉米芯經鹼抽提後，無需再預處理就可以作為纖維低聚糖生產的原料，直接進行纖維素酶的水解。其原料的獲取過程如下1.稱取50gNaOH充分溶解於702ml蒸餾水中，加入粉碎粒度為0.5-lcm的風乾玉米芯112g(絕幹100g)，於9(TC下反應3h。2.上述反應物真空抽濾除去木聚糖抽提液，用500ml水抽濾洗滌，棄去洗滌液。3.上述濾渣中加入300ml蒸餾水，用40%(w/v)的硫酸中和至pH值6_7，真空抽濾，並用900ml蒸餾水分3次洗滌、抽濾，得到木聚糖生產廢渣。該木聚糖生產廢渣就是本技術所需要的纖維低聚糖生產原料；也可以用其他低聚木糖生產廢渣、木糖渣、糠醛渣，或經過適當預處理的其他纖維質原料；預處理的目的是提高纖維質原料中纖維素對纖維素酶的可及度，可以採用物理、化學、生物或以上幾種方法聯合應用的預處理方法。實施例3:吸附條件對纖維素原料吸附纖維素酶系中內切葡聚糖酶和13-葡萄糖苷酶的影響1.分別稱取實施例2的木聚糖生產廢渣6.31g(絕乾重2.53g，其中纖維素2.Og，水分3.78g)於250ml三角瓶中，加入纖維素酶液11.67ml(酶加量15FPIU/g纖維素)，加入緩衝液和蒸餾水，控制吸附體系水分體積為40ml、pH38，置於150轉/分的搖床中於pH值38、溫度105(TC條件下吸附0.256h。2.吸附結束後，於3000轉/分下離心10min，得到上清液，測定液相中羧甲基纖維素酶活力和P-葡萄糖苷酶活力，計算木聚糖生產廢渣對內切葡聚糖和P-葡萄糖苷酶活力的吸附率。吸附溫度、PH值和吸附時間對吸附率的影響結果如附圖13。底物木聚糖生產廢渣對內切葡聚糖和13-葡萄糖苷酶的吸附率計算方法為吸附率(％)=[(初始酶活力-吸附體系液相中酶活力)/初始酶活力]X100其中初始酶活力、吸附體系液相中酶活力以含有的總活力表示，單位IU。附圖13表明，木聚糖生產廢渣對纖維素酶系中的內切葡聚糖酶和P-葡萄糖苷酶的吸附作用受吸附條件(溫度、PH值、時間)影響很大。以對內切葡聚糖酶吸附率最大而對P-葡萄糖苷酶吸附率最小為考察指標，最適宜的吸附條件為溫度1(TC、pH值7.0、吸附時間30min.。在此條件下，木聚糖生產廢渣對內切葡聚糖酶和P-葡萄糖苷酶的吸附率分別為83.14%和9.36%。吸附後固液分離，大量P-葡萄糖苷酶可隨液體的分離而除去。底物對纖維素酶系中內切葡聚糖酶和13-葡萄糖苷酶的吸附情況(以底物對酶的吸附率表示)如表l。表1纖維素底物對纖維素酶系中內切葡聚糖酶和P-葡萄糖苷酶的吸附tableseeoriginaldocumentpage7當採用其它纖維素原料，如低聚木糖生產廢渣、木糖渣、糠醛渣，或經過適當預處理的其他纖維質原料時，吸附效果基本相同。實施例4:木聚糖生產廢渣"底物原位吸附_固液分離拆分_定向水解"法製備纖維低聚糖1.底物原位吸附一稱取實施例2的木聚糖生產廢渣31.55g(絕乾重12.65g，其中纖維素10.Og，水分18.9g)於500ml三角瓶中，加入纖維素酶液58.37ml(酶加量15FPIU/g纖維素)，加入蒸餾水102.73ml，加入Na2HP04-檸檬酸緩衝液濃液20ml(稀釋10倍後pH值7.0)，使吸附體系pH值為7.0。置於1(TC、150轉/分的搖床中吸附30min。2.固液分離拆分一上述體系吸附完成後，於3000轉/分下離心10min，得到上清液124.5ml，棄去。3.定向水解一取上述離心分離後的沉澱物，加入蒸餾水114.5ml、lmol/L檸檬酸緩衝液10ml，充分混合，使反應體系pH值為4.8。置於50°C、150轉/分的搖床中水解24h，水解結束後水解物於3000轉/分條件下離心10min，得到的清液即為纖維低聚糖水解糖液。實驗結果如表2。纖維低聚糖水解糖液中葡萄糖濃度採用高效液相色譜法(HPLC)測定。色譜條件如下色譜儀AgillentllOO高效液相色譜儀；色譜柱Bio-RadAminexHPX-87H;流動相0.005mol/L硫酸，流速0.6ml/min;柱溫:55。C;檢測器示差折光檢測器；進樣量:10yL。外標法測定。