用於克隆技術的細胞核物質獲取法的製作方法
2023-05-06 16:12:21
專利名稱：用於克隆技術的細胞核物質獲取法的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及轉移細胞遺傳物質的方法，更具體地涉及一種獲取細胞核物質的方法。
背景技術：
細胞核物質作為遺傳物質決定著生物的遺傳特性，而細胞核是遺傳物質的主要聚集場所。原核期胚胎具有完整核膜包被的清晰原核，可以在不需要任何輔助設備和試劑的情況下用倒置顯微鏡準確的觀察，這為精確的獲取並轉移遺傳物質提供了必要的前提條件。作為治療由於細胞質遺傳(主要是線粒體遺傳物質缺陷)導致無法獲得健康後代的潛在手段，原核轉移(pronuclear transfer)正受到越來越大的重視。目前所用的原核獲取方式主要為活檢針吸取胞質法，即用活檢針吸取原核附近的胞質，最終使得原核連帶部分細胞膜及細胞質形成一個新的核質體。但該方法存在一些以下缺點1、將新的核質體轉移至新的受體胞質體時必須要藉助於電融合或其他融合方式；2、原核和容易在吸取過程中受到胞質的擠壓而破裂，這在將來的臨床應用中是不能接受的；3、不可避免的帶進部分供體細胞質，如這部分供體缺陷細胞質在新組成的胚胎中期主導作用，那麼將失去原核轉移的
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發明內容
針對上述現有技術的不足，本發明提供了一種方便、快捷以及精確獲取細胞核物質的方法。本發明所述的細胞核獲取的方法，包含如下步驟(1)用頻率為1. 0-1. 8ms的雷射在細胞卵周隙較大的透明帶部分打直徑12_30 μ m 的孔；(2)用外徑100 120 μ m、內徑15 30 μ m的持卵針固定住細胞，使透明帶開口端位於與持卵針相對的位置，以方便進行後續操作；(3)用事先吸一定量液體、內徑8-50 μ m的注射針從透明帶開口處扎入胞漿中，並避免直接接觸到核物質，所述液體量可以是0. 05μ 1 1μ 1 ；(4)迅速增加注射針中的正壓使針中的液體向外快速流動，以衝斷核物質與胞漿之間的連接，使核物質周圍無任何胞質部分，並利用整個細胞內正壓的提高來使得核物質完整的從透明帶開口處被壓離細胞；(5)用注射針收集分離的核物質。其中，所述細胞可以是受精卵細胞或卵母細胞。其中，步驟(3) (4)中所述的液體可以用各種細胞培養液、操作液或其他與細胞等滲的液體，如mHTF、GMOPS, G-IVF或Gl. 5培養液等等，優選地所述液體中含有5% HSA。其中，步驟(3) (5)中所述的核物質可為原核、GV期卵母細胞的GV泡或其它由完整膜包被的胞內物質。
其中，步驟(3) (5)所述的注射針的內徑優選ΙΟμπι。其中，步驟⑵所述的持卵針開口可為斜口或平口，優選經過拔尖的斜口。利用本發明所述的方法進行細胞核移植同當前的顯微操作核移植方法相比，具有明顯的優越性(1)不需要特殊的設備，只需要一般的倒置顯微鏡及顯微操縱儀就可以進行，操作簡便，便於廣泛推廣使用；(2)可以將核物質完整的與胞漿分離；(3)核物質轉移過程中不會由於擠壓而使核物質破裂；(4)所獲得的核物質不帶有任何細胞質與細胞膜；(5)在核物質的再次轉移至受體胞質的過程中不需要經過電融合步驟。
圖1 用雷射在胚胎或卵母細胞卵周隙較大的透明帶部分打孔，並使透明帶開口端位於與持卵針相對的位置；其中，1為雷射所打的孔。圖2 注射針從透明帶開口處扎入胞漿中，並避免直接接觸到核物質；其中，2是注射針，3是核物質。圖3 核物質完整的被壓離卵母細胞；其中，4是核物質。圖4 用注射針收集分離的核物質；其中，5是核物質。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明實施例1(1)用雷射在原核期受精卵周隙較大的透明帶部分打直徑20 μ m的孔，雷射頻率為 1. Oms ；(2)如圖1所示，用外徑120μπι，內徑25μπι的持卵針固定住受精卵，使透明帶開口端位於與持卵針相對的位置，其中持卵針開口為斜口 ；(3)如圖2所示，用事先吸有0. 5 μ 1含5% HSA的GMPOS體外操作液、內徑10 μ m 的注射針從透明帶開口處扎入胞漿中，並避免直接接觸到原核；(4)如圖3所示，迅速增加注射針中的正壓使針中的液體向外快速流動，使注射針的液體快速的衝斷原核與胞漿之間的連接，並利用整個細胞內正壓的提高來使得原核完整的被壓離受精卵；(5)如圖4所示，用注射針收集分離的原核。實施例2(1)用雷射在GV期卵母細胞卵周隙較大的透明帶部分打直徑30 μ m的孔，雷射頻率為1. 8ms ；(2)用外徑120 μ m、內徑25 μ m的持卵針固定住卵母細胞，使透明帶開口端位於與持卵針相對的位置，其中持卵針開口為平口 ；(3)用事先吸有1 μ 1含5% HSA的Gl. 5培養液、內徑40 μ m的注射針從透明帶開口處扎入胞漿中，並避免直接接觸到GV泡；