纖維低聚糖水解糖液中纖維低聚糖濃度測定方法用4%(w/v)的硫酸於12rC條件下水解纖維低聚糖水解糖液60min，使糖液中的纖維低聚糖水解成葡萄糖，用HPLC法測定經稀硫酸水解後的葡萄糖濃度；用纖維低聚糖經稀硫酸水解後的葡萄糖濃度減去糖液中初始葡萄糖濃度之差除以1.l(纖維低聚糖與單糖葡萄糖之間的轉換係數)即可得到纖維低聚糖的濃度。纖維低聚糖佔總糖百分率指纖維低聚糖水解糖液中纖維低聚糖量除以纖維低聚糖和葡萄糖量之和。本例中所使用的pH緩衝液可以是磷酸/磷酸鈉緩衝液、醋酸/醋酸鈉緩衝液、檸檬酸/檸檬酸鈉緩衝液等。酸是硫酸，鹼是氫氧化鈉或氫氧化鉀。比較例未經過底物原位吸附_固液分離拆分13-葡萄糖苷酶的纖維素酶水解木聚糖生產廢渣製備纖維低聚糖直接使用實施例1中用裡氏木黴製備獲取的纖維素酶水解纖維素原料製備纖維低聚糖。實驗方法如下稱取實施例2的木聚糖生產廢渣31.55g(絕乾重12.65g，其中纖維素10.Og，水分18.9g)於500ml三角瓶中，加入纖維素酶液58.37ml(酶加量15FPIU/g纖維素)，加入蒸餾水112.73ml、lmol/L檸檬酸緩衝液10ml，充分混合，使反應體系pH值為4.8。置於50°C、150轉/分的搖床中水解24h，水解結束後反應物於3000轉/分條件下離心10min，得到的清液即為纖維低聚糖水解糖液。實驗結果如表2。表2纖維素酶經"底物原位吸附_固液分離"拆分前後的酶水解效果比較纖維素酶液10g纖維素纖維低聚糖(g)葡萄糖(g)纖維低聚糖佔總糖百分數(％)對應實驗底物原位吸附一固液分離拆分的纖維素酶液2.531.8657.63實施例4未拆分處理的纖維素酶液1.503.9427.58比較例結果表明經底物原位吸附-固液分離法拆分P-葡萄糖苷酶以後獲得的低P-葡萄糖苷酶活力纖維素酶，降解纖維素成纖維低聚糖的選擇性大大增加。與未拆分處理的原纖維素酶液相比，水解產物中纖維低聚糖的比例從拆分前的27.58%提高到57.63%。8權利要求一種微生物酶法生產纖維低聚糖新工藝，以經過預處理的纖維素為原料、真菌纖維素酶為初始酶製劑，其特徵如下a.底物原位吸附——將纖維素原料與真菌纖維素酶混合，加入水，pH緩衝液或酸、鹼，混合至固液重量比為1∶7～50，pH值為6～8，每克纖維素的纖維素酶用量為5～25FPIU/g，於5～25℃條件下搖或機械攪拌10～60min；b.固液分離拆分，棄去上清液；c.定向水解——在上述固液分離得到的渣中補加水，pH緩衝液或酸、鹼，控制固液重量比為1∶7～50，pH值為4～6，在45～55℃的條件下搖或機械攪拌12～36h；將定向水解物再次進行固液分離，所獲得的上清液即為葡萄糖含量低的纖維低聚糖溶液。2.如權利要求1所述的微生物酶法生產纖維低聚糖工藝，其特徵是纖維素原料是木聚糖生產廢渣或低聚木糖生產廢渣、木糖渣、糠醛渣，或經過預處理的其他纖維質原料。3.如權利要求1所述的微生物酶法生產纖維低聚糖工藝，其特徵是真菌纖維素酶是裡氏木黴(T.reesei)或黑麴黴(A.niger)、綠色木黴(T.viride)、康氏木黴(T.koningii)分泌的纖維素酶。4.如權利要求1所述的微生物酶法生產纖維低聚糖工藝，其特徵是固液分離採用離心法或板框過濾法。全文摘要一種微生物酶法生產纖維低聚糖工藝，以經過預處理的纖維素為原料、真菌纖維素酶為初始酶製劑，採用纖維素「底物原位吸附-固液分離拆分-定向水解」法酶解製備纖維低聚糖，由於拆分去除了纖維素酶系中大量的β-葡萄糖苷酶，水解體系中的β-葡萄糖苷酶含量大大降低，提高了纖維低聚糖的得率，降低了產品中無生理活性的單糖葡萄糖含量。與未拆分處理的普通纖維素酶解工藝相比，水解產物中纖維低聚糖佔總糖的百分數可以提高1倍左右，為微生物酶法纖維低聚糖製備工藝提供了一個低成本的新途徑。文檔編號C12R1/885GK101693910SQ200910035998公開日2010年4月14日申請日期2009年10月15日優先權日2009年10月15日公開號200910035998.8發明者餘世袁,勇強,徐勇,王瑱瑱,黃晶申請人:南京林業大學;