(4)迅速增加注射針中的正壓使針中的液體向外快速流動，使注射針的液體快速的衝斷GV泡與胞漿之間的連接，並利用整個細胞內正壓的提高來使得GV泡完整的被壓離卵母細胞；(5)用注射針收集分離的GV泡。
權利要求
1.一種細胞核物質的獲取方法，包括以下步驟(1)用雷射在細胞卵周隙較大的透明帶部分打直徑12-30μ m的孔；(2)用外徑100 120μ m、內徑15 30 μ m的持卵針固定住細胞，使透明帶開口端位於與持卵針相對的位置；(3)用吸有0.05μ 1 1μ 1液體、內徑8-50μπι的注射針從透明帶開口處扎入胞漿中， 並避免直接接觸到核物質；(4)迅速增加注射針中的正壓使針中的液體向外快速流動，以衝斷核物質與胞漿之間的連接，使核物質周圍無任何胞質部分，並利用整個細胞內正壓的提高來使得核物質完整的從透明帶開口處被壓離細胞；(5)用注射針收集分離的核物質。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述細胞是受精卵細胞或卵母細胞。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述核物質是原核、GV期卵母細胞的GV 泡或其它由完整膜包被的胞內物質。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟C3) (4)中所述的液體是各種細胞培養液、操作液或其它與細胞等滲的液體。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述液體為mHTF、GMOPS,G-IVF或Gl. 5 培養液。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述液體中含有5%HSA。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟C3) ( 所述的注射針的內徑為 10 μ m。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的持卵針開口為斜口或平□。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述持卵針開口為經過拔尖的斜口。
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，雷射頻率為1.0 1. 8ms。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，涉及一種獲取細胞核物質的方法，包括步驟(1)用雷射在細胞卵周隙較大的透明帶部分打孔；(2)用持卵針固定住細胞，使透明帶開口端位於與持卵針相對的位置；(3)用吸有液體的注射針從透明帶開口處扎入胞漿中，並避免直接接觸到核物質；(4)迅速增加注射針中的正壓使針中的液體向外快速流動，以衝斷核物質與胞漿之間的連接，使核物質周圍無任何胞質部分，並利用整個細胞內正壓的提高來使得核物質完整的從透明帶開口處被壓離細胞；(5)用注射針收集分離的核物質。本發明的獲取核物質的方法不需要特殊儀器，可以方便簡單地分離核物質，避免核物質破裂，獲得的核物質便於進行細胞融合實驗。
文檔編號C12N15/873GK102399821SQ20101028147
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月13日 優先權日2010年9月13日
發明者吳克良, 陳子江, 馬金龍 申請人:山東大學, 山東山大附屬生殖醫院有限公